在增殖条件下扩增人神经前体细胞（NPCs）。在多种神经营养因子联合存在的情况下，将NPCs分化为富含神经元的培养物。通过免疫荧光染色检测神经元标志物。为了分离出纯度较高的神经元群体，将NPCs在PEN膜载玻片上进行分化，并进行激光显微切割分离。
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摘要
摘要
从人胎儿脑组织中分离的神经前体细胞（NPCs）在表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）存在的增殖条件下扩增，以获得充足的细胞来源。通过在多聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白包被的培养皿中，使用一种新型组合——神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、二丁酰环磷酸腺苷（DBC）和视黄酸诱导NPCs分化，从而获得富含神经元的培养物。此外，在无神经营养因子、DBC和视黄酸，但含有睫状神经营养因子（CNTF）的条件下诱导NPCs分化，以获得富含星形胶质细胞的培养物。对分化的NPCs进行免疫荧光染色，检测一系列神经元标志物，包括NeuN、突触素（synapsin）、乙酰胆碱酯酶、突触素蛋白（synaptophysin）和GAP43。在10–15%的分化NPCs中检测到星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和STAT3。为了便于对特定细胞类型进行分子表征，采用激光显微切割技术分离培养在聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片上的神经元。本研究中描述的方法为深入理解神经退行性病变的分子机制提供了有价值的工具。
引言
已知成年哺乳动物大脑的侧脑室室下区和齿状回颗粒下层存在终生神经发生现象1。起源于这些区域的神经前体细胞（NPCs）是多能细胞，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞2。由于NPCs在治疗多种神经退行性疾病（包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脑卒中和阿尔茨海默病（AD））患者中的潜在移植价值，已引起广泛关注3。目前对NPCs的研究主要集中在移植应用方面，而利用NPC来源的神经元作为细胞培养模型来阐明神经退行机制的潜力尚未得到充分开发。以往研究通常采用从啮齿类动物脑组织中分离的终末分化神经元，但由于这些细胞不具备自我更新能力，每次实验均需重新分离。尽管包括SH-SY5Y和SK-N-MC在内的人类神经母细胞瘤细胞系可进行扩增，但其并不具备原代神经元的特性。相比之下，人类NPCs兼具两种优势：既可进行多代扩增，又可诱导分化为具有原代神经元特征的细胞群体4,5。在本研究中，我们描述了一种新的分化方案，旨在从商业获取的人类胎儿脑来源NPCs中获得稳定且富含神经元的细胞群体。由于这些培养物中仍含有少量胶质细胞，因此需要额外的方法以分离出用于分子表征的纯神经元群体。激光捕获显微切割（LCM）是一种可从组织切片中选择性捕获均一细胞群体以进行基因表达分析的新型技术6。脑组织具有高度异质性，包含神经元、胶质细胞及其他多种细胞类型。LCM已被用于开展神经元特异性基因表达分析7-10。我们此前曾对阿尔茨海默病（Tg2576）模型小鼠脑切片中的海马神经元进行LCM分析，证实海马神经元中环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达显著降低11。在本研究中，我们详细描述了人类NPCs的扩增、神经元定向分化、神经元标志物的免疫荧光染色以及在PEN膜载玻片上培养的神经元进行LCM分离的操作流程。
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方案
1. 人类NPCs的扩增（图1）
- 复苏来自胎儿脑组织的人类NPC冻存株（Lonza，Walkersville，MD，USA），并在T-75培养瓶中以悬浮培养方式培养为神经球（neurospheres）图1A在含有增殖补充剂、EGF（10 ng/ml）和FGF（10 ng/ml）的Neurobasal培养基中。
- 培养3天后，将神经球转移至15 ml离心管中，以500 rpm离心5分钟。
- 弃去上清液，保留约 100 μ轻轻吸去细胞沉淀上方的培养基，并转移至一个Eppendorf管中。100 μ1个细胞沉淀足以分至2个T-75培养瓶中。若细胞量较少，则应减少培养瓶数量，因为神经前体细胞在接种过稀时无法有效增殖。
- 用200 μL枪头吹打重悬沉淀 μl 提示 50x，同时保持 200 μ将枪头轻触管底，将细胞悬液均分为两部分，分别加入两个T-75培养瓶（1-2传代），一个用于继续扩增，另一个用于诱导分化。
- 继续培养神经前体细胞以进行扩增（第一代培养瓶），每4-5天更换一次培养基，直至神经球恢复至原始大小（300-500） μm. 通过离心（500 rpm；5 分钟）更换培养基，弃去旧培养基并加入新培养基。
2. 人类NPCs向富含神经元的培养物分化（图2）
- 为使神经前体细胞分化为富含神经元的培养物，将单个盖玻片放入24孔板的每个孔中，并通过向每孔加入500 μl的100 μg/ml多聚-L-赖氨酸进行包被。在室温下孵育30分钟。
- 吸除多聚-L-赖氨酸溶液，并用无菌水冲洗孔板。
- 接着，用500 μl浓度为5 μg/ml的小鼠层粘连蛋白对孔板孔进行包被，并孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤各孔。
- 在细胞传代后第4天（步骤1.4），将标记为“用于分化”的培养瓶中的小型神经球转移至已包被的培养孔中，密度约为每孔500个神经球（24孔板）。
- 6小时后，当神经球已贴附于培养皿时，移除增殖培养基，并加入含神经基础培养基、B27添加剂、NGF（20 ng/ml）、BDNF（10 ng/ml）、DBC（100 mM）和视黄酸（2 μM）的分化培养基。
3. 分化后NPCs的免疫荧光染色（图3）
- 神经前体细胞在神经元分化培养基中培养两周后，可获得富含神经元的培养物。用 PBS 清洗神经元一次，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。固定后，用 PBS 再清洗细胞三次。
- 将细胞在室温下用透化缓冲液（含 5% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 PBS）孵育 60 分钟。
- 将培养皿在 4 °C 条件下于摇床上与以下多克隆和单克隆抗体组合在含 3% BSA 的 PBS 中共同孵育过夜：NeuN (1:250) 和 synapsin (1:250)；乙酰胆碱酯酶 (1:500) 和 synaptophysin (1:250)；BDNF (1:500) 和 GAP43 (1:250)；STAT3 (1:500) 和 GFAP (1:1,000)。
- 用 PBS 清洗盖玻片三次，然后在避光条件下于室温下用抗兔 Cy3 和抗小鼠 FITC 二抗孵育 90 分钟。孵育结束后，再用 PBS 清洗盖玻片三次。
- 在载玻片上滴加 10 μl 封片介质，用镊子从培养皿中取出盖玻片，倒置放在封片介质上。轻轻擦去多余的封片介质，并用指甲油封固边缘。
- 在荧光显微镜下观察免疫染色的神经元。
4. 神经元的激光捕获显微切割（图4）
- 按照图2所述步骤，在涂有聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白的PEN膜载玻片上将NPCs分化为富含神经元的培养物。
- 后续所有步骤均需在无RNA酶条件下进行。
- 使用HistoGene染色试剂（Arcturus）对培养物进行染色，以观察细胞形态。
- 利用Veritas LCM系统获取整个载玻片的路线图图像，找到不含星形胶质细胞的纯神经元区域，并使用绘图工具标记神经元。
- 通过计算机控制的精确定位与自动化程序，分两步进行激光显微切割。首先，以70 mW激光功率和2,500 μsec脉冲发射红外线（IR），使膜与帽盖粘附；随后，使用紫外切割工具在10 mV低电压设置下切除已标记区域。
- 上述过程组合可选择性地将PEN膜上标记的区域捕获至CapSure LCM宏观帽盖上。当帽盖被提起时，带有神经元的膜即附着于帽盖。
- 使用PicoPure RNA提取试剂盒（Arcturus）从LCM样品中提取总RNA，并用DNase处理。
- 按照试剂盒说明书，使用RiboAMP RNA扩增试剂盒对提取的RNA进行扩增。
- 采用TaqMan探针进行实时RT-PCR分析，检测人神经丝重链（hNFHc）的表达。
缩写：
AD，阿尔茨海默病；BDNF，脑源性神经营养因子；CREB，环磷酸腺苷反应元件结合蛋白；DBC，二丁酰环磷酸腺苷；EGF，表皮生长因子；FGF，成纤维细胞生长因子；GFAP，胶质纤维酸性蛋白；LCM，激光捕获显微切割；NGF，神经生长因子；NPC，神经前体细胞；PEN，聚萘二甲酸乙二醇酯。
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结果
神经前体细胞的扩增（图 1）
当通过吹打将神经球解离为单细胞悬液时，移液枪头需接触管底，以便在反复吹打悬液时产生一定阻力。吹打次数因操作者而异，需通过显微镜下观察所得细胞悬液的情况，经反复试验后确定。提供足够的细胞悬液密度至关重要，因为当神经前体细胞（NPCs）紧密接触时，其增殖速度会更快。如果NPCs生长不良，应通过减少培养瓶数量来提高细胞密度。我们已成功将神经球扩增传代10-15次，从而可大量获得人源NPCs，减少对人胎儿组织的依赖。为了持续获得NPCs和神经元，建议最初扩增3-4代，随后将一半NPCs继续以神经球形式扩增，另一半则进行分化以满足持续实验需求。或者，也可将NPCs进行更多代次的扩增，参照细胞系的方法冻存于液氮中，以建立更大规模的细胞库，并在需要时复苏使用。建议使用来自不同批次NPCs所分化的神经元进行实验。
神经前体细胞的神经元分化（图2）
神经前体细胞（NPCs）具有多向分化潜能，可根据培养条件...
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讨论
本研究描述了一种通过诱导自我更新的人类神经前体细胞分化获得富含神经元的细胞培养模型，以及利用激光显微切割技术分离纯神经元群体的方法。我们采用NGF、BDNF、DBcAMP和视黄酸的组合诱导NPCs向神经元分化。其中DBcAMP用于激活CREB——一种可促进神经发生的转录因子12。视黄酸可诱导细胞周期退出并减少胶质细胞比例13。本研究所述方法在我们先前报道的基础上进行了改进14。此前我们曾将神经球经吹打制成单细胞悬液后再接种至包被培养皿中，但这种方法可能导致低密度区域神经元分化效率低下（图2E）。目前我们改用接种培养4天的小型神经球（图1B），以确保分化中的神经元之间形成有效接触（图1C）。此外，在接种后4-5天，将原用的分化添加剂（Stem Cell Technologies）替换为B27添加剂（Invitrogen）。当前方法可稳定获得80-90%的神经元比例。这些具有广泛突起网络的神经元可在体外培养中维持2-3个月，相较于由人源神经母细胞瘤细胞系分化所得的神经元模型具...
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披露
无任何利益冲突需要声明。
致谢
本工作由退伍军人事务部（授予 S.P.）的优异评审基金（NEUD-004-07F）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 神经前体细胞（NPCs） | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A 人基础培养基 | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A 增殖添加剂 | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A 分化添加剂 | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 添加剂（50倍浓缩） | Invitrogen | 17504-044 | |
| 人表皮生长因子 | Stem cell technology | 2633 | |
| 成纤维细胞生长因子 | Sigma | F0291 | |
| 脑源性神经营养因子 | Cell signaling | 3897S | |
| 神经生长因子 | Invitrogen | 13257-019 | |
| 二丁酰环磷酸腺苷 | Sigma | D-0627 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P-5899 | |
| 小鼠层粘连蛋白 | Sigma | L-2020 | |
| 视黄酸 | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 抗体 | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP 抗体 | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 抗体 | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF 抗体 | Millipore | AB1534SP | |
| 乙酰胆碱酯酶抗体 | Santz cruz | Sc-11409 | |
| 突触素抗体 | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN 抗体 | Chemicon | MAB377 | |
| 突触蛋白抗体 | Novus | NB300-104 | |
| 抗小鼠 FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| 抗兔 Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| 多聚甲醛 | Fisher | 4042 | |
| 盖玻片（大圆盖玻片） | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| 封片剂（Prolong Gold） | Invitrogen | P36930 | |
| Pen 膜 | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM 冷冻切片染色试剂盒 | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA 扩增试剂盒 | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA 提取试剂盒 | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM 收集帽 | Applied biosystems | LCM0211 |
参考文献
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
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