肺炎链球菌在鼻内殖民期间炎症反应的特征

摘要

描述了 肺炎链球菌 的鼻咽结肠化以及随后对附体或招募细胞的提取。该技术涉及冲洗鼻咽和收集流体通过鼻孔，并适应各种读数，包括微分细胞定量和分析的mRNA表达 原位。

摘要

肺炎链球菌的鼻咽结肠是侵入肺部或血液的先决条件^。这种生物体能够殖民鼻咽的粘膜表面，在那里它可以居住，繁殖，并最终克服宿主防御入侵到宿主的其他组织。在通常的下呼吸道中发现感染会导致肺炎。或者，细菌可以传播到血液中，导致细菌血症，这与高死亡率²有关，否则直接导致肺炎球菌脑膜炎的发展。了解鼻咽结肠的动能和免疫反应是S.肺炎感染模型的一个重要方面。

我们的小鼠内殖民化模型改编自人类模型^3， 并被多个研究小组用于鼻咽^4-7宿主病原体反应的研究。在模型的第一部分，我们使用 肺炎 的临床分离建立一个自我限制的细菌殖民化，类似于人类成人的运输事件。此处详细说明的程序包括准备细菌接种，然后通过通过鼻内管理途径传递接种库建立殖民化事件。在稳定状态下，居民巨噬细胞是鼻咽的主要细胞类型。通常，在未受感染的小鼠⁸中，淋巴细胞很少，但粘膜结肠会导致低至高档炎症（取决于细菌物种和菌株的毒性），从而产生免疫反应，并随后招募宿主免疫细胞。这些细胞可以通过气管内含物的厕所进行分离，并与殖民化细菌的密度相关，以更好地了解感染的动能。

方案

在开始之前:除非另有说明，否则所有步骤均在生物危害 2 级 （BSL2） 生物安全柜 （BSC） 中完成。请确保在开始实验之前，您已获得适当的生物危害批准，以便根据机构指南使用传染性细菌病原体。此外，请确保您拥有进行事先准备的程序所需的所有材料和试剂。这些实验中使用的老鼠包括杰克逊实验室、查尔斯河或塔科尼奇的雌性C57BL/6小鼠，年龄在10-14周（尽管我们尚未发现鼻腔结肠间隙或感染的动能存在任何性别依赖性显著差异）。这些实验中使用的所有小鼠都是在无病原体条件下繁殖和维持的，并且没有常见的病毒（LCMV、MNV、MPV、病毒ECTV和其他）细菌（如幽转杆菌）和寄生虫（如针虫、异位虫），通过粪便样本检测，以及经常对其设施内的哨点小鼠进行解剖评估。在进行这些实验时，我们建议使用年龄不小于10-12周、年龄不小于6个月的对照小鼠。小鼠比这个年龄范围小或大，更容易受到更长的鼻咽运输持续时间和传播感染的可能性增加的影响。小鼠背景是另一个重要的考虑因素，可能会影响殖民化实验的结果，因为几个小组已经证明，不同遗传背景的小鼠有不同的易感性，以S.肺炎D39（血清型2）株^9，10。肺炎不是天然存在的穆林病原体，它唯一的天然储液库是人类鼻咽。传播通过呼吸液滴发生，由于小鼠不产生呼吸分泌物，个别小鼠不能将细菌传染给其他小鼠，因此对小鼠对小鼠^{的传播没有}顾虑。有关本手稿中描述的程序的视觉概述，请参阅图1。

1. 准备肺炎文化

1. 接种5毫升的试用大豆，用于 肺炎链球菌的暂停生长。
2. 静态条件下的培养在 37 °C 的 5% CO₂ 中，直到细菌接种达到日志阶段增长，相应的液体密度为 10⁸ CFU/ml，由设定为 600 nm 的里程表确定。与此 CFU 对应的确切读数将因特定选定的细菌菌株而异:对于大多数 S.肺炎 菌株，这相当于OD₆₀₀ 范围0.45-0.55。通常，在建议条件下，液体培养中的 S.肺炎 菌株将在1.5-2.5小时内增长到这种密度，无需亚文化。不应允许该培养物过度生长（超出 0.75 的 OD 读数），因为这意味着细菌不再处于日志阶段生长并正在经历广泛的自动分析。
3. 每只老鼠将接种约10⁷ 种细菌。因此，每9只小鼠被殖民，移液器1毫升的接种进入埃彭多夫管和旋转在15，000 x 克1分钟。应该可以看到白丸。去除超标物，小心不要干扰颗粒，并补充磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 100 μl 中的细菌，从而将浓度提高到 10⁹ CFU/ml。在这个阶段，细菌应该保持存活，但不会轻易复制。
4. 如果使用多个单引，则组合成一个管子，以控制细菌密度的轻微样本间变化。
5. 将细菌保存在冰上，直到准备好接种，最长1小时。
6. 要获得精确的细菌计数，请执行从整洁的细菌接种开始的日志串行稀释系列。连续稀释 10 倍，将 10μl 添加到 90μl 的无菌 PBS 中。
7. 将 10 μl 稀释样本 10^{-5 -} 10^-9的 3 滴，加上 PBS 专用污染控制，放到单独标记的试用大豆 agar （TSA） 板上，并辅以 5% 羊血（图 2）。确保每一步从较高的 CFU 浓度稀释到较低的 CFU 浓度时，移液器提示都会更改，以避免携带过量的细菌并增加结果的变异性。人血阿加 （HBA） 板也可以用来代替 TSA 。由于许多 肺炎 菌株对新霉素（从5-20微克/毫升）有耐药性，这种抗生素也可能在制片阶段添加到首选的阿加介质中。这有助于列举，因为它消除了非耐受细菌。必须事先测试每种菌株的抗生素易感性，以确定每个细菌菌株使用抗生素的最佳浓度。
8. 允许干燥15-30分钟，然后覆盖板，倒置在细菌孵化器设置为37°C和5%CO_2。在盘子里长出细菌菌落24小时。
9. 确定殖民地形成单位的数量及其相应的浓度。根据OD₆₀₀值的确定，浓度应在1-4 x 10⁹ CFU/ml范围内。 S. 肺炎菌落应以小而圆形的殖民地出现，呈黄色米色，中心为小凹陷，使其外观类似甜甜圈（图3）。

2. 穆林内纳萨尔殖民化

1. 将小鼠放入小鼠约束装置（经过改装的 50 毫升猎鹰管，尖端被切断以创建光圈）用拇指固定它们的身体底部，使其鼻子从约束器装置的锥形末端（图 4）中浮现出来。使用这种装置可以固定老鼠的头部和隔离其鼻孔的方式，尽量减少运动，以及阻碍动物试图粘乳移液器尖端，允许完全交付的接种。或者，小鼠可以通过颈部擦伤和手动约束来固定。我们不建议在进行内接种之前对动物进行麻醉。在麻醉下给动物接种接种导致一些接种剂扩散到肺部^12，13。
2. 使用P10或P20移液器，通过沉积10微克的预制培养物给每只小鼠接种疫苗，在两个鼻孔之间均匀分布（允许接种者通过逐渐脉动接种滴入鼻子，使小鼠需要时间吸入接种）。为了实现接种的完全交付，暂停管理在任何时候，老鼠开始过度移动它的鼻子。整个接种不能注射到鼻腔中，因为老鼠在呼气时可能会通过鼻子排出一些疫苗:然而，由于被驱逐的量往往是微不足道的，而且接种中含有极高的细菌量，这不会显著影响殖民细菌的负荷。此外，可用于鼻咽粘膜殖民化的表面积有限，因此我们和其他人发现，建议的10⁷ 剂量足以获得所有小鼠的细菌水平一致，导致最初殖民细菌^14，15 的变异性最小。
3. 如果将体重指标用作端点监控的一部分，则称量小鼠。每 12-24 小时监测一次小鼠的临床症状，包括嗜睡、毛皮褶皱和体重减轻。小鼠通常不会表现出疾病的症状，直到3-5天后殖民化，这些将之前减肥，可能平均每天约5%的总体重。随着老鼠病得越来越重，它们会采取驼背姿势，表现出活动减少和对刺激（包括处理）的反应能力下降。在这个阶段，疾病通常表明败血症和/或肺炎，并有可能是绝症，虽然小鼠可以每天用1毫升皮下盐水治疗，以改善结果。幸存的小鼠在殖民化后的第7天之后应该会开始出现好转，体重稳定后体重增加就证明了这一点，尽管不同株的S.肺炎可能会更快地诱发疾病，并导致临床症状沿着不同的时间线发展。有关在与 P1547 菌株殖民的小鼠中跟踪的体重的代表性结果，请参阅图 5。

3. 鼻腔拉瓦奇样品收集

开始前: 使用1毫升注射器准备罐装针头，盖有26个3/8G斜针。切开2.5厘米的PE20聚乙烯管，内径0.38毫米，确保每端有一个斜尖。使用钳子，将一块2.5厘米长的PE20聚乙烯管（内径0.38毫米）滑到针尖上，避免刺穿管子侧。罐头可以保存在70%乙醇，直到需要。

1. 安乐死实验鼠。由于颈椎脱位可能会损坏气管，因此必须避免这种安乐死方法。我们首选的方法是异氟乙烯麻醉，然后是脱盐，但是，在选择安乐死模式时，确保您遵循机构指南。
2. 使用70%的水乙醇，消毒动物的超安特里奥皮毛，特别是颈部，小心防止乙醇进入鼻孔。
3. 沿着动物颈部的中线进行单次纵向切割，在两端进行两次水平切口，从而创建一个开口来设想气管。
4. 小心地剥回皮肤到两侧，露出下面的颈部组织。
5. 气管应该可见，两侧的纵向肌肉包围。小心地剪下这些，以提供气管本身的清晰视图，注意不要切断周围的血管。
6. 如果血管被切断，血液存在，在进行之前，允许出血停止，然后通过分配无菌PBS和使用无菌纱布轻轻地吸收该地区多余的水分来清洁该地区几次。
7. 气管适当暴露后，在气管中半乳形切口约半向上（图6）。
8. 将 1，000μl 的消毒 PBS 绘制到先前准备的罐头中。
9. 将管插入气管朝向鼻子，保持斜边向下指向，以方便插入（图 7）。针头到位后，旋转180°，轻轻向上探针，直到感觉有光阻力。
10. 将埃彭多夫指定用于采集样本，就在鼠标鼻子下方。
11. 通过分配最少（+20微l）的PBS熔岩液来测试针头的正确位置 - 应在小鼠的鼻孔周围形成液滴;如果是这样的话，继续步骤3.13）。
12. 如果测试PBS直接从动物的嘴里出现，拉回管子，然后通过再次轻轻地向前探测，直到感觉非常轻微的阻力重新定位 - 小心不要推动坎努拉过这个阻力太远，因为你会移动它过去的鼻腔，并通过口腔。
13. 迅速分配针头的内容，以帮助取代和收集最大数量的细胞 - 内含物应流出通过鼠标的鼻孔和收集管。立即将样品放在冰上。
14. 要收集用于RNA分析的样本，使用包含同一小鼠上 500 μl RNA 裂解缓冲器的罐装针头重复步骤 3.8-3.13）。这将允许从剩余细胞群中收集利萨酸盐样本，这些样本主要由鼻咽粘膜上皮组成，因为非附属细胞应在初始 PBS 厕所后被移除。请注意，RNA裂解缓冲器会破坏上皮并破坏周围的组织，因此，如果需要保留这些组织，必须小心避免与肺等器官接触。收集后，将样品直接放在干冰上的RNA裂解缓冲器中，以捕捉冻结。一旦进入裂解缓冲区，样品可以按照制造商的说明存储，并且通常稳定在 -70 °C 几个月。

4. 纳索芬克斯细菌负荷的确定

1. 通过为每个粘膜鼻腔样本准备一个系列稀释系列来量化细菌。一般来说，细菌负荷可预期在0-10⁴ CFU之间，因此进行三次10倍的连续稀释。将 10 μl 的整洁鼻腔熔岩样本 （100 CFU/ml） 添加到第一根管中，浓度为 10^-1 CFU/ml。
2. 将细菌板分成象限，并分别用稀释系列（10 0 -10^-3 CFU/ml）的成员标记象限。盘出3滴10μl样品的3稀释和整洁的样品试用大豆糖板补充5%羊的血液，如图2。
3. 允许干燥15-30分钟，然后覆盖板，倒置在细菌孵化器中，具有最佳的细菌生长条件（通常为37°C和5%CO_2）。
4. 在盘子里长出细菌菌落18-24小时。
5. 通过平均每个稀释板上形成的菌落来确定殖民细菌的数量（图3）。图8显示，在不同时间点，由鼻熔岩培养决定的细菌密度，在3种不同菌株的S.肺炎中殖民，最长可达21天。

5. 为流测定量的样品准备

开始之前: 准备抗体组合。为了量化白细胞种群，我们建议在指定稀释时进行以下组合:PE-Ly6G（克隆 1A8， 1 μg/ml）、FITC-Ly6C（克隆 AL-21，1 μg/ml）、eFluor 450-CD45（克隆 30-F11， 2.67 微克/毫升），APC-F4/80（克隆 PM8 RUO，0.67 微克/毫升），PerCP-Cy5.5-CD11c（克隆 N418 RUO， 0.5 微克/毫升）、PE-Cy7-CD11b（克隆 M1/70、0.33 μg/ml）、亚历克萨氟 700-CD3（克隆 1782、4 μg/ml）、eFluor 605NC-CD4（克隆 GK1.5、6.67 微克/毫升）。请注意，此组合的浓度为 2 倍（参见步骤 5.5）。所有抗体应稀释在FACs洗缓冲器（0.5%胎儿小腿血清，2mM EDTA，0.1%钠阿齐德在PBS），这也应事先准备。在等型匹配对照抗体的混合物中，最好是来自与标记抗体相同的供应商，并且与特定抗体的浓度相同。用同型控制抗体处理的样品将起到负对照作用。在用同型控制抗体治疗的样本中观察到的任何荧光应被视为背景。

1. 预切离心机，可旋转 1.5 毫升埃彭多夫管到 4 °C。
2. 离心鼻拉瓦奇样品在 2，000 x g 10 分钟在 4 °C。 小心地移出超自然和储备。注意:由于鼻咽内细胞量小，除非有不受欢迎的红血球污染，否则细胞颗粒将看不见，而红血球会呈鲜红色。如果看到此问题，应丢弃样品。
3. 在50μl的Fc中重新补充样品？RIIb/CD16-2 （2.4G2） 抗体 （结合 Fc 受体并减少非特异性抗体结合） 在 FAC 洗涤缓冲区中，浓度为 4μg/ml。
4. 在冰上孵化样品30分钟。
5. 加入50微升预先准备的2倍浓缩荧光抗体混合物到样品中。从每个实验组中留出一个具有代表性的样本，作为等型控制。将同型抗体混合物添加到此样品中，以代替污渍混合。
6. 在冰上孵化样品1小时。
7. 离心机样品在2，000 x g 10分钟在4°C。 丢弃超自然物，并在 200μl 的 PBS 中重新使用。
8. 重复步骤5.7。
9. 第二次洗涤后，离心机样品在 4 °C 下 10 分钟内再次以 2，000 x g 的速度进行。
10. 在PBS（如果立即运行样品）或2%的甲醛（如果在染色后1-3天运行样品）中再吸收。
11. 进行流细胞测量时，收集每个样本的最大事件量，或直到整个样本被吸气。在未受感染、健康、幼鼠中，这一事件总数将少至1 000至2 000只:在细菌殖民化事件期间，这个数字可能会增加2到5倍以上，这取决于动物的疾病状况以及年龄和遗传背景等因素。 图9 显示了从3激光贝克顿·迪肯森LSRII流细胞仪中收集的代表性流量细胞测量结果，该测速仪使用450的向前散射和300的侧散射，尽管我们建议在样品收集之前优化您打算使用的特定流细胞仪的参数。注意:如果样本中甚至含有微量的血液污染，则收集的总事件将明显高于预期，并且样本应从分析中打折扣。

6. 鼻熔岩的定量PCR（qPCR）分析

1. 从步骤 3.14 室温解冻细胞。
2. 按照推荐的协议，选择首选的RNA提取。
3. 按照指示完成RNA提取程序后，使用光谱仪或基于电泳的方法（图10）量化RNA的量。我们通常以 260/280 nm 的比例获得每个样本 975 至 3，250 ng 的总 RNA，>1.7 或 RNA 完整性编号 （RIN） 左右，约为 8.1±0.13。
4. 根据制造商的协议，使用 M-MULV 反向转录酶使用 1，000 ng RNA（最大 13 μl）转录 cDNA。
5. 稀释生成的 cDNA 样品 8 倍，并同样引用到 4 个单独的管中，在 -20 或 -80 °C 的长期存储中。
6. 要通过 qPCR 测量基因表达，请在冰块或冷块上的三脚架中准备 25 个 μl 样本反应，其中包含: 您选择的 qPCR 套件中的 2 倍 qPCR 主组合中的 12.5 μl， 0.25 μl 参考染料，2 μl 稀释的 cDNA（步骤 7.5），1 μl 的混合前进和反向引物（400 nM 最终），9.25 μl 的 RNAse-DNAS 无水。该协议是以前公布的方法¹⁶的改编。
7. 一般来说，我们发现两步 qPCR 放大（95 °C 10 分钟，然后最多 40 个周期 x [95 °C x 15 秒，60 °C x 1 分钟]） 是有效的 （图 11a）;但是，必须优化每个引号对。放大后必须执行分离（熔化）曲线，以确保不会发生非特定放大。放大 （图 11b）
8. 我们通常运行每个分析的基因的标准曲线，以及每个96井板分析的标准校准器（源自肺或脾脏同质性）。通过参考染料首先使原始周期阈值 （Ct） 值正常化并通过相应的标准曲线转换结果值来获得相对成绩单量。这些相对量随后根据适用情况标准化为标准校准器和家政基因。

结果

图 1 表示概述示意图，总结了协议的主要步骤。 图2-3 提供了本文所述协议所固有的微生物方法的可视化。 图4 表示小鼠进行鼻内殖民化的正确定位，而 图5 则描绘了与 S.肺炎 菌株P1547结肠的小鼠体重的典型变化。 图6-7 表示过程鼻腔熔洗部分的特定阶段，用于辅助可视化这两种技术。 图8-11 包括对从鼻腔清洗后从小鼠鼻咽采集的样本进行的具有代表性的分析结果。具体来说， 图8 是鼻咽细菌负荷的代表性结果，通过培养从与 S.肺炎 菌株P1121、P1547或P1542殖民的小鼠身上获得的鼻熔岩来确定。 图9 表示使用流动细胞测量技术分离的鼻咽免疫细胞的细胞表型。 图10-11 显示与通过定量PCR对鼻咽mRNA的表达分析相关的代表性结果。

讨论

在这项研究中，我们提出了使用 肺炎链球菌 临床分离菌株的小鼠的鼻内结肠的详细方法，以及随后针对细菌招募到鼻咽的免疫细胞的隔离和特征。我们演示了如何在营养丰富的介质中培养细菌，并用于在小鼠中建立殖民活动，最初仅限于鼻咽。然后，我们展示了如何通过使用罐装针头，在气管暴露、切口和鼻腔熔洗后分离出招募到鼻咽的免疫细胞类型。鼻腔熔岩样本可在PBS中采集，以分离完整、轻粘附的细胞:通过应用由RNA裂解缓冲器组成的二次洗涤，可以分离来自更紧密粘附细胞和周围上皮粘膜层的RNA。然后，这些样本中的前者可用于通过流动细胞测量技术对殖民化环境中招募的特定细胞进行表型，而后者则应用于Q-PCR分析，通过观察免疫调节器的兴趣转录表达来确定这些被招募细胞的效应器功能。鼻腔熔岩样本还可用于确定细菌殖民化事件清除的动力学，比较不同的实验组以解决特定的研究问题。

利用这种鼻内殖民化方法，可以建立一个殖民化事件，最初仅限于动物的鼻咽。因此，细菌随后在血液或器官上的任何传播都比鼻咽粘膜内局部免疫防御的破坏次要发生。通过这个模型实现的逐步进展更准确地反映了肺气管入侵人类的过程，使人们能够研究殖民细菌和宿...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
抗小鼠 Ly6G PE	BD Pharmingen
抗小鼠 CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
抗小鼠 F4/80 抗原 APC	eBioscience	17-4801-82
抗小鼠 CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
抗小鼠 CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
抗小鼠 CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
抗小鼠 CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
药内聚乙烯管 - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml 注射器	Becton Dickinson	309659
BD 26G 3/8 皮内斜面	Becton Dickinson	305110
缓冲液 RLT 裂解缓冲液	Qiagen	79216
Difco 胰蛋白酶大豆琼脂	Becton Dickinson	236950
去纤维化羊血	PML 微生物制剂	A0404
RNAqueous-Micro 试剂盒	Ambion	AM1931
M-MuLV 逆转录酶	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR 预混液	Promega	A6001