小鼠模型视网膜血管分析的胰蛋白酶消化方案

摘要

胰蛋白酶消化是分析视网膜血管系统最常用的方法之一。本文详细描述了该方法，包括关键的优化步骤，可在保留血管整体结构的同时有效去除非血管组织。

摘要

胰蛋白酶消化法是分析视网膜血管系统的金标准方法^1-5。该方法通过消化视网膜中的非血管成分，将复杂的三维视网膜血管和毛细血管网络制备成二维的平铺标本，从而实现对整个血管网络的可视化观察。这使得研究者能够观察多种病理性血管改变，例如微动脉瘤、毛细血管退化以及内皮细胞与周细胞比例异常。然而，该技术操作难度较高，尤其是在小鼠中更为困难；由于小鼠基因操作简便，已成为研究视网膜最常用的动物模型^6,7。在小鼠眼球中，如何在完全去除非血管成分的同时保持视网膜血管整体结构的完整性，是一项特别具有挑战性的任务。迄今为止，关于小鼠视网膜胰蛋白酶消化技术的详细文献报道仍十分缺乏。本文提供了一套针对小鼠视网膜的胰蛋白酶消化法的详细分步操作流程，并就其中难点步骤的常见问题提供了实用的解决方案和操作建议。

引言

观察视网膜血管系统是解析多种眼病（如糖尿病视网膜病变）发病机制的重要方法。该技术能够评估早期血管异常，包括微动脉瘤、毛细血管退化和周细胞丢失^8,9。迄今为止，已有多种技术被开发用于分析视网膜血管系统。通过灌注不同染料可使血管显影，但这些方法均存在类似局限性：除非在高压下注射，否则难以完整显示整个视网膜血管网络，而高压注射又可能造成血管破裂和损伤¹。利用荧光标记的G型植物凝集素B4（Alexa Fluor 594偶联；I21413；Invitrogen；1:100稀释）对血管内皮进行免疫染色，并结合视网膜平铺片技术，可显示血管的整体结构，但无法清晰呈现毛细血管、基底膜及周细胞的细节。Friedenwald曾指出，可通过过碘酸-希夫（PAS）染色或苏木精-伊红（H&E）染色对视网膜平铺片进行染色以显示血管¹⁰。然而，此类染色对血管无特异性，同时也会使非血管组织显色，因而难以区分血管结构。20世纪60年代，Cogan和Kuwabara开发了胰蛋白酶消化法，通过消化视网膜中的非血管成分，使视网膜血管更易于观察¹。自此以后，胰蛋白酶消化法已成为分析视网膜血管系统的金标准方法^2-5。然而，需要指出的是，已有其他替代技术被用于分离血管系统。渗透裂解法可用于分离血管组织，从而进行组织的生化研究^11,12，但该方法并未被广泛用作解剖学研究的主要手段。组织印迹法可用于分离大段微血管，并可用于研究血管的电紧张性结构¹³。理论上，该技术也可用于研究解剖学变化，因其能较好地保持血管形态。但该方法仅能分离整个血管网络的部分片段。尽管这些方法尚不能取代胰蛋白酶消化法，但值得注意的是，它们各有优缺点，在应用中可互为补充。

胰蛋白酶消化法在技术上具有挑战性，难以稳定地重复操作^6,7。此外，已有研究指出，在小鼠模型上进行胰蛋白酶消化尤为困难，特别是当需要完整保留视网膜整体血管结构时^6,7。主要挑战包括：（1）视网膜过度消化，导致血管系统及非血管组织均发生丢失；（2）消化不足，需进行大量机械性分离操作，进而可能损伤血管床；（3）非血管组织与血管系统分离不充分，导致非特异性染色。多篇文献已强调了这些技术难点，但尚未提供一种详细且可重复的解决方案^14,15。本文将介绍一种逐步操作的方法，详细阐述在小鼠和大鼠视网膜上进行胰蛋白酶消化的技术流程，并针对其中特别困难的步骤提供具体操作建议。技术流程的示意图见图1。

方案

1. 视网膜制备

1. 摘除小鼠眼球。用一只手撑开眼睑，使眼球暴露。另一只手持弯头镊子（弯曲面朝上），在眼眶的上方和下方施加压力，直至眼球突出。然后在眼球后部轻轻闭合镊子，并以连续动作提起，将眼球摘除。
2. 用10%中性缓冲福尔马林固定眼球，至少24小时。
3. 将眼球置于盛有PBS溶液的小培养皿中。
4. 在显微镜下小心分离视网膜，注意避免造成较大撕裂。先用解剖剪在角膜上做初始切口。然后用直头镊子夹住切口处，继续用剪刀沿角膜与巩膜交界处剪开，去除角膜。使用精细的弯头和直头镊子，从视网膜边缘向视神经方向小心剥离巩膜和脉络膜。此步骤需要耐心，过快分离视网膜可能导致撕裂。去除晶状体以及附着在视网膜上的多余虹膜和碎片¹⁶。

2. 水洗

1. 将视网膜置于24孔板中，并加入约500 μl水（需使用孔径至少为45 μm的滤器过滤）覆盖。
2. 每隔30分钟至1小时更换一次水，至少更换4–5次。
3. 在室温下轻轻振荡，于水中过夜孵育。

注意： 洗涤步骤非常重要，因为它们有助于将神经视网膜层与血管分离。

3. 胰蛋白酶消化

1. 去除水分，将视网膜置于含有3%胰蛋白酶（Difco 1:250）的0.1 M Tris缓冲液（pH 7.8）中，于37 °C孵育 温和的 不进行振荡。当组织开始出现解离迹象时（约1.5小时），胰蛋白酶消化完成。
   注意： 避免剧烈震荡，以免损伤血管系统。
   
2. 小心地使用移液器在显微镜下将胰蛋白酶吸出至另一个孔中，注意避免接触视网膜。此多余的胰蛋白酶可在后续步骤4.3中显微镜下操作血管时再次使用。

4. 分离血管系统

1. 向视网膜中加入过滤水。然后尝试用镊子剥离内界膜，必要时可使用剪刀。轻轻振荡5分钟。在显微镜下小心地用移液器吸出水，避免损伤视网膜。
2. 重复水洗（每次5分钟），以帮助将血管网络从附着的视网膜组织中分离。当水洗后水中几乎无残留物时，水洗步骤即完成。
3. 现在需要在解剖显微镜下进行精细操作，以进一步分离血管网络。以下为几种实用技术，可根据技术偏好依次或单独使用，以达到理想效果：
   1. 使用200 μl移液器，小心地在血管附近上下吹吸水，使水流冲击血管，产生轻柔振荡。
   2. 使用200 μl移液器，将胰蛋白酶上下吹吸数次，以使移液器内壁均匀覆盖。然后，小心地将整个血管网络上下吹吸一次，以帮助降解非血管组织。
      注意： 将移液器尖端对准视神经中心而非血管网络边缘，也可防止血管粘附于尖端。
      
   3. 用精细镊子轻轻将血管组织从水中提起，以松动非血管成分。
   4. 如果上述步骤无效，可向视网膜中加入胰蛋白酶以促进组织降解，并在37 °C孵育数分钟。随后去除胰蛋白酶，并重复步骤4.1–4.3。

注意： 确保将所有会接触血管的器械（如移液枪头、镊子）均用胰蛋白酶包被。这有助于避免脉管组织黏附到器械上。

5. 血管系统的可视化

1. 在干净的载玻片上滴加一滴水。使用200 μl移液器或镊子将消化后的血管转移至水中，确保血管平铺展开。水的表面张力有助于展开现已透明的血管网络。如果组织未能展开，可添加更多水，并轻轻晃动载玻片以促进展开。
2. 通过移液或使用滤纸缓慢吸除多余的水分。
3. 让载玻片完全干燥。
4. 根据适当的染色方案，使用PAS/苏木精或H&E染色法对载玻片进行染色。
   注意： PAS/苏木精有助于识别血管壁和细胞核；H&E染色还可显示红细胞。
   
5. 脱水并封片（使用Permount封片介质）。

结果

成功操作的最终产物是小鼠视网膜血管系统完整网络的平铺标本，结构保持完整，可用PAS/苏木精或H&E染色，如图2-4所示。图3中可见内皮细胞与周细胞的清晰区分。在视网膜中，内皮细胞的细胞核呈椭圆形或长形，完全位于血管壁内；周细胞的细胞核较小、呈球形、染色深，通常突出地位于毛细血管壁上。

胰蛋白酶消化是分析糖尿病动物模型中血管病理的常用方法。已描述的病理性血管病变包括微动脉瘤、周细胞残影（周细胞丢失的证据）、无细胞毛细血管以及毛细血管退化。图4展示了在db/db小鼠（II型糖尿病模型）中观察到的毛细血管退化的示例。尽管该操作步骤是针对小鼠视网膜优化的，但在大鼠视网膜中也获得了类似结果，如图5所示。需要注意的是，大鼠视网膜明显更大，因此使用了12孔板而非24孔板。此外，大鼠视网膜的血管网络也比小鼠的更不易受损。

尽可能去除所有非血管组织极为关键。任何残留都会导致非特异性染色，从而影响血管系统...

讨论

胰蛋白酶消化是评估视网膜血管结构的常用方法。然而，该技术操作难度较高，若操作不当，容易导致样本大量丢失。此外，该方法在小鼠中尤为困难，这限制了其在常用遗传性眼病动物模型中的应用。本文提供了在小鼠眼球中有效且稳定地进行该操作的技术指导。

该方案中有几个关键步骤。首先，必须小心地分离出视网膜，避免出现大的撕裂，以确保血管网络保持完整。其次，将视网膜在过滤水中过夜清洗非常重要，这有助于将神经视网膜层与血管分离，从而在胰蛋白酶消化后更易于分开。一种可能加快该过程的改进方法是将视网膜置于含有1% Triton X-100的过滤水中处理1–2小时，随后通过一系列水洗去除Triton X，即可在同一天进行胰蛋白酶消化。

在胰蛋白酶消化过程中，必须持续监测视网膜组织，以避免血管组织意外溶解。根据我们的经验，大约1-1.5小时足以完成神经组织的消化，同时保持血管结构完整。对于较年轻的 小鼠，所需时间更短。在胰蛋白酶消化过程中可进行轻柔振荡，以促进血管与其余组织的分离，但并非必需。应注意避免剧烈震荡，以免导致血管撕裂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
10% 中性缓冲福尔马林	Fischer Scientific	SF100-4
胰蛋白酶（1:250）	Amresco	0458-50G	在 0.1 M Tris 中配制 3% 胰蛋白酶
TRIZMA 碱	Sigma	T1503-1KG	配制 0.1 M Tris 缓冲液（37 ℃ 时 pH 7.8） °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop 无菌真空瓶	Millipore	SCGPS05RE	制备过滤水
<强>仪器设备
体视显微镜			任何能够清晰观察视网膜的显微镜均可使用。（10x 物镜，工作距离 24 mm 即可满足要求）
直剪刀	Fine Science Tools	15024-10	尖端尺寸：8 mm；尖端直径：0.2 mm；10 cm
直型持针钳（不锈钢）	Dumont #5	11252-20	生物学小贴士；0.05 × 0.02 毫米；11 厘米
弯头镊子（Dumostar）	Dumont #7	11297-10	生物学小贴士；0.07 x 0.04 毫米；11.5 厘米
杜布诺夫代谢摇床培养箱	精准科学	BDG59442	可选震荡器
24孔板	Falcon	353047
显微镜载玻片	VWR	82027-132