本文所述系统采用了一种传统的光镊，以及一条独立的全息光镊线，能够创建和操控多个光阱。这使得可形成复杂的折射微粒几何排列，同时还能对生物酶的活性进行高速、高分辨率的同步测量。
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摘要
摘要
配备光镊的高分辨率显微镜系统能够精确操控多种折射物体，例如介电微球1或细胞器2,3，并可对这些物体相对于光镊中心的位置进行高空间和时间分辨率的检测。本文所述系统包含一个工作波长为980 nm的“传统”光镊。此外，系统还配备第二个光镊装置，该装置利用商用全息模块，在显微镜视场内同时生成并操控复杂的光镊图案，工作波长为1,064 nm4,5。两个系统的结合使得能够同时操控多个折射物体，并在纳米尺度和皮牛顿尺度上同步进行高速、高分辨率的运动与受力测量。
引言
光镊技术是生物物理学中的关键技术之一6。光镊技术的一项重要进展是全息光阱的开发，它能够形成三维捕获模式，而非常规的点状光阱7。这类全息光阱在折射性物体的定位方面具有高度的灵活性。然而，传统光阱比商业化的全息套件更容易调整至更高的对称性，且允许对被捕获物体进行快速而精确的追踪。本文介绍一种系统（图1），该系统将两种捕获方法集成于同一仪器中，使用户能够根据需要充分利用两者的优点。
构建光镊（基于单光束或多光束）的一般性考虑已在其他文献中详细讨论8-10。本文将概述与我们实验装置相关的特定考虑，并详细介绍我们的光路准直步骤。例如，已有文献描述过包含两束光镊光束的系统（例如参考文献11），通常使用一束激光捕获折射性物体，同时使用另一束（有意降低功率的光束）进行独立的位置读出。然而，在本系统中，两束激光均需具备高功率（300 mW 或更高），因为两束光都将用于捕获。在对生物系统进行测量时，用于捕获的激光波长应尽可能位于特定的近红外波段，以最大限度减少光诱导的蛋白质降解1。本文选择使用980 nm半导体激光器和1,064 nm DPSS激光器，因其成本低、易于获得且操作简便。
我们还选择使用空间光调制器（SLM）来实时同时创建和操控多个光镊4,5。这些设备虽可商业采购，但将其整合到完整系统中仍面临独特的挑战。本文介绍了一种切实可行的方法，可有效应对这些潜在困难，并提供一种高度多功能的仪器。我们以所描述的特定系统为例，详细说明其实现过程，可为改进设计提供参考指南。
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方案
1. 980 nm 波长单光镊的安装
- 980 nm 波长的光镊通常最适合生物物理实验，且市面上有功率输出高达 300 mW 的低成本激光二极管。激光二极管最好配有偏振保持单模光纤，且已知其模场直径。光纤需足够长以起到模式滤波的作用，通常以 FC/PC 或 FC/APC 接头终止。其中，FC/APC 更为理想，可最大限度减少光的后向反射及潜在的反馈不稳定性。
- 将 980 nm 激光二极管固定在可调节功率和温度的支架上。最好将支架直接固定在光学平台上，以最大化被动散热，从而降低因温度控制器故障导致激光二极管损坏的风险。
- 将 PC/APC 光纤接头安装至光束准直光学元件上。确保准直光束的发散角尽可能小至关重要，因此可调节的光纤接口最为实用。需确保所选光纤接口与激光二极管尾纤的模场直径相匹配。若使用声光偏转器（AOD）或电光偏转器（EOD）进行光束扫描，则准直激光束的束腰应略小于偏转器的孔径。
- 将准直适配器固定在光学平台上，与显微镜保持足够距离，以便进行光路引导、光束扩展及安装其他所需组件。调节光纤接口，确保在相当于整个光路长度的距离上光束束腰保持稳定。
- 安装 图1 中所示的反射镜。从显微镜上取下物镜，并利用反射镜将光束引导通过物镜安装台上的孔径。如需要，可暂不安装二向色镜 DM1 和 DM3，留待后续步骤。DM2 和 DM3 均为短通型，可透射可见光，同时反射近红外光及更长波长的光。
- 可临时将一个红色激光笔安装在物镜位置，使其与显微镜的光轴对齐。需使用定制的机械适配器以确保激光笔的中心对准。利用该激光笔发出的可见光束，可将其反向引导至光纤接口孔径的中心，进而用于后续透镜的安装（见下文）。
- 在距光纤接口适当距离处安装 980 nm 光束扩展器（L8 和 L9），以便未来根据需要插入光束导向组件（如 AOD 或 EOD）1。扩展后的光束应略微超过物镜后焦孔径。此处使用焦距分别为 125 mm 和 60 mm 的透镜，构成开普勒式结构，使光束束腰大约扩大一倍。使用可见激光笔光束（见第 1.6 节）确保透镜位置正确并完成粗略对准。
- 按图示将 980 nm 光束导向透镜（L2 和 L3）以望远镜结构安装（此处两者的焦距均为 60 mm）1。L3 安装在与物镜后焦平面共轭的平面上。将 L3 安装在精密 XYZ 定位平台上，以实现光束导向。若 XYZ 平台配有数字微米指示器，将有助于实现捕获光阱的可重复定位与复位。0.5 英寸的行程通常已足够，但 L3 沿光轴方向具有更长行程可能更有利。使用可见激光笔光束（见第 1.6 节）确保透镜位置正确并完成粗略对准。
2. 激光探测器的安装
- 如图1所示，将二向色镜DM3安装在聚光镜上方。通常需要使用定制的安装支架。将四象限光电二极管（QPD）或位置敏感探测器（PSD）8固定在聚光镜组件的侧面，并确保经DM3反射的980 nm激光束大致照射在探测器中心位置。若使用QPD，应将其安装在小型XY平移台上，以便精确调节传感器与激光束的对中。
- 在DM3与探测器之间安装透镜L1（通常为30 mm焦距的透镜）。调整L1的位置，使激光束在探测器表面聚焦为一个单一光斑。
- 在L1前方安装陷波滤光片，以阻挡1,064 nm激光束以及来自显微镜照明光源和环境光的杂散可见光反射。
3. 1064 nm 波长全息光镊的安装
- 全息装置部分基于一个市售的硬件/软件套装构建。该套装中使用的全息镜片额定最大入射功率为 5 或 10 W/cm2。在此功率范围内的单模 TEM00 光束可轻松由波长为 1,064 nm 的 DPSS 激光器提供。
- 将 1,064 nm 激光器安装在抬高的平台上，使其光路高度大致与 980 nm 光路高度匹配（见第 1 节）。
- 若激光器功率无法直接控制，可在激光输出口后立即安装一个半波片（HWP）和一个偏振器（PBS）以手动调节功率。将偏振器安装在旋转位移台上有助于调节，以便满足全息镜对光束偏振方向的要求。
- 安装 1,064 nm 光束扩束器（L6 和 L7）。激光束腰必须被扩束至匹配全息镜的对角线尺寸。对于较大的扩束倍率（超过 10 倍），需考虑保持扩束器体积较小。因此，建议使用焦距异常短的透镜（此处为 16 mm 和 175 mm）。
- 按图示安装其余反射镜，以引导 1,064 nm 光束通过物镜。
- 将 DM1 二向色镜（入射角 45°）固定于运动学镜架中，并将组件置于 980 nm 光路中，确保该光束能无衰减地透射通过。
- 开启激光指示器光源。DM1 镜应反射足够量的可见光，以便准确定位空间光调制器（SLM）在光路中的位置。SLM 还需适当倾斜，使入射和出射激光束尽可能接近垂直入射。但入射角必须足够大，以确保激光束不会被透镜镜架或其他光学元件遮挡。5° 的角度通常易于实现且足够小。最后，必须精确测量 DM1 与 SLM 之间的距离，以便后续插入透镜 L4 和 L5（见下文 3.6 节）时，可将 SLM 镜面与物镜的后焦平面共轭。
- 安装一个反射镜，将来自 1,064 nm 光束扩束器的光引导至 SLM。确保激光指示器光束准确对准扩束器的中心孔径。
- 安装透镜 L4 和 L5（此处分别为焦距 125 mm 和 200 mm 的透镜）。该望远镜组合将 SLM 镜面与物镜的后焦平面共轭，同时将光束束腰缩小至仅略大于物镜后光阑，实现轻微过填充。我们选择长焦距透镜以增大 SLM 与 DM1 之间的距离。这不仅为第二条激光光路腾出空间，也有助于简化对准过程。
- 移除激光指示器，保留其安装适配器作为粗对准的参考孔径。
4. 系统安装与校准注意事项
- 透镜 L3 和空间光调制器（SLM）必须定位，使其在光学上与物镜的后焦平面共轭。如果光学捕获光束被注入显微镜的无限远空间，则透镜 L4 和 L5 的公共焦点在光学上与样品平面共轭。
- 使用红外卡观察器，将 980 nm 光束对准激光指示器适配器孔径的中心轴。
- 使用红外卡确保 1,064 nm 光束与 980 nm 光束在二向色镜 DM1、透镜 L2 和 L3 上照射到相同位置，并且 1,064 nm 光束沿激光指示器适配器孔径的中心轴传播。
- 将激光指示器安装适配器更换为物镜。通常使用高数值孔径的油镜或水镜。
- 通过“引导”激光光束，直至在相机上观察到径向对称的干涉图样，从而按照文献9所述方法对 980 nm 捕获光束进行对准。
- 关闭全息反射镜（i.e. 使其作为被动反射镜使用），利用 SLM 和 DM1 “引导”未发生衍射的 1,064 nm 光束，以对准 1,064 nm 捕获光束。
- SLM 会产生显著的未衍射光束，导致视场中出现一个强度高且位置固定的激光捕获点。这在对准过程中有用，但在实验中可能不理想。为阻断该捕获点，可在与样品平面共轭的位置（e.g. 透镜 L4 和 L5 的公共焦点处）的未衍射光路中插入一个小的不透明物体。该中心光斑遮挡物的尺寸应略大于聚焦光的艾里斑直径（对于本系统描述，可使用直径为 100–300 μm 的遮挡物）。
- 使用偏振器调节 1,064 nm 光束的偏振方向，使其与 SLM 的取向匹配。旋转半波片以将光束输出功率调节至所需水平。
- 如有需要，可将声光偏转器（AOD）或电光偏转器（EOD）等光束 steering 元件插入 980 nm 激光光路中。确保这些元件与物镜的后焦平面正确共轭，并重新对准捕获光束。建议将 steering 元件安装在测角仪平台上。
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结果
组装完成的系统可使操作者实时捕获多个折射性物体，并在视场范围内沿三个维度对其进行定位。我们通过捕获11个微球来展示该仪器的全息操控能力（图2）。每个物体被捕获后，其对应的光镊会手动重新定位，最终排列成犹他大学的标志图案，该实验即在犹他大学完成。全息光镊与传统光镊的联合功能如图3所示。传统光镊使中心微珠逐步加速移动（显示的光镊速度分别为1.3、10和82 μm/sec），而全息定义的光镊则保持静止。在最高速度下，微珠的整个运动过程发生在单帧视频的采集期间，因此呈现出严重的运动模糊。传统光镊可移动得足够快，以致微珠因流体动力拖拽而脱离捕获势阱（未展示）。
请注意，利用多个微球组装复杂形状时，可能会出现视野中微球数量不足以完成完整组装的情况（这一点在 图2）。在这种情况下，操作者需要相对于样品物理移动视野即 重新调整显微镜的样品台位置，以暴露更多的微球，同时保留已捕获的物体。
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讨论
我们构建了一种仪器，该仪器结合了两种不同类型的光镊（图1），以提供独立的捕获功能，用于物体操控与测量。其中，“传统”光镊基于一个980 nm的半导体激光器构建。该光束经过扩束、导向后，注入到倒置显微镜中（图1中的“浅红色”光束）。全息光镊则基于一个1,064 nm的DPSS激光器构建。该光束被扩束至匹配空间光调制器（SLM）的尺寸，以较小的入射角反射至SLM表面，随后被压缩至略大于物镜后焦孔径的范围，再通过二向色镜与“传统”捕获光路合并，最终注入显微镜中（图1中的“深红色”光束）。需要注意的是，SLM必须放置在一个与物镜后焦平面在光学上共轭的平面上。
在实验方案部分，我们介绍了系统设计与准直方面的考虑，这些考虑使我们能够最大限度地减小装置的空间占用，同时仍能实现相对简便的搭建。我们还描述了对空间光调制器（SLM）产生的未衍射成分进行阻拦的方法，这对于本研究所使用的此类商用系统可能是必要的，但该操作具有一定挑战性，且迄今为止相关文献记录较少。
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
经费由犹他大学提供。我们感谢加州大学默塞德分校的J. Xu博士和加州大学欧文分校的B.J.N Reddy博士有益的讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 光学平台 | Newport 公司 | ST-UT2-56-8 | 加利福尼亚州尔湾市 |
| 显微镜，倒置，Eclipse Ti | 尼康美国 | MEA53220 | 纽约州梅尔维尔 |
| 100倍油镜（数值孔径1.4） | 尼康美国 | MRD01901 | 纽约州梅尔维尔 |
| 油浸式聚光镜 1.4 数值孔径 | 尼康美国 | MEL41410 | 纽约州梅尔维尔 |
| EMCCD相机 | Andor 技术公司美国分公司 | Ixon DU897 | 康涅狄格州南温莎 |
| 1/3" CCD IEEE1394相机 | NET USA Inc | Foculus FO124SC | 高地 IN |
| 激光，基模（TEM00），单纵模（SLM），1,064 nm 波长 | Klastech 激光技术 | Senza-1064-1000 | 多特蒙德；德国 |
| 激光二极管，TEM00，单纵模，980 nm | Axcel Photonics | BF-979-0300-P5A | 马萨诸塞州马尔伯勒 |
| 激光二极管支架 | ILX Lightwave | LDX-3545、LDT-5525 和 LDM-4984 | 博兹曼，蒙大拿州 |
| 可调光纤端口 | Thorlabs | PAF-X-11-B | 新泽西州，美国 |
| 全息系统 | Arryx | HOTKIT-ADV-1064 | 芝加哥，伊利诺伊州 |
| 全息镜 | 博尔德非线性系统 | 这是 HOTKIT-ADV-1064 的一部分 | 科罗拉多州拉法叶 |
| 方解石偏振器 | Thorlabs | GL10-B | 新泽西州，美国 |
| 半波片 | Thorlabs | WPH05M-1064 | 新泽西州，美国 |
| 偏振片旋转架 | Thorlabs | PRM1 | 新泽西州，美国 |
| 半波片旋转架 | Thorlabs | RSP1 | 新泽西州，美国 |
| 快门 | Thorlabs | SH05 | 新泽西州，美国 |
| 二向色镜（DM2） &和 DM3）；45 ° AOI | Chroma Technology | t750spxrxt | 佛蒙特州贝尔斯福尔斯 |
| 二向色镜（DM1）；45 ° AOI | Thorlabs | DMSP1000R | 新泽西州，美国 |
| 定制机械适配器 | Thorlabs | SM1A11 和 AD12F，内径增大 | 新泽西州，美国 |
| 陷波滤波器 | Semrock | FF01-850/310-25 | 纽约州罗切斯特 |
| 声光偏转器（双轴） | 相互作用 | DTD-584CA28 | 贝尔伍德，伊利诺伊州 |
| 测角台 | 新焦点 | 9081 | 加利福尼亚州圣克拉拉 |
| 60 mm 转向透镜 | Thorlabs | LA1134-B | 新泽西州，美国 |
| 16 mm 非球面扩束透镜 | Thorlabs | AC080-016-C | 新泽西州，美国 |
| 175 mm 扩束镜 | Thorlabs | LA1229-C | 新泽西州，美国 |
| 斑点阻断器（cabron-steel 球体） | Bal-Tec | 0.0100" 直径 | 加利福尼亚州洛杉矶 |
| 微球（羧基聚苯乙烯） | Spherotech | CP-45-10 | 伊利诺伊州莱克福里斯特 |
参考文献
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