近年来，利用多种不同类型的体细胞干细胞，已通过体外培养方法实现了生殖细胞的形成。本文将直观展示由新生小鼠来源的干细胞分化为早期卵母细胞样细胞的过程。
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摘要
摘要
研究生殖细胞的形成与分化一直非常困难，主要是由于细胞数量稀少且位于发育中胚胎的深层部位。“封闭”系统的可用性 体外 基于该系统可能对我们理解配子发生过程具有重要价值。本视频方案展示了从小鼠新生皮肤中分离的体细胞干细胞形成卵母细胞样细胞（OLCs）的过程。所获得的OLCs表达多种与卵母细胞一致的标志物，例如 Oct4，Vasa，Bmp15，以及 Scp3然而，由于无法完成减数分裂，这些细胞仍不能经历成熟或受精过程。本方案将提供一个可用于研究生殖细胞早期形成及其向更成熟配子分化的系统。在早期分化过程中，表达 Oct4（具有潜在生殖样细胞特征）的细胞数量可达约 5%，但目前卵样细胞（OLCs）的形成效率仍然相对较低。该方案整体较为简便，但需特别注意确保起始细胞群体健康且处于早期传代阶段。
引言
在早期胚胎发生过程中，配子发生通过一系列阶段进行，包括原始生殖细胞（PGC）的形成、迁移，最终定植于性腺嵴。在此期间，PGC经历增殖并逐步分化为更为成熟的配子1。由于PGC从尿囊基部迁移至胚胎后肠，再沿背侧壁移动，最终定植于性腺嵴，这一过程使其极难研究2。尽管该领域已取得进展，但PGC的数量稀少、位置深在以及迁移特性，仍严重阻碍了对其形成与分化机制的研究3,4。
近年来，已发现胚胎干细胞具有形成生殖细胞的潜力 体外 5,6同样，多种体细胞干细胞也被证明具有形成生殖细胞的潜能，继而 体外 培养 7-11最近，从新生小鼠皮肤中分离的干细胞被诱导分化 体外 转化为类生殖细胞和早期卵母细胞 12分化过程中，表达Oct4的干细胞亚群增加，并形成类似卵丘-卵母细胞复合体的结构。可从培养物中挑选卵母细胞样细胞（OLCs）并与天然卵母细胞进行比较。采用此培养方法可获得直径为40–45 μm、表达类似于卵母细胞标志物的OLCs，例如 Gdf9b，VASA 和 DAZL。迄今为止，所获得的卵样细胞（OLCs）仍无法成熟或受精 12.
尽管OLCs仍无法发挥功能，但用于形成这些OLCs的方案可能仍可作为一种检测手段，用于研究封闭环境中早期生殖细胞的形成与发育过程 体外 系统。最初讨论由体细胞干细胞形成OLCs的研究使用了胎猪皮肤作为干细胞来源 8在该研究的基础上，进一步发现诱导分化早期形成的 PGC 样细胞是 OLC 的前体细胞，并表达 OCT4、VASA、STELLA、C-KIT 和 DAZL 等 PGC 标志物。 13该数据支持利用此系统研究生殖细胞形成与分化的潜力 体外本视频文章将演示从小鼠新生皮肤形成OLCs所采用的实验方案。该方案提供了一种 体外 研究生殖细胞发育的模型，可能为阐明其增殖和分化相关的重要因素提供途径。
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方案
1. 培养基制备
- 在使用前 2-3 小时配制培养基，并将瓶盖略微松开后放入即将进行实验的细胞培养箱中。本方案中使用的培养基：
- 配制干细胞培养基，成分为添加了 1× B27、40 ng/ml bFGF 和 20 ng/ml EGF 的 DMEM/F12 培养基。
- 配制生殖细胞分化培养基，成分为添加了 0.05 IU FSH、0.03 IU LH、3 mg/ml BSA、5 μl/ml ITS、0.23 mM 丙酮酸钠、1 mg/ml 胎球蛋白和 1 ng/ml EGF 的 m199 培养基。可预先配制不含 FSH、LH 和 EGF 的基础培养基，于 4 °C 保存，最多可保存一周。
2. 干细胞培养准备
- 从小鼠幼崽中分离干细胞，方法如前所述12使用第2至第4代的干细胞进行 体外 生殖细胞分化。卵母样细胞（OLC）形成的效率与起始干细胞的质量直接相关。通常在细胞传至第二代左右，群体呈现干净健康状态时，即应开始分化。若将干细胞继续培养超过第二代，会负面影响OLC形成的效率（未发表结果）。
- 在启动分化前 48 小时对干细胞进行传代培养。使用血清移液管将培养皿中所有悬浮的球形细胞聚集体及用过的培养基转移至 15 ml 离心管中。需注意仅收集悬浮的球形细胞聚集体，避免收集已贴壁于培养皿底部并自发分化的细胞。
- 在500 × g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于500 μl预热至37 °C的新鲜干细胞培养基中。轻轻吹打聚集体以实现细胞的部分解离。切勿剧烈吹打细胞，以免降低细胞活力。将部分解离的细胞转移至含9.5 ml预热的全新低吸附10 cm细胞培养皿中的新鲜干细胞培养基中。
- 将细胞放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 细胞培养箱中孵育48小时，然后开始诱导分化。
3. OLC 分化
- 使用血清学移液管将干细胞从培养皿中吸出，转移至15 ml离心管中，弃去任何贴壁细胞。在500 × g条件下离心收集细胞，并用500 μl无菌PBS重悬。使用宽口1,000 μl枪头剧烈吹打细胞，使其形成不超过10–20个细胞的细胞团块。在解离过程中，定期取出少量细胞，在白光显微镜下观察，确认聚集的细胞为10–20个单个细胞组成的团块。过度解离将导致细胞活力下降。
- 向解离后的细胞中加入9.5 ml PBS，取15 μl该细胞悬液加入血细胞计数板进行细胞计数。在500 × g条件下离心5分钟收集细胞。
- 将细胞以1.32×106 cells/ml的浓度重悬于分化培养基中。
- 每孔加入500 μl细胞悬液，接种至平底24孔悬浮培养板中。
- 将24孔板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养48小时。从每孔中移除250 μl培养基，转移至相应标记的1.5 ml离心管中。向每孔加入250 μl新鲜分化培养基。将废弃的培养基在500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。将离心所得的细胞沉淀用50 μl新鲜分化培养基重悬，并加回至分化板中对应的培养孔。
- 每隔48小时更换一半培养基，直至分化第12天。
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结果
最初，细胞会附着在培养皿底部并铺展开来。在分化开始后的42-72小时，会出现少量悬浮的OCT4阳性细胞，并开始增殖（图1A）。这些细胞出现后不久，大部分将消失，而贴壁细胞则在培养皿底部形成致密的集落样细胞团。数天后，这些细胞团将从培养表面脱落。在部分脱落的细胞团中，可观察到一个较大的细胞（图1b 和 图1c）。初次观察时，这些细胞的直径约为35 μm。随着持续培养，卵母细胞样细胞（OLCs）将逐渐生长至直径约45 μm。这些即为卵母细胞样细胞，可连同支持细胞一起收集，或经胰蛋白酶消化以获得未附着其他细胞的纯OLCs（图1d）。
为了确认OLCs表达与天然卵母细胞相似的转录本，可收集OLCs并检测其相关标志物的表达情况，例如 Zpc、Scp3、Cmos、Oct4、Bmp15，以及 Vasa。尽管 Oct4 和 Vasa 在未分化的干细胞中表达多种标志物，例如 Bmp15<...
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讨论
迄今为止，尚未利用完全 体外 检测。最近，由 Hayashi 进行的一项研究 等 能够从形成的 PGC 样细胞产生后代 体外 并转移 体内 用于进一步开发14从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞出发，他们能够生成类似原始生殖细胞的细胞，这些细胞在经回收后 体内 移植的卵母细胞能够成熟、受精，并用于产生后代 14这表明，在适当条件下，不同来源的干细胞具有形成功能性卵母细胞的潜力。
培养体系的某些方面对其功能至关重要。用于分离干细胞的小鼠品系非常关键。本方案使用的是杰克逊实验室（Jackson Lab）的 B6 小鼠（货号 #008214）。这些小鼠携带 Oct4-EGFP 转基因，可通过 EGFP 蛋白可视化表达 Oct4 的细胞。当使用 CD1 小鼠的干细胞尝试该方案时，效率显著降低，OLC 的形成也更不可靠。目前即使使用 B6 小鼠，OLC 形成的效率仍然较低。在启动生殖细胞分化之前，所使用的干细胞应处于第 2 至第 4 代，因为使用更晚代次的细胞时...
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致谢
PWD 得到了加拿大卫生研究院（CIHR）博士后奖学金以及加拿大卫生研究院向西安大略大学 Gerald M. Kidder 提供的基金资助。作者还要感谢圭尔夫大学的 Julang Li 在本方案开发过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| 丙酮酸钠 | Invitrogen | 11360-070 | |
| 胎球蛋白 | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24孔板 | Nunc | 144530 | |
| 10 cm 培养皿 | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml 离心管 | BD | 352095 |
参考文献
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重印与许可
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