弱散射样品的数字同轴全息显微术

摘要

利用数字同轴全息显微镜（DIHM），可唯一确定弱散射物体的三维位置，该方法仅需对标准显微镜进行微小改造。我们的软件结合了简单的成像启发式算法与瑞利-索末菲反向传播法，以获得微观相位物体的三维位置和几何结构。

摘要

在显微镜观察中，经常遇到弱散射物体，例如小胶体颗粒和大多数生物细胞。事实上，已有多种技术被开发用于更好地可视化这些相位物体，其中相衬显微镜和微分干涉差（DIC）是最常用的增强对比度的方法。然而，对成像平面外方向上物体的位置和形状进行记录仍然具有挑战性。本报告介绍了一种简单的实验方法，利用数字同轴全息显微术（DIHM）准确测定物体在三维空间中的位置和几何形态。总体而言，可探测的样品体积在横向由相机传感器尺寸决定，在轴向则由照明光源的相干性决定。使用LED照明时，典型的样品体积范围为200 µm × 200 µm × 200 µm，而使用激光照明时可达5 mm × 5 mm × 5 mm或更大。照明光被配置为平面波入射到样品上。样品体积内的物体随后散射光线，散射光与未散射光发生干涉，在垂直于照明方向的平面上形成干涉图样。该图像（即全息图）包含了三维重建所需的深度信息，可被CMOS或CCD相机等标准成像设备捕获。采用瑞利-索末菲反向传播法对显微图像进行数值重聚焦，并结合基于Gouy相位异常的简单成像启发式方法，识别重建体积中的散射物体。这种简单而稳健的方法实现了对显微样品中物体位置和形状的明确、无需模型假设的测量。

引言

数字同轴全息显微技术（DIHM）能够在对标准显微镜装置进行最小化改造的前提下，实现对游泳微生物^1,2和软物质系统^3,4等微观样品的快速三维成像。本文围绕本实验室开发的软件，提供了一个关于DIHM的教学演示。文中包括显微镜的搭建方法、数据采集的优化，以及如何处理所记录的图像以重建三维数据的详细说明。相关软件（部分基于D.G. Grier及其他研究者开发的软件⁵）和示例图像均可在我们的网站上免费获取。本文还描述了配置显微镜、从全息图重建三维体积，并利用免费的光线追踪软件包渲染感兴趣体积所需的具体步骤。最后，文章讨论了影响重建质量的各种因素，并将DIHM与其它竞争性方法进行了比较。

尽管数字全息显微技术（DIHM）早在一段时间前就已被描述（有关其原理与发展的综述，参见Kim⁶），但此前由于所需的计算能力和图像处理专业知识较为复杂，该技术的使用主要局限于专注于仪器开发的专业研究团队。随着计算技术和相机技术的最新进展，这一状况正在发生变化。现代台式计算机已能够轻松满足数据处理和存储需求；大多数显微镜实验室都配备了CCD或CMOS相机；并且一些投入大量时间开发该技术的研究团队已开始在网络上免费提供所需软件。

人们已提出多种方案，用于对三维样本体积中的微观物体构型进行成像。其中许多属于扫描技术^7,8，通过机械移动成像平面穿过样本，记录一系列图像堆栈。共聚焦荧光显微镜可能是其中最为人熟知的示例。通常，向相位物体中添加荧光染料以获得足够的样本对比度，并利用共聚焦结构实现荧光发射的空间定位。该方法已取得显著进展，例如在胶体科学领域，使研究人员能够获取拥挤体系的三维动力学信息^9-11。使用标记物是荧光共聚焦显微镜与数字全息显微镜（DIHM）之间的一个重要区别，但这两种技术的其他特征也值得比较。DIHM在速度上具有显著优势，因其装置不含运动部件。共聚焦系统中的机械扫描镜限制了数据采集速率的上限——对于512 × 512像素的图像，通常约为每秒30帧。通过在帧间物理移动样本台或物镜，可获得来自不同焦平面的图像堆栈，从而实现每秒约一体积（30帧）的最终采集速率。相比之下，基于现代CMOS相机的全息系统在相同图像尺寸和分辨率下可达到每秒2000帧的采集速度；每帧图像均可“离线”处理，以获得样本体积的独立快照。需要重申的是：DIHM无需使用荧光样本，尽管已有系统实现了对荧光样本的全息重建¹²。除了提供三维体积信息外，DIHM还可用于生成定量相位对比图像¹³，但这超出了本文讨论的范围。

原始DIHM数据图像为二维图像，在某些方面看起来类似于标准显微镜图像，但处于失焦状态。DIHM与标准明场显微镜的主要区别在于视场中物体周围存在的衍射环；这些衍射环源于照明光源的特性。DIHM所需的光源比明场显微镜更具相干性，通常使用LED或激光器。全息图中的衍射环包含了重建三维图像所需的信息。解释DIHM数据主要有两种方法：直接拟合和数值重聚焦。第一种方法适用于已知衍射图样数学形式的情况^3,4；该条件仅适用于少数结构简单的物体，例如球体、圆柱体和半平面障碍物。当已知物体的轴向位置时，也可采用直接拟合方法，此时可通过图像模板查找表对图像进行拟合¹⁴。

第二种方法（数值重聚焦）更具通用性，其原理是利用二维全息图中的衍射环，对样品体积内多个（任意间距的）焦平面处的光学场进行数值重构。目前存在多种实现该方法的相关技术⁶；本研究采用 Lee 和 Grier⁵ 所述的瑞利-索末菲反向传播技术。该过程的结果是一组图像堆栈，可模拟手动调节显微镜焦平面的效果（因此称为“数值重聚焦”）。在生成图像堆栈后，必须确定被观测对象在焦体中的位置。已有若干图像分析经验方法（如局部强度方差或空间频率含量）被提出，用于量化样品不同位置处的聚焦清晰度¹⁵。在各种方法中，当某一特定图像度量达到最大值（或最小值）时，即认为该物体处于聚焦状态。

与其他旨在确定物体处于“聚焦”状态的特定焦平面的方法不同，本研究中的方法能够识别出位于感兴趣物体内部的点，这些点可能分布在较宽范围的焦平面内。该方法适用于多种样本，尤其适合延伸状的弱散射样本（相位物体），例如棒状胶体、细菌链或真核生物的鞭毛。在这类样本中，当物体穿过焦平面时，图像对比度会发生变化：当物体位于焦平面一侧时，离焦图像呈现亮中心；当物体位于另一侧时，则呈现暗中心。纯相位物体在恰好位于焦平面时几乎不产生任何对比度。这种对比度反转现象已被其他作者讨论过^16,17，其根本原因在于Gouy相位异常¹⁸。在全息成像的背景下，该现象已有更严格的理论阐述，并对技术的局限性进行了评估；通常情况下，每个方向上的位置不确定度约为150 nm（约一个像素）¹⁹。Gouy相位异常法是目前少数几种定义明确的数字同轴全息显微（DIHM）方法之一，可用于三维重建延伸状物体的结构，但某些物体仍难以准确重建。沿光轴方向（指向相机方向）分布的物体难以精确重建；此时物体长度和位置的不确定性显著增大。这一局限性部分源于记录全息图的像素位深受限（即相机可记录的不同灰度级数量有限）。另一种具有挑战性的构型是当感兴趣物体非常接近焦平面时。在这种情况下，物体的实像与虚像重建位置十分接近，导致产生复杂的光学场，难以解析。此外，一个相对次要但仍需关注的问题是，所产生的衍射条纹在图像传感器上占据的区域更小，信息粒度更粗，从而导致重建质量下降。

在实际操作中，将简单的梯度滤波器应用于三维重建的体积数据，以检测沿照明方向的强烈强度反转。强度从亮到暗或从暗到亮快速变化的区域，即被识别为散射区域。弱散射物体可被很好地描述为这些散射单元的非相互作用集合。²⁰；这些单独的贡献相加得到总散射场，可利用瑞利-索末菲反向传播方法轻松进行逆变换。本文将轴向强度梯度技术应用于一条链状结构 链球菌属 细胞。细胞体为相位物体（该物种 E. coli 折射率测定²¹ 在波长 λ=589 nm 时为 1.384； 链球菌 应变可能相似），在应用梯度滤波后，在样本体积中表现为高强度的相连斑点链。对该滤波后的体积数据应用标准的阈值分割和特征提取方法，可提取出对应于细胞内部区域的体素（voxels）。该方法的一个显著优势在于，能够明确地重建物体在轴向方向上的位置。类似的方法（至少那些通过显微物镜在靠近物体处记录全息图的方法）则存在无法确定 标志 这种位移的。尽管Rayleigh-Sommerfeld重建方法在此意义上同样与符号无关，但梯度运算使我们能够区分位于焦平面上方和下方的弱相位物体。

方案

1. 设置与数据采集

1. 从冻存菌种中在 KTY 培养基中培养 Streptococcus 菌株 V4051-197（光滑游动型）细胞²²。在 35 °C、150 rpm 条件下，于摇床中过夜培养至饱和。
2. 取 500 µl 饱和培养物接种于 10 ml 新鲜 KTY 培养基中。在 35 °C、150 rpm 条件下继续培养 3.5 小时，直至细胞在 λ=600 nm 处的光密度值达到约 1.0（约 5 × 10⁸ 个细胞/ml）。
3. 用新鲜培养基按 1:400 比例稀释，以获得最终的可动细胞浓度。
4. 在显微镜载玻片上，用润滑脂（例如 注射器中的凡士林）围绕中心位置制作一个约 1 mm 高的环形屏障，并在中央滴加一滴样品溶液。盖上盖玻片，轻轻按压边缘以密封，确保液体与载玻片和盖玻片均接触。最终形成的样品池深度应约为 100–200 µm。
5. 将样品池置于显微镜载物台上，使盖玻片朝下，并小心操作，避免在盖玻片与物镜之间的油中产生气泡。
6. 将显微镜聚焦于样品池的底部表面，并调节聚光镜至聚焦状态。
7. 关闭标准照明光源，将 LED 光源置于显微镜聚光镜孔径后方，并将 LED 电源调至最大输出功率。
8. 将聚光镜孔径完全关闭，必要时轻微移动 LED 固定装置，使照明光束对准物镜孔径中心。
9. 开启计算机和相机，将所有光线引导至显微镜的相机接口。在图像采集软件中调整帧率和图像尺寸。
10. 在保持良好对比度的前提下，将帧曝光时间设置为尽可能短。检查图像强度直方图，确保图像未过曝或欠曝。
11. 必要时重新调焦，使目标物体轻微离焦（通常离焦 10–30 µm）。目标物体与焦平面应处于同一介质中（即 焦平面应位于样品池内部）。

2. 重建

处理数据的第一步是在一系列不同深度上对视频帧进行数值重聚焦，从而生成一幅图像堆栈。可用于此目的的用户友好型软件可在此处获取：http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html，同时提供示例图像（使用倒置显微镜和60倍油浸物镜获取）以及用于光线追踪渲染的场景文件。

1. 在界面的相应输入框中，分别将感兴趣的帧及其对应的背景作为单独的图像文件输入。背景图像应为一个在全息图不存在时能合理代表视频背景的帧，用于抑制可能干扰全息图定位与分析的固定模式噪声。
2. 在运行程序前，输入屏幕左侧全局设置框中的参数值。前三个为输出堆栈参数：第一帧的轴向位置（“起始焦距”）；重建堆栈中的切片数量（“步数”）；堆栈中每一切片之间的轴向距离（“步长”）。
3. 为以正确比例重建物体，步长应与横向像素间距相等。在“像素/微米”框中输入相机的横向采样频率（1/像素间距），在最后两个框中分别输入照明波长和介质折射率。程序的默认值适用于示例数据的重建。
4. 如果全息图中物体中心呈暗色，请按下“翻转Z轴梯度”按钮（详见示例帧2005及讨论部分）。
5. 检查带通滤波器的开启/关闭状态（默认为开启）。该可选带通滤波器位于梯度翻转开关下方的框内，用于抑制噪声像素的贡献。带通滤波器将在每个图像切片生成后立即应用。
6. 检查中间输出开关的开启/关闭状态（默认为开启）。中间分析步骤将写入两个输出视频中，格式为未压缩的.avi文件：第一个为重新对焦的堆栈（文件名以'_stack.avi'结尾），第二个为经过轴向梯度运算后的堆栈（文件名以'_gradient.avi'结尾）。理想情况下，第二个堆栈中目标物体将以明亮物体的形式在暗背景中突出显示。
7. 设置完所有参数后，点击主窗口中的“运行”按钮。所选帧将显示在软件的主框中。
8. 使用图像左侧工具栏中的放大镜工具，通过左键单击放大，按住Shift键并左键单击缩小。使用工具栏中的矩形工具选择感兴趣区域（ROI）。尽可能将全息图的干涉条纹全部包含在矩形区域内，以优化重建效果。
9. 点击“处理”按钮以生成两个图像堆栈。使用ImageJ软件检查生成的堆栈（可从http://rsb.info.nih.gov/ij/免费获取）。若目标物体在梯度图像堆栈中清晰可见，则继续下一步以提取物体坐标。

3. 渲染

1. 除了图像帧重新对焦外，该程序还能定位目标物体中每个体素的 x、y、z 坐标。按下“特征提取”按钮以启用此功能。
2. 输入输出坐标文件的路径，包括扩展名（例如：c:\home\output.inc）。在“输出坐标格式”框中选择“POV-Ray 格式”。此设置将使程序生成一个可用免费 POV-Ray 光线追踪软件包进行可视化的对象文件（该软件可从 http://www.povray.org/ 获取）。
3. 按照上述第 2 节的方法重新处理图像。程序将在选定的感兴趣区域（ROI）内生成一系列 (x, y, z) 坐标，并写入“输出坐标”框中指定的文件名。提取物体坐标所需时间明显长于图像栈的生成时间。
4. 确保示例 POV-Ray 文件（随重建代码提供）与刚生成的坐标文件位于同一文件夹中。编辑该示例 .pov 文件，并将以下行中引号内的文件名
   #include "MYFILE.inc"
   替换为重建代码生成的数据文件名称。
5. 在 POV-Ray 中点击“运行”按钮以渲染位图图像。相机位置、光照和材质选项仅为 POV-Ray 中可自定义设置的一部分；更多细节请参见其在线文档。

结果

为了展示数字全息显微镜（DIHM）的功能，实验以一串链球菌（Streptococcus）细菌为对象进行。该菌链本身长度为10.5 mm，由6至7个近似球状-柱状的细胞组成（其中两个细胞接近分裂状态），细胞直径范围为0.6–1 μm。图1a和1b展示了重建与渲染软件的主界面。图2显示了数值重聚焦过程的示例，其中已应用空间带通滤波器。图3展示了梯度滤波器对图2中图像的处理效果。用于生成这两幅图像的原始数据已随代码下载包提供，作为示例帧108。最后，图4展示了高质量与低质量数据对重建几何结构的影响。该图中的两个帧均来自同一串细胞的视频（与前两幅图中的菌链不同）。在大多数情况下均可实现良好的重建效果，但当菌链以端面朝向光轴时，重建失败，导致在焦平面上呈现一个较大的圆形物体。这种失效模式是沿光轴方向取向物体的典型特征。为提供尺寸参考，在计算机渲染图像中，地面方格的边长为1 µm。关于该方法精度与准确性的更详细讨论，读者可参考Wi...

讨论

本实验方案中最重要的步骤是从稳定的实验装置中准确采集图像。若背景数据质量不佳，则几乎无法实现高保真度的重构。还应避免使用带有内置相差元件的物镜（从物镜后端观察时可见一个暗环状结构），因为这会降低重构图像的质量。待测物体应距离焦平面足够远，使其图像中可见数对衍射条纹（一个合适的经验准则是：离焦图案的线性尺寸约为聚焦物体的10倍——参见示例数据）。物体若过于接近焦平面，则会出现孪像和采样伪影，如前所述。此外，准确表征相机的像素间距也非常重要，因为这是正确确定重聚焦距离的关键因素。通常，相机的技术文档会在规格中列出“像素尺寸”；但这可能略显模糊，因为某些类型的相机（特别是CMOS相机）像素之间的区域存在较大面积的非感光区域。获取该参数最可靠的方法是使用标准校准标样（例如USAF 1951分辨率测试板），并通过图像直接测量采样频率（每微米的像素数）。

在单色照明条件下，数字全息显微（DIHM）系统的分辨率最终由物镜的数值孔径（NA）和照明光波长（λ）决定^23,24。若要实现横向分离点的分辨，两点之间的距离至少应为 Δ_lat=λ/2NA。类似地，在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
尼康Eclipse Ti-E倒置显微镜	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	发射波长 λ=660 nm，线宽约20 nm
LED电源	Thorlabs	LEDD1B
螺纹适配器	Thorlabs	SM2T2
螺纹适配器	Thorlabs	SM1A2
图像采集卡	EPIX	PIXCI E4
高速CMOS相机	Mikrotron	MC-1362