利用数字同轴全息显微镜（DIHM），可唯一确定弱散射物体的三维位置，该方法仅需对标准显微镜进行微小改造。我们的软件结合了简单的成像启发式算法与瑞利-索末菲反向传播法，以获得微观相位物体的三维位置和几何结构。
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本文内容
摘要
摘要
在显微镜观察中，经常遇到弱散射物体，例如小胶体颗粒和大多数生物细胞。事实上，已有多种技术被开发用于更好地可视化这些相位物体，其中相衬显微镜和微分干涉差（DIC）是最常用的增强对比度的方法。然而，对成像平面外方向上物体的位置和形状进行记录仍然具有挑战性。本报告介绍了一种简单的实验方法，利用数字同轴全息显微术（DIHM）准确测定物体在三维空间中的位置和几何形态。总体而言，可探测的样品体积在横向由相机传感器尺寸决定，在轴向则由照明光源的相干性决定。使用LED照明时，典型的样品体积范围为200 µm × 200 µm × 200 µm，而使用激光照明时可达5 mm × 5 mm × 5 mm或更大。照明光被配置为平面波入射到样品上。样品体积内的物体随后散射光线，散射光与未散射光发生干涉，在垂直于照明方向的平面上形成干涉图样。该图像（即全息图）包含了三维重建所需的深度信息，可被CMOS或CCD相机等标准成像设备捕获。采用瑞利-索末菲反向传播法对显微图像进行数值重聚焦，并结合基于Gouy相位异常的简单成像启发式方法，识别重建体积中的散射物体。这种简单而稳健的方法实现了对显微样品中物体位置和形状的明确、无需模型假设的测量。
引言
数字同轴全息显微技术（DIHM）能够在对标准显微镜装置进行最小化改造的前提下，实现对游泳微生物1,2和软物质系统3,4等微观样品的快速三维成像。本文围绕本实验室开发的软件，提供了一个关于DIHM的教学演示。文中包括显微镜的搭建方法、数据采集的优化，以及如何处理所记录的图像以重建三维数据的详细说明。相关软件（部分基于D.G. Grier及其他研究者开发的软件5）和示例图像均可在我们的网站上免费获取。本文还描述了配置显微镜、从全息图重建三维体积，并利用免费的光线追踪软件包渲染感兴趣体积所需的具体步骤。最后，文章讨论了影响重建质量的各种因素，并将DIHM与其它竞争性方法进行了比较。
尽管数字全息显微技术（DIHM）早在一段时间前就已被描述（有关其原理与发展的综述，参见Kim6），但此前由于所需的计算能力和图像处理专业知识较为复杂，该技术的使用主要局限于专注于仪器开发的专业研究团队。随着计算技术和相机技术的最新进展，这一状况正在发生变化。现代台式计算机已能够轻松满足数据处理和存储需求；大多数显微镜实验室都配备了CCD或CMOS相机；并且一些投入大量时间开发该技术的研究团队已开始在网络上免费提供所需软件。
人们已提出多种方案，用于对三维样本体积中的微观物体构型进行成像。其中许多属于扫描技术7,8，通过机械移动成像平面穿过样....
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方案
1. 设置与数据采集
- 从冻存菌种中在 KTY 培养基中培养 Streptococcus 菌株 V4051-197（光滑游动型）细胞22。在 35 °C、150 rpm 条件下，于摇床中过夜培养至饱和。
- 取 500 µl 饱和培养物接种于 10 ml 新鲜 KTY 培养基中。在 35 °C、150 rpm 条件下继续培养 3.5 小时，直至细胞在 λ=600 nm 处的光密度值达到约 1.0（约 5 × 108 个细胞/ml）。
- 用新鲜培养基按 1:400 比例稀释，以获得最终的可动细胞浓度。
- 在显微镜载玻片上，用润滑脂（例如 注射器中的凡士林）围绕中心位置制作一个约 1 mm 高的环形屏障，并在中央滴加一滴样品溶液。盖上盖玻片，轻轻按压边缘以密封，确保液体与载玻片和盖玻片均接触。最终形成的样品池深度应约为 100–200 µm。
- 将样品池置于显微镜载物台上，使盖玻片朝下，并小心操作，避免在盖玻片与物镜之间的油中产生气泡。
- 将显微镜聚焦于样品池的底部表面，并调节聚光镜至聚焦状态。
- 关闭标准照明光源，将 LED 光源置于显微镜聚光镜孔径后方，并将 LED 电源调至最大输出功率。
- 将聚光镜孔径完全关闭，必要时轻微移动 LED 固定装置，使照明光束对准物镜孔径中心。
- 开启计算机和....
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结果
为了展示数字全息显微镜（DIHM）的功能，实验以一串链球菌（Streptococcus）细菌为对象进行。该菌链本身长度为10.5 mm，由6至7个近似球状-柱状的细胞组成（其中两个细胞接近分裂状态），细胞直径范围为0.6–1 μm。图1a和1b展示了重建与渲染软件的主界面。图2显示了数值重聚焦过程的示例，其中已应用空间带通滤波器。图3展示了梯度滤波器对图2中图像的处理效果。用于生成这两幅图像的原始数据已随代码下载包提供，作为示例帧108。最后，图4展示了高质量与低质量数据对重建几何结构的影响。该图中的两个帧均来自同一串细胞的视频（与前两幅图中的菌链不同）。在大多数情况下均可实现良好的重建效果，但当菌链以端面朝向光轴时，重建失败，导致在焦平面上呈现一个较大的圆形物体。这种失效模式是沿光轴方向取向物体的典型特征。为提供尺寸参考，在计算机渲染图像中，地面方格的边长为1 µm。关于该方法精度与准确性的更详细讨论，读者可参考Wi.......
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讨论
本实验方案中最重要的步骤是从稳定的实验装置中准确采集图像。若背景数据质量不佳，则几乎无法实现高保真度的重构。还应避免使用带有内置相差元件的物镜（从物镜后端观察时可见一个暗环状结构），因为这会降低重构图像的质量。待测物体应距离焦平面足够远，使其图像中可见数对衍射条纹（一个合适的经验准则是：离焦图案的线性尺寸约为聚焦物体的10倍——参见示例数据）。物体若过于接近焦平面，则会出现孪像和采样伪影，如前所述。此外，准确表征相机的像素间距也非常重要，因为这是正确确定重聚焦距离的关键因素。通常，相机的技术文档会在规格中列出“像素尺寸”；但这可能略显模糊，因为某些类型的相机（特别是CMOS相机）像素之间的区域存在较大面积的非感光区域。获取该参数最可靠的方法是使用标准校准标样（例如USAF 1951分辨率测试板），并通过图像直接测量采样频率（每微米的像素数）。
在单色照明条件下，数字全息显微（DIHM）系统的分辨率最终由物镜的数值孔径（NA）和照明光波长（λ）决定23,24。若要实现横向分离点的分辨，两点之间的距离至少应为 Δlat=λ/2NA。类似地，在.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢Linda Turner在微生物制备方面的协助。RZ和LGW的研究由哈佛大学罗兰研究所资助，CGB由巴西科学无国界计划下的CAPES基金会作为学者资助（项目编号 # 7340-11-7）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 尼康Eclipse Ti-E倒置显微镜 | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | 发射波长 λ=660 nm，线宽约20 nm |
| LED电源 | Thorlabs | LEDD1B | |
| 螺纹适配器 | Thorlabs | SM2T2 | |
| 螺纹适配器 | Thorlabs | SM1A2 | |
| 图像采集卡 | EPIX | PIXCI E4 | |
| 高速CMOS相机 | Mikrotron | MC-1362 |
参考文献
- Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
- Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R.
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重印与许可
