方法文章

神经元的分化的人类Neuroprogenitor细胞培养激光捕获显微切割

DOI：

10.3791/50487

⸱

2013年9月16日

 ,  , 
1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine

本文内容

摘要

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人类neuroprogenitor细胞（的NPC）增殖的条件下扩大。的NPC分化成神经营养因子中的组合的存在下神经元的富培养物。用免疫组化法检测神经元标志物。为了分离神经元的纯人口的NPC分化的PEN膜幻灯片并进行激光捕获显微切割。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroprogenitor细胞（的NPC）从人胎脑分离出的表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF），以提供细胞的大量供应的存在下增殖的条件下展开。的NPC分化中的神经生长因子（NGF）的新组合的存在下，脑源性神经营养因子（BDNF），丁酰腺苷（DBC）与上餐盘涂有聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白 - 视黄酸，以获得神经元丰富的文化。的NPC也有区别在缺乏神经营养因子，DBC和视黄酸和睫状神经营养因子（CNTF），得到星形胶质细胞培养丰富的存在。差异化的NPC的特点是免疫荧光染色的神经元标志物，包括的NeuN，突触素，乙酰胆碱酯酶，突触素及GAP43面板。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和STAT3，星形胶质细胞标志物，在分化的NPC的10-15％进行检测。为了便于细胞类型特异性分子鉴定，激光捕获显微切割进行分离神经元的聚乙烯酯（PEN）膜的载玻片培养。在这项研究中所描述的方法提供了有价值的工具，以促进我们的神经变性的分子机制的理解。

引言

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寿命长的神经发生是已知发生在侧脑室的脑室下区和在成年哺乳动物脑1的齿状回的颗粒下层。 Neuroprogenitor细胞（的NPC）来自这些地区的起源是多能细胞，它可以分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞2。的NPC所产生的，因为其潜在的患者的各种神经变性疾病，包括帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，中风和阿尔茨海默氏病（AD）的3到被移植的兴趣。与研究的NPC一般都集中在这个移植的角度，但NPC来源的神经元的细胞培养模型，以确定神经退行性病变的机制的潜力还没有得到充分发挥。以前的研究一般用有丝分裂后的神经元从啮齿动物脑组织中需要被分离为每个实验中分离，因为它们是不自我更新。虽然人类成神经细胞瘤细胞系包括SH-SY5Y和SK-N-MC细胞可以扩展，它们不具有原代神经元的特征。人类的NPC，在另一方面，提供了两者的优点，因为它们可以被扩展为多通道，并且可以分化产生的细胞群体与原代神经元4,5的特性。在目前的研究中，我们描述了一种新的分化方案，从人胎脑分离市售的NPC获得一致的神经元的富人口。因为这些文化都包含一个小的百分比胶质细胞，我们需要更多的方法来分离神经元的分子鉴定纯人口。激光捕获显微切割（LCM）是一种新颖的技术，其中来自组织切片的细胞同源性的群体可以被选择性地捕获用于基因表达分析6。大脑是一个异类组织包括神经元，神经胶质细胞和其他细胞TYPES。 LCM被用于确定神经元特异性基因表达分析7-10。之前我们已经进行海马神经元的LCM从公元（Tg2576转）鼠脑切片，专门用于显示在海马神经元11表达降低的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）和BDNF。在本研究中，我们描述了人类的NPC的扩大，神经元分化，免疫荧光染色神经元标志物及LCM神经元对PEN膜玻片培养的分离程序。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。扩展人类的NPC（ 图1）

  1. 重振胎儿脑（龙沙，Walkersville，MD，USA），并将它们悬浮培养中的T-75瓶中含有增殖补充，表皮生长因子（10毫微克/毫升）的神经球（ 图1A）的Neurobasal培养基人类的NPC的冷冻股票和FGF（10纳克/毫升）。
  2. 后在培养3天后，将神经球转移到15毫升管中，离心分离机，在500 rpm离心5分钟。
  3. 弃去上清液留下〜100μl的培养基上的细胞沉淀，并转移到Eppendorf管中。将100μl细胞沉淀，就足以分裂成2个T-75瓶。如果少，减少瓶中的数量作为neuroprogenitor细胞不能增殖，如果分割薄。
  4. 磨碎的沉淀用200μl的尖端50倍，同时保持对管底部的200μl的小费。分裂细胞悬液平均分成两部分，并将它们添加到2个T-75瓶（1-2分），一个用于继续扩张，另一个用于分化。
  5. 通过改变培养基每4-5天，直到神经球达到300-500微米原始大小继续neuroprogenitor细胞扩张（第一瓶）的培养。通过离心改变介质（500转，5分钟），弃去旧培养基，并添加新的媒介。

2。分化人类的NPC成神经元丰富的文化（ 图2）

  1. 为分化neuroprogenitor细胞向神经元丰富的文化，将单盖玻片到24孔板中并涂覆有聚-L-赖氨酸的100微克/毫升的各孔中加入500微升每孔。孵育菜在室温30分钟。
  2. 吸出聚-L-赖氨酸溶液中，用无菌水漂洗该板。
  3. 接着，涂层的钢板用500μl的5μg/ ml的小鼠层粘连蛋白的孔中并孵育30分钟。孵育后，洗井用PBS。
  4. splitti后4天毫微小区（步骤1.4），转移将烧瓶中的小神经球标记为"对于分化'到包被的培养皿以每孔〜500的神经球在24孔平板的密度。
  5. 6小时后，当神经球附着到培养皿，取出增殖培养基中，并添加选自Neurobasal培养基的分化培养基，B27添加剂，NGF（20纳克/毫升），BDNF（10毫微克/毫升）中，DBC（100毫米），和视黄酸（2μM）。

3。差异化的NPC的免疫荧光染色（ 图3）

  1. 以下neuroprogenitor细胞在神经分化培养基中两周的培养时，获得一个神经元的富培养。冲洗的神经元一旦在PBS中，然后修复它们在4％多聚甲醛30分钟。一旦固定，冲洗细胞三次，用PBS。
  2. 孵育的细胞用透化缓冲液（5％BSA和0.2％的Triton X-100的PBS中）在室温下60分钟。
  3. 孵育菜O / N在4°C I呐振动筛与多克隆和单克隆抗体的PBS中3％BSA的下列组合:突触素（1:250）的NeuN（1:250）和;乙酰胆碱酯酶（1:500）和突触素（1:250），BDNF（1 :500）和GAP43（1:250），STAT3（1:500）和GFAP（1:1,000）。
  4. 用PBS洗涤盖玻片3次，然后孵育它们与抗兔Cy3和抗小鼠FITC二抗在室温下在黑暗中90分钟。孵育后，用PBS洗涤盖玻片3次。
  5. 将10微升安装介质的载玻片上，取出盖玻片从培养皿用镊子，并把它倒挂在安装介质上。轻轻擦掉多余的安装介质和密封的边缘与指甲油。
  6. 检查荧光显微镜的免疫染色的神经元。

4。神经元的激光捕获显微切割（ 图4）

  1. 分化的NPC成神经元丰富的文化对PEN膜幻灯片š以下对于图2中描述的方法用聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白。
  2. 执行无RNA酶的条件下，所有后续步骤。
  3. 使用HistoGene染色（大角星），以可视化的细胞染色的文化。
  4. 发现纯神经元群体缺乏使用与Veritas LCM系统的整个幻灯片的路线图图像星形胶质细胞等领域。使用绘图工具标记的神经元。
  5. 执行使用计算机控制的精确度和自动化在一个两步骤过程中，这些区域的激光捕获。首先，IR（红外线）被射向多点为70毫瓦和2500微秒的脉冲激光功率设置，以获得膜附着到帽。接着，标记区域使用的UV刀具以10毫伏的低级别设置切除。
  6. 这些工艺的组合选择性地捕获从PEN膜标记区域到CAPSURE LCM宏观帽。当盖子被提起，与n的膜eurons附着到帽。
  7. 提取总RNA的使用PicoPure RNA提取试剂盒（大角星），LCM样品和治疗用DNase。
  8. 使用RiboAMP RNA扩增试剂盒，按照从试剂盒说明书扩增分离出的RNA。
  9. 利用TaqMan探针来检测人神经丝重链（华南金控）进行实时定量RT-PCR分析。

缩写:

AD，阿尔茨海默氏病; BDNF，脑源性神经营养因子; CREB，环AMP应答元件结合蛋白; DBC，双丁酰环腺苷酸; EGF，表皮生长因子; FGF，成纤维细胞生长因子; GFAP，神经胶质纤维酸性蛋白; LCM，激光捕获显微切割，神经生长因子，神经生长因子，全国人大代表，neuroprogenitor细胞，PEN，聚萘二甲酸。

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结果

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扩展的NPC（ 图1）

当神经球被分解为单细胞悬浮液通过研磨，枪头需要触摸在管的底部，以便有当将悬浮液用移液管上下一些阻力。中研磨的次数将个体，需要通过反复试验通过在显微镜下检查所得到的细胞悬液决定之间变化。关键是要提供细胞悬液足够的密度，因为扩散会以更快的速度，当的NPC都在密切接触。如果的NPC不生长，细胞密度应增加减少瓶中的数量。我们已经能够扩大神经球长达10-15通道。可以生成人体的NPC的供应因此充裕，减少了使用人类胚胎组织。对于持续供应的NPC和神经元，最好是一开始扩大他们的3-4通道，随后，一半的NPC可以被扩展为神经球，而另一半可以分化为正在进行的实验。或者，的NPC也可以扩展为多通道，冷冻在液氮中的细胞系的情况下，生成供给股的直径，并在需要时恢复。还希望与来自的NPC不同批次衍生的神经元进行实验。

的NPC的神经元分化（ 图2）

的NPC是多能细胞，并且可以分化成神经元，星形胶质细胞少突胶质细胞或根...

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讨论

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我们在本研究中通过自我更新的人neuroprogenitor细胞分化神经元丰富的细胞培养模型和方法，通过激光捕获显微切割分离神经元的纯人口。我们已经使用了NGF，BDNF，DBC和视黄酸对的NPC的神经元分化的组合。 DBC是用来激活CREB，增强神经发生12的转录因子。维甲酸诱导细胞周期退出和减少胶质人口13。在这项研究中所描述的方法采用修改过我们之前的报告14。我们早先用捣碎的神经球，以单细胞悬浮液，然后播种它在包被的培养皿上的步骤。这可导致在低浓度（ 图2E）的区域低效的神经细胞的分化。我们现在已经推出了播种四日龄小神经球（ 图1B），以确保不同点之间的联系的过程婷神经元（ 图1C）。此外，分化补充剂（干细胞技术）被替换为B27添加物（Invitrogen）中，播种后4-5天。目前的方法产生80-90％的神经元一致。这些神经元具有广泛的流程网络可以维持在培养2-3个月，超过从人成神经细胞瘤细胞系的分化得到的神经元模型中具有明显的优势。免疫染色几个神经元标记物，包括神...

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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这项工作是由退伍军人管理局优异审查补助金（NEUD-004-07F）（以SP）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
神经祖细胞 （NPC） LonzaPT-2599
Neurocult NS-A 人基础培养基干细胞技术5750
Neurocult NS-A 增殖补充剂干细胞技术5753
Neurocult NS-A 分化补充剂干细胞技术5754
B-27 补充剂 （50x） Invitrogen17504-044
人表皮生长因子干细胞技术2633
成纤维细胞生长因子 SigmaF0291
脑源性神经营养因子 细胞信号传导3897S
神经生长因子 Invitrogen13257-019
环腺苷酸二丁酰AMP SigmaD-0627
聚-L-赖氨酸 SigmaP-5899
小鼠层粘连蛋白 SigmaL-2020
视黄酸SigmaR-2625
STAT3 抗体细胞信号传导9132
GFAP 抗体细胞信号传导3670
GAP43 抗体转导实验室612262
BDNF 抗体MilliporeAB1534SP
乙酰胆碱酯酶抗体 Santz cruzSc-11409
突触素抗体Abcamab18008-50
NeuN 抗体ChemiconMAB377
突触素抗体NovusNB300-104
抗小鼠 FITCJackson Immuno115-095-146
研究实验室
抗兔 Cy3Jackson Immuno711-165-152
研究实验室
BSASigmaA1653
Triton-X 100Acros21568-2500
Paraformaldehye Fisher4042
盖玻片（大圆圈盖玻片）Fisherbrand12-545-102
封固剂 （Prolong Gold）InvitrogenP36930
笔膜Applied biosystemsLCM0521
Histogene LCM 冰冻切片染色试剂盒Applied biosystemsKIT0401
RiboAmp RNA 扩增试剂盒Applied biosystemsKIT0201
Picopure RNA 分离试剂盒Applied biosystemsKIT0202
CapsureMacro LCM 帽Applied biosystemsLCM0211
基

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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