我们通过在轴突膜上附着的光镊探针同时进行力谱测量，检测了使用激光显微切割仪部分损伤的轴突中的张力释放。该实验方案用于评估轴突与培养基底之间的黏附性。
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摘要
摘要
发育中神经元网络功能连接的形成受到外部信号的影响。发育中神经元的神经突生长受到化学和机械信号的调控，而其感知和响应机械信号的机制尚不明确。阐明力学因素在细胞成熟过程中的作用，将有助于设计出能够促进细胞黏附以及细胞骨架与基底耦合的支架材料，从而提高不同类型神经元在损伤后的再生能力。
本文介绍了一种在激光诱导细胞损伤过程中同步进行力谱测量的方法。通过使用光学捕获的探针并结合干涉测量法实时追踪该探针在轴突膜上的运动，我们可在部分损伤轴突的同时测量其张力释放。本实验方案能够以皮牛顿（piconewton）级别的灵敏度检测张力释放，并以毫秒级时间分辨率记录张力释放的动力学过程。因此，该方法为研究细胞与基底之间的力学耦合如何受到药物处理和/或基底不同力学特性调控提供了一种高分辨率的研究手段。
引言
光学显微镜是一种用于观察活细胞的侵入性较低的成像系统。通过利用辐射压（如光镊1）或高能光子流（如激光显微切割系统2）等效应，该技术已扩展至纳米操纵领域。光学成像系统可精确控制亚细胞目标的可视化与操纵过程3。同时，得益于对输出激光功率的精确校准，光学工具能够以前所未有的可重复性实现温和或侵入性的样品操作。
多个实验室在同一实验装置中整合了光镊和激光显微切割技术，以实现细胞器消融4、不同细胞间的融合5，或通过光驱动的载体对细胞进行刺激6,7。光镊在完成光学刚度校准后，可在皮牛顿（piconewton）尺度上精确控制施加于细胞的力；而激光切割系统则可调节光学操控强度，范围涵盖细胞膜光穿孔、单个细胞器消融，乃至亚细胞结构的切割。然而，激光切割的校准目前仍依赖于对光学操控程度的定性评估，该评估主要基于图像分析，用以反映样品因受激光能量作用而产生的形态学变化8。在本方法中，我们展示了如何在发育中神经元的轴突激光切割过程中同步进行力谱测量，以在皮牛顿尺度上量化亚细胞区室中细胞骨架结构失衡所产生的力学变化9。培养的神经元在体外发育过程中会贴附于基底并发生极化。极化阶段通常发生在体外培养的前五天in vitro。在极化的第二阶段，其中一个突出的神经突会逐渐伸长，并最终分化为轴突10。此前已有研究利用Dennerl模型对生长锥在牵引力作用下的轴突伸长行为进行了建模11。近期，该模型被进一步扩展12，纳入了神经突与细胞外基质基底之间黏附作用的影响。这一生物物理模型基于实验观察提出13，表明作用于生长锥的拉力沿神经突传播时，其传递过程受到细胞与基底之间局灶性黏附的调控。同样地，轴突损伤会导致局部张力释放，并向胞体方向传播。因此，我们提出，在损伤部位与胞体之间的轴突某位置测量该释放的张力，可用来评估未受损局灶性黏附的阻尼效应。
我们校准激光解剖仪所需的光子能量通量，以控制轴突损伤的程度，从完全切断到部分损伤。校准后，我们对多个不同分化神经元的轴突重复进行部分损伤，并建立了量化张力释放的方案，从而获得一个用于评估轴突与基底间黏附力的定量参数14。
在本研究中，我们详细描述了所开发的实验方案，该方案是一种精确的实验方法，可用于在不同实验条件下（如化学处理14或不同类型的细胞培养基底）以皮牛顿级别的灵敏度评估和比较轴突与基底之间的黏附力。
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方案
1. 光学装置
整个光学系统此前已有描述15。简而言之，光镊系统基于一台工作在1064 nm的镱连续波（CW）光纤激光器（IPG Laser GmbH）。空间光调制器（SLM）（LCOS-SLM，型号X10468-07 - Hamamatsu）通过计算机生成的全息图改变入射红外激光束的相位，从而控制培养皿上捕获焦点的位置。开源的Blue-tweezers软件（设备表中的网页链接）生成并投射到空间光调制器上的全息图。用于力谱测量的干涉仪基于一个四象限光电二极管（QPD，S5980配C5460SPL 6041板 - Hamamatsu）和一个光电二极管（PD，PDA100A-EC - Thorlabs）。
激光切割光源为波长355 nm的脉冲亚纳秒紫外Nd:YAG激光器（PNV-001525-040，PowerChip nano-Pulse UV激光器 - Teem Photonics）。通过声光调制器（MQ110-A3-UV，355 nm熔融石英 -AA-Opto-electronic）控制输送至样品的紫外激光功率。
全息光镊与激光显微解剖系统集成于一台经过改装的正置显微镜（BX51 - Olympus）上，该显微镜配备了一个60倍、数值孔径（NA）为0.9的水浸物镜。显微镜载物台由一个三轴线性直流电机微定位系统（M-126.CG1，Physics-Instruments）构成，其上搭载了一个独立的三轴压电纳米定位平台（P-733.3DD，Physics-Instruments），以结合样品的粗调移动与压电平台的亚纳米级分辨率。显微镜载物台系统配备有两个协同工作的控制回路，可根据所选工作模式（位置钳制或力钳制、静态或动态）保持捕获焦点在正确位置16。具体而言，内部反馈回路作用于压电平台，以使微珠保持在距光阱中心某一设定距离处；另一个外部回路则控制电动载物台的位置，从而在比压电驱动器可用行程更大的范围内利用其运动范围17。当压电平台在某一方向上达到其行程极限时，外部回路将微定位台向相反方向移动，从而使压电平台因追踪附着在样品上的被捕获微珠而恢复至其中心位置。当压电平台回到其行程范围的中心位置时，微定位台即停止运动 。该系统的更多细节见于Guiggiani et al16,17。
一个帕尔帖装置（QE1电阻加热器配TC-344B双通道加热控制器，Warner Instruments）控制显微镜下细胞培养的温度（37 °C）。在培养过程中，通过向定制设计的聚二甲基硅氧烷（PDMS）套管（集成显微镜物镜）通入加湿的碳氧混合气体（95% O2, 5% CO2），将pH值和湿度维持在生理条件。
2. 细胞培养准备
所有实验方案均获得意大利卫生部批准。原代培养物取自胚胎18天（E18）的小鼠（C57BL6J，Charles River）海马组织。
- 神经元以25,000个细胞/毫升的浓度接种于玻璃底培养皿（P35G-0-14-C - MaTek Corporation）中。培养细胞的低浓度有助于避免在培养最初几天内形成致密的神经网络 体外在上述细胞浓度下，找到具有较长神经突且未与其他细胞连接的孤立细胞的可能性要高得多。
3. 磁珠包被
- 聚合物微球（Ø 4 μm，COOH末端- Bangs Laboratories，产品编号 PC05N/6700）根据polyLink蛋白偶联试剂盒（Polysciences，产品编号 19539）所述步骤包被多聚-D-赖氨酸。该微珠包被的分子与用于覆盖培养基质并促进细胞黏附的分子相同。
4. 选择分离的神经元。从培养基质上解离一个微珠，捕获并将其移动至神经元附近
- 将培养皿置于显微镜载物台上。通过移动载物台对样品进行聚焦后，调整照明物镜聚光器的位置，以实现科勒照明。对 illumination 光学系统进行准直以达到科勒照明条件，是提高明场成像质量的必要步骤。在此准直条件下，还需最大限度地提高来自散射捕获探针的红外激光收集效率（通过物镜聚光器），以便利用 QPD 和 PD 对其进行干涉跟踪。
- 移液数滴 μ将涂覆微球的储备溶液加入培养皿中。微球将沉积并附着于培养基质上。微球的数量 μ注入培养皿中的液体体积取决于储备液的微球浓度。理想条件是每个成像视野中包含一到两个微球。当向培养皿中加入过多微球时，它们可能已随机附着于培养的神经元上。
- 在培养皿中移动，寻找具有较长神经突（轴突）的孤立神经元，并保存显微镜载物台的位置。
- 移动并寻找附着在培养支撑物上的微珠。
- 打开红外捕获激光器。此时，空间光调制器（SLM）上未投影任何全息图，红外激光光斑的位置与紫外激光光斑的位置重合。将红外光斑的轴向位置设置在2-3 μ通过显微镜载物台移动，在培养支撑面上方 m 处。
- 将输送至样品的紫外激光功率设置为低于1 μW. 紫外激光显微切割系统已进行过校准14:
5-6 μ玻璃支撑体被消融
4 μ当神经元连接被完全解剖时
2.5 μ当神经突部分受损时
‹ 1 μ在培养皿中产生一道冲击波。该光学冲击波的强度足以使微珠从玻璃基底上脱离。 - 打开紫外激光器，同时保持红外激光器开启，通过显微镜载物台移动将紫外光斑移至黏附的微珠上方。微珠从表面脱离，并被红外激光捕获。随后关闭紫外激光器。
- 将被捕获的微珠移动至玻璃支撑面以上数微米处（20-30 μ微米）。将珠子提升至该位置可防止其在移向先前选定的神经元时接触其他细胞。将珠子移至先前保存的载物台位置。将载物台速度设为较低值（10 μm/s），以确保流体拖曳力不超过光镊捕获力。
5. 通过计算机生成全息图移动光阱位置，使其相对于激光显微切割点和轴突位置进行调整，并校准光镊的刚度
- 将微珠移向玻璃基底以观察轴突。微珠应悬于细胞上方，避免与其接触（距离玻璃基底约 5 μm）。
- 移动显微镜载物台，使紫外光聚焦点位于轴突宽度的中心位置。保存当前载物台位置。
- 通过计算机生成的全息图调节红外光聚焦点的位置。在此步骤中，载物台保持在上一步选定的位置不动。当计算机生成的全息图投射到空间光调制器（SLM）时，被捕获的微珠相对于轴突发生移动。我们调节红外激光焦点位置，使被捕获的微珠与神经突中心对齐，同时紫外激光焦点也位于同一神经突的中心。红外光焦点及其捕获的微珠应沿神经突方向，距离紫外光焦点 5–10 μm。根据神经突的几何形态，可调整红外光焦点相对于紫外光焦点的位置。若光镊系统未配备 SLM 装置，则可通过倾斜镜或声光偏转器在红外光路中调节焦点位置。将红外激光焦点置于距离紫外激光焦点 5–10 μm 处，以避免切割光束与捕获探针之间的光学相互作用，这种相互作用可能影响微珠的布朗运动，进而干扰力谱测量结果。
- 在确定红外光焦点相对于紫外光焦点和轴突的新位置后，移动载物台，使被捕获的微珠远离轴突，避免发生碰撞。将被捕获微珠的轴向位置调节至盖玻片上方约 2 μm 处。
- 调节四象限光电探测器（QPD），使其居中对准干涉条纹：当 QPD 处于中心位置时，其 x 和 y 方向的差分信号为零。利用干涉仪以 50 kHz 的采样率采集被捕获微珠 5 秒的布朗运动信号。采用功率谱法18计算光阱的刚度（pN/nm）和灵敏度（V/nm）。
6. 将微珠连接至轴突，进行轴突切断并同步测量受力
- 将捕获的微珠位置抬高至盖玻片上方约 4 μm 处，并将其移动到先前保存的载物台位置（参见步骤 3.2）。
- 将捕获的微珠向下移动靠近轴突，直至其接触神经突。捕获微珠与轴突之间的碰撞通过轴向方向上检测被捕获微珠位移的 z 轴 QPD 信号进行监测。
- 保持被捕获的微珠对轴突施加压力约 10 秒，以促进其与神经突膜的黏附。
- 移动微米级载物台，使被捕获的微珠从轴突上移开，从而验证其是否已黏附于细胞膜。若微珠已黏附，则会脱离光镊捕获范围。
- 将激光捕获位置移回已黏附的微珠上，并启动力钳反馈回路，设定作用力为零。通过此方式，压电载物台将附着在细胞上的微珠重新定位至光镊中心。若系统未配备反馈控制回路，可通过显微镜载物台移动激光捕获位置，使其对准已黏附的探针。当 QPD 信号恢复至微珠被捕获但未黏附于细胞时的水平（x 和 y 方向 QPD 信号为零，z 方向 QPD 信号的四象限电压总和与微珠远离任何表面被捕获时相同），即表示已到达捕获中心。
- 在 z 轴上设定力钳条件，将捕获激光略微置于微珠中心上方（约 100 nm），以在已黏附的被捕获探针上产生预张力。若系统未配备力钳控制功能，可通过显微镜载物台以 25 nm 为步长逐步上移光镊位置。利用 z 轴 QPD 信号进行监测，并据此调节激光捕获位置相对于已黏附探针的位置。该预张力对于检测轴突损伤后膜上的应变以及已黏附探针布朗运动的相应减弱至关重要。类似方法已被用于通过视频成像测量膜牵丝中张力的释放19。
- 关闭力钳反馈回路，以在位置钳制条件下（压电载物台固定）测量已黏附探针上的受力。
- 开始通过干涉仪（采样频率 20 kHz）同步记录被捕获探针的位置，同时进行激光轴切期间的细胞明场延时成像（帧率 20 Hz）。
- 开启紫外激光，发射激光脉冲直至轴突图像中可见损伤（通常需要 200–400 个光脉冲，每脉冲能量：25 nJ），随后关闭紫外激光。
- 继续通过干涉仪记录约 3 分钟，直至 x、y 和 z 方向 QPD 信号曲线达到平台期。
7. 定量分析总张力释放
- 将记录的QPD信号（单位：伏特）通过光镊校准后的灵敏度进行转换，得到相应的纳米单位位移信号。
- 使用截止频率为10 Hz的高通滤波器对x、y和z方向的位移轨迹进行滤波。
- 计算代表被捕获微珠布朗运动的滤波轨迹的总方差。以25毫秒为步长，在500毫秒（10,000个数据点）的重叠时间窗口内计算方差。20高通滤波处理轨迹数据可排除由膜波动或皮层肌动蛋白运动引起的布朗运动变化。微珠的布朗运动受到光阱力和细胞膜黏附力的抑制。当膜因张力释放而受到拉伸时，其黏度增加，因此在轴突切断后立即检测到的微珠布朗运动开始减小。
- 定义t0：在紫外激光能量作用后，布朗运动方差开始减小的起始时刻。时间点t0标志着膜应变的开始。
- 定义 t1：布朗运动方差减小的终止时刻（即达到平台期时）。时间点 t1 表示膜应变的结束。
- 对盖玻片支撑物上的碎片或划痕进行视频追踪，以测量力测量过程中样品的任何漂移。为了追踪玻璃支撑物上的颗粒，我们首先对明场图像应用阈值处理，获得一系列二值化图像，其中颗粒呈白色，背景为黑色。然后，我们以亚像素精度追踪颗粒的质心（使用免费软件 ImageJ）。
- 从位移QPD轨迹中减去测得的漂移量。将校正漂移后的QPD轨迹乘以相应的校准光学刚度（kx，ky，kz以获得皮牛顿单位的 Fx、Fy、Fz 信号轨迹。
- 计算总力轨迹为 F总 = √(Fx2+Fy2+Fz2).
- 计算 t0 到 t1 之间释放的总力为 F释放= F总(t1) - F总(t0)。必须减去在 t0 时测得的力，因为当微珠黏附到神经突上时，该力是由探针从光阱中心位移引起的。
- 计算被捕获微珠与紫外激光光斑位置之间的神经突接触面积：在明场图像上测量被捕获微珠与紫外激光光斑位置之间神经突的长轴（L）和短轴（D）。轴突接触面积为 A轴突 = L × D
- 标准化总释放力 F释放 由 轴突接触面积 A轴突.
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结果
细胞通过其黏着斑在基质上产生牵引力。细胞骨架元件产生的力与培养基质的反作用力处于平衡状态。在激光诱导神经突产生损伤后，部分受张力的细胞骨架纤维发生断裂，其原有的平衡张力因基质黏附力的消失而被释放。释放的张力部分传递至未受影响的黏着斑，而附着在细胞膜上的微珠（由光镊捕获）则可测量出未被细胞骨架元件锚定力抵消的那部分张力释放（见示意图 图1）。
我们在图2中展示上述实验方案的代表性结果。图2a左图显示了一条较长的神经突，代表正在分化的神经元的轴突。图2a右图显示同一神经元在诱导轴突损伤后的情况（白色箭头所示）。图2b展示了在x、y和z方向上记录的微珠位移轨迹。图2c报告了对玻璃支撑面上划痕的视频追踪，用于校正并消除测量过程中载物台的漂移。
在图3a的左侧面板中，我们展示了受损的神经突，以及损伤部位...
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讨论
本研究报道了一种定量方法，通过在激光诱导细胞损伤的同时进行同步力谱测量，来比较神经突与培养基底的黏附程度。所测得的张力释放与细胞对基底的黏附程度相关：具有更多局灶性黏附的细胞应释放更少的张力。以皮牛顿（piconewtons）为单位测量张力的释放，可提供一个物理量，用于在不同实验条件下评估轴突对培养基底的黏附性14。
多个实验室将激光显微切割系统与光镊系统相结合，采用了不同的光学设计方案23我们的选择是采用固定光路并移动显微镜载物台的装置。为实现这一点，我们在红外激光光路中引入了一个空间光调制器，以相对于紫外激光位置移动捕获光斑。尽管振镜可实现激光焦点位置的偏转而无需移动样品，但其可能引入机械噪声，影响力谱测量结果。此外，我们决定在样品内重新定位红外激光焦点，因为布朗运动分析能够快速重新校准光阱刚度。将紫外激光光斑位置在样品上移动可能会引起球面像差，从而影响紫外聚焦光斑本身的质量，这种像差仅在光束偏离中心位置较小时可忽略不计。因此，对激光解剖系统的光学特性进行修改可能需要 从头合成 递送激光功率的校准与实体损伤的关系。...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
Alberto Guiggiani 在实时控制系统开发方面的贡献，Evelina Chieregatti 和 Hanako Tsushima 富有见地的讨论，Giacomo Pruzzo 和 Alessandro Parodi 在定制电子设备和软件开发方面的努力，以及 Claudia Chiabrera 和 Marina Nanni 在细胞培养制备方面提供的专业建议与协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 聚合物微球，4 μm，COOH 包被 | Bangs Laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink 蛋白偶联试剂盒 | Polyscience | 19539 | |
| 设备 | |||
| 红外激光器 | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | 工作波长为 1064 nm 的镱连续波（CW）光纤激光器，线性偏振 |
| 空间光调制器 | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers 软件 | 格拉斯哥大学光学组 | 免费可下载软件 | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | 免费可下载软件 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 配 C5460SPL 6041 电路板 | 四象限光电二极管，用于测量被捕获探针在 x、y 方向的位移 |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | 光电二极管，用于测量被捕获探针在 z 方向的位移 |
| 纳秒脉冲紫外激光器 | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | 脉冲 UVA 激光器，脉冲宽度 400 ps |
| 声光调制器 | Olympus | MQ110-A3-UV，355 nm 熔融石英 | |
| 正置显微镜 | Andor | BX51 | 配备 60 倍、0.9 NA 水浸物镜 |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| 帕尔贴装置 | Physic Instruments | QE1 电阻加热装置，配 TC-344B 双通道加热控制器 | |
| 显微镜载物台：微动+压电载物台 | 国家仪器公司 | 三个线性平台 M-126.CG1 承载一个独立的三轴压电纳米定位平台 P-733.3DD | |
| 数据采集卡（Daq） | NI PCI-6229 | 采集被捕获探针在 x、y、z 方向的位置信号，并向显微镜载物台发送反馈控制信号 | |
| Linux 实时应用接口（RTAI）系统 | 基于专用台式计算机开发的实时反馈控制系统，用于控制载物台位置 |
参考文献
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