由于前庭毛细胞位于颅骨最坚硬部分——岩骨颞骨的深处，其功能分析较为复杂。目前大多数毛细胞功能研究均采用急性分离的毛细胞。本文介绍一种用于膜片钳电生理记录和双光子显微成像研究的小鼠前庭上皮半完整制备方法。
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本文内容
摘要
摘要
了解前庭毛细胞在正常条件下的功能，以及创伤、疾病和衰老如何破坏这一功能，是开发预防性方法和/或新型治疗策略的关键步骤。然而，大多数关于异常前庭功能的研究并未在细胞水平上进行，而是主要集中于前庭功能障碍的行为学检测，例如步态分析和前庭-眼反射表现。尽管这些研究提供了有关功能异常时发生情况的宝贵数据，但对于功能障碍的根本原因所知甚少。在那些聚焦于前庭功能的细胞和亚细胞过程的研究中，多数依赖于急性分离的毛细胞，这些细胞缺乏其突触连接和支持细胞环境。因此，一个主要的技术挑战在于如何以生理上尽可能少受干扰的制备方式，接触到极为敏感的前庭毛细胞。本文中，我们展示了一种小鼠前庭感觉上皮的半完整制备方法，该方法保留了包括毛细胞与初级传入神经复合体在内的局部微环境。
引言
尽管前庭系统在我们的日常生活中起着重要作用，但目前对前庭功能随年龄增长而下降的相关机制仍缺乏清晰的认识。造成这一知识空白的原因之一在于，前庭功能的衰退几乎完全依赖行为学检测方法进行研究，例如前庭眼反射（VOR），该指标虽能精确反映前庭系统的外在功能，但难以揭示其内在组分的变化。这严重阻碍了我们对前庭毛细胞在健康、疾病或衰老状态下功能的理解。
尽管已有大量针对单个前庭毛细胞的研究，但主要局限在于依赖急性毛细胞制备方法，即通过机械和/或酶处理将毛细胞甚至杯状传入末梢从其正常环境中分离出来。这类方法不可避免地会破坏毛细胞与杯状末梢之间以及毛细胞与支持细胞之间的精细微结构。随着半完整制备技术1-5以及离体小鼠迷路制备方法6的发展，现在可以在更接近体内（in vivo）条件的情况下研究多种突触通讯形式。事实上，Lim et al.（2011）发现，与嵌在神经上皮中的毛细胞相比，急性分离的I型前庭毛细胞记录到的全细胞电流存在显著差异。具体而言，钾离子被认为会在毛细胞与杯状传入纤维之间的细胞间隙中积聚，从而显著改变毛细胞的反应7。若无此处所述的前庭感觉上皮半完整制备方法，此类信息将无法获得。我们展示了小鼠壶腹嵴的半完整制备方法3，并呈现了通过全细胞膜片钳电生理记录和双光子钙成像获得的代表性结果。
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方案
1. 动物
- 小鼠购自澳大利亚啮齿类动物中心（Australian Rodent Centre，ARC；澳大利亚珀斯），饲养于悉尼大学博世动物实验中心，采用标准的12小时光照/12小时黑暗循环，并提供环境丰富化设施。所述所有实验均经悉尼大学动物伦理委员会批准。
- 所有实验均使用雄性和雌性小鼠（C57/Bl6），因为该品系常被用作基因操作的背景品系，可视为相当于wildtype8-9。
2. 组织制备
- 配制 300 ml 甘油基人工脑脊液（ACSF），其成分如下（单位：mM）：26 NaHCO₃3，11 葡萄糖，250 甘油，2.5 KCl，1.2 NaH2PO4，1.2 MgCl2，以及 2.5 CaCl2. 在加入 CaCl₂ 之前2，用碳合气（95% O₂，5% CO₂）饱和溶液2 和5% CO2) 调节 pH 至 7.4，以避免钙沉淀（浑浊）。将溶液在 -80 °C 冷冻45分钟，直至形成冰浆。
- 使用氯胺酮（100 mg/kg）（Parnell，Alexandria，澳大利亚）通过腹腔注射使小鼠深度麻醉。
- 一旦后肢捏夹反射消失，使用锋利的不锈钢剪刀将小鼠断头，并用剃刀刀片（圆形#22）做矢状皮肤切口以暴露颅骨。从此时起至步骤2.3–2.8结束，应定期将冰冻的ACSF施加于组织上，以尽可能保持颅腔、脑组织及下方前庭器官的低温状态。
- 使用标准图案剪刀（FST，加拿大北温哥华）的尖头端，在颅骨的λ点处做一个小切口，并沿矢状缝剪开。此步骤中需确保脑组织不被剪刀刃拖拽。
- 使用浅弯型 Pearson 咬骨钳（FST）小心地将顶骨向侧方剥离，枕骨向后方剥离。
- 然后使用一把小型不锈钢刮勺，轻轻将脑组织从颅中窝和颅后窝表面抬起，并用精细虹膜剪在内耳与脑干之间的中点处切断暴露的前庭蜗神经（CNVIII）。切断该神经可最大限度减少初级传入神经元轴突及其与毛细胞连接所受的异常张力。
- 切断第八脑神经后，取出脑组织 整体上.
- 前庭迷路现清晰可见于颅中窝，耳蜗指向前内侧。用咬骨钳去除前庭迷路两侧的骨质，然后轻轻夹住前半规管并向外侧牵拉，将其完整摘除。
- 将切除的迷路组织浸入（图1) 置于含有冰冻且持续通气的ACSF（见2.1节）的解剖皿中。在体视显微镜下，用镊子夹住耳蜗，将迷路固定于皿底。用精细镊子刮除前半规管壶腹上方的骨组织。当骨壁上形成一个小孔后，开始将骨片从壶腹方向轻轻撬开。操作时需注意，切勿将镊子插入骨壁深处，以免损伤下方的膜性迷路及感觉上皮。继续此操作，直至前半规管和相邻的水平半规管的膜性管及壶腹均暴露清楚（图2).
图 1. 分离的小鼠前庭迷路。 A. 左图） 分离的小鼠前庭迷路示意图。图中标注了进入前庭感觉上皮、耳蜗、前半规管和水平半规管的重要解剖参考点。星号表示含有前庭感觉上皮的半规管壶腹。 B. 右图） 来自一只1月龄小鼠的分离前庭迷路的显微照片。
图 2. 膜性前庭迷路的暴露。 已刮除覆盖在前半规管和水平半规管壶腹上方的骨质，以显露呈黑褐色斑点状的膜性壶腹及其相关的壶腹神经（CNVIII）。下方面板中的示意图表示显微照片高亮区域内的结构，并显示了半规管管腔与壶腹以及 CNVIII 之间的关系。
- 使用精细镊子轻轻将壶腹及其相连的椭圆囊从骨迷路中提起，确保壶腹中央区域（含有感觉上皮）未受损伤。在某些情况下，可能需要用虹膜剪剪开膜性半规管的近端，以使壶腹完全脱离骨组织。
- 将包含两个壶腹和椭圆囊的结构转移至盛有Leibovitz's L-15培养基（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）的培养皿中。使用光纤光源对组织进行“背光”照明，以便清晰观察壶腹内含有感觉上皮的壶腹嵴结构。
- 用精细虹膜剪在椭圆囊斑驳的“顶壁”上小心剪开一个小口，然后沿前壶腹和水平壶腹的顶部继续剪开。切口应尽可能靠近感觉上皮边缘，但不得接触其表面（图3A）。确保感觉上皮表面无任何残留膜组织覆盖（图3B）。
- 将分离出的半完整标本转移至盛有L-15培养基的小型玻璃底记录室中，并使用固定在压扁的U形铂金丝上的细尼龙纤维网格压住标本（图3B）。理想情况下，网格的纤维不应覆盖感觉上皮；但在需要更高稳定性的情况下，可允许单根纤维横跨感觉上皮区域。
图3. 前庭感觉上皮的离体半完整制备。 A. 半完整制备及电极配置的示意图。覆盖在壶嵴上的壶腹已被“去顶”，以暴露感觉上皮表面（绿色）。B. 半完整“三联体”制备的显微照片，显示前壶嵴（ac）和水平壶嵴（hc）（utricle 被前壶嵴遮挡）。注意用于将制备固定在记录室底部的尼龙纤维。比例尺：100 μm。C. 位于单个前庭毛细胞上的记录电极。比例尺：15 μm。
3. 电生理学
- 用持续充氧的 L-15 培养基灌注半完整制备标本。培养基含有 pH 指示剂（酚红），在记录过程中应持续监测培养基的颜色。充氧后 pH 应为 7.3–7.4，对应呈红色。
- 使用微电极拉制仪（Narishige，日本，型号 PP-830）采用两步法（加热步骤 1：72；加热步骤 2：50）从 1.5 mm（内径 1.19 mm）硼硅酸盐玻璃毛细管制备记录电极，使其最终阻抗达到 3–4 MΩ。
- 用基于氟化钾的内液填充电极尖端后方 3–4 mm，内液成分（单位 mM）如下：110 KF、12 KCl、27 KOH、1 NaCl、10 HEPES、10 EGTA、1.8 MgCl2、3 D-葡萄糖和 2 Na-ATP；用 KOH 调节 pH 至 7.4。
- 用电极柄尽可能靠近尖端处缠绕 2–3 圈薄条状石蜡膜，以绝缘电极并降低电极电容。
- 在直立显微镜（Olympus BX51）下使用低倍物镜（5X）将电极置于感觉上皮上方。切换至高倍物镜（40X），并通过连接的 CCD 相机观察单个前庭毛细胞。
- 使用微操纵器（Sutter Instruments，加利福尼亚，美国）将电极定位在可见毛细胞的细胞膜上（图 3C）。形成吉欧姆封接后，通过电极夹上的吸力口施加少量负压以破裂细胞膜。
- 采用标准技术进行全细胞电压钳记录8–9。
4. 双光子显微镜
- 配制含有5 mM Oregon Green 488 BAPTA-1（OGB-1；六钾盐；Invitrogen，德国）的0.9%生理盐水溶液。
- 在仍处于浸没状态时，将“去顶”后的半完整三联体标本放置于一小块滤纸（4×4 mm，0.8 μm厚；Millipore，德国）上，确保感觉上皮从上方无遮挡。
- 将滤纸及标本转移至电穿孔仪的铂金底电极（7 μl）上，该电穿孔仪由脉冲发生器与宽带放大器组合而成，并在其上覆盖额外5 μl的合成钙离子荧光指示剂染料Oregon Green 488 BAPTA-1（5 mM）溶液（图4）。
图 4. 大体积电穿孔。 A. 电穿孔装置横截面的示意图。半完整制备物（*）置于浸有钙染料（Oregon Green 488 BAPTA-1）的滤纸上，并在两个铂电极之间施加电流。改编自 Briggman 和 Euler，201110。
- 将顶部铂电极平行于底部电极放置，间距约为 2 mm，当接触 Oregon Green 488 BAPTA-1 溶液时，注意不要破坏标本的方向。
- 对标本施加短暂的电流脉冲（电流参数：+13 V，脉冲宽度 10 msec，频率 1 Hz，共 10 个方波脉冲）10-11。
- 在装有 L-15 培养基的玻璃底记录腔底部，放置少量硅油，并将半完整标本置于其上，再次确保感觉上皮从上方无遮挡。为保证成像过程中的稳定性，按上述方法（见第 2.13 步）重新放置尼龙网格覆盖标本。
- 使用双光子显微镜，采用标准成像方案10-11，对感觉上皮中的自发性钙活动进行光学记录（图 7）。
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结果
前庭毛细胞的电生理特性依赖于其嵌入其中的复杂微结构7。图5显示，基于全细胞电导的特征，可利用半完整的前庭上皮制备方法区分I型毛细胞（图5A）、II型毛细胞（图5B）以及杯状初级传入神经元（图5C）。这些特征包括I型毛细胞在去极化过程中明显的“下陷”现象和较大的“衰减”尾电流，以及杯状初级传入神经元中代表动作电位的瞬时内向钠电流（图5C中的箭头所示）。
该制备方法还可用于量化衰老对不同类型前庭毛细胞的影响。图6比较了年轻小鼠与年老小鼠中Ⅱ型前庭毛细胞在负静息电位基础上接受阶跃去极化刺激时的电导特性（图6A）和失活特性（图6B）。对于敏感性最低的Ⅱ型毛细胞亚型而言，这两个参数均未观察到显著差异（见讨论部分）。
除了对全细胞特性的分析外，半切开...
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讨论
与其它感觉系统相比，关于平衡感的潜在机制研究相对较少， 例如 视觉和听觉系统。在研究前庭或平衡功能变化的文献中，大多数研究集中于行为学指标，包括前庭-眼反射，而对平衡的基本功能单元——前庭毛细胞本身——了解尚不充分。那些专注于毛细胞的研究几乎无一例外地采用从其原始环境中急性分离的毛细胞进行。本文中，我们展示了一种小鼠前庭感觉上皮的半完整制备方法，该方法在上述基础研究之上进行了拓展。
尽管前庭毛细胞相对强健，半离体标本的可用性却高度依赖于切除速度。通常情况下，标本在室温下切除后大约可维持活性2至5小时。因此，从动物处死到开始记录之间的时间应尽可能缩短，这是至关重要的。对于3周龄的小鼠，切除过程相对简单快捷（总共约5至7分钟），但在年龄较大的动物中操作会逐渐变得困难（在9月龄小鼠中可达25分钟）。在这些年龄较大的动物中，解剖时的温度是一个关键因素——通过持续用冰冻的含氧人工脑脊液（ACSF）灌注标本，可抑制正常的代谢过程。
如3.1节所述，制备样本持续用充氧的Leibovitz培养基（L-15）灌流，并使用充满...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作的经费由 Garnett Passe 和 Rodney Williams 纪念基金会项目资助，授予 R. Lim 和 A.J. Camp。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Leibovitz 培养基 L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| 仪器设备 | |||
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | A60S | |
| 正置显微镜 | Olympus | BX51WI | |
| 双光子显微镜 | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF 镊子 | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson 骨剪 | FST | 16221-14 | |
| 标准图案剪刀 | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH 模数转换器 | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter 显微操作器 | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp 放大器 | Axon Instruments | 700B | |
| 数据采集软件（电生理） | Axograph | N/A | |
| Imspector 数据采集软件（双光子） | Max Planck innovation | N/A |
参考文献
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
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