鼻腔定植Streptococcus pneumoniae期间炎症反应的表征

摘要

小鼠鼻咽部的定植 肺炎链球菌 并描述了随后对黏附或募集细胞的提取方法。该技术包括冲洗鼻咽部并通过鼻孔收集冲洗液，适用于多种检测指标，包括差异细胞计数和mRNA表达分析。 原位.

摘要

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）在鼻咽部的定植是其侵入肺部或血液的前提¹。该病原体能够定植于鼻咽黏膜表面，在此存活并增殖，并最终突破宿主防御机制，侵入其他组织。当感染在正常的下呼吸道建立时，可导致肺炎。此外，细菌还可播散至血液，引起菌血症，后者与高死亡率相关²，或直接导致 pneumococcal 脑膜炎的发生。了解鼻咽部定植的动力学过程及宿主免疫应答，是研究 S. pneumoniae 感染模型的重要环节。

我们的小鼠鼻腔定植模型借鉴了人类模型³，并已被多个研究团队用于研究鼻咽部宿主与病原体之间的相互作用^4-7。在该模型的第一部分，我们使用一株临床分离的S. pneumoniae建立一种自限性细菌定植，类似于成年人中的细菌携带状态。本文详细描述的操作流程包括细菌接种物的制备，随后通过鼻内途径给予接种物以建立定植过程。在稳态条件下，鼻咽部主要的细胞类型为常驻巨噬细胞。通常情况下，未感染小鼠的鼻咽部仅有少量淋巴细胞存在⁸，但黏膜定植会引发轻度至重度的炎症反应（取决于细菌种类和菌株的毒力），从而触发免疫应答并继发性招募宿主免疫细胞。这些细胞可通过经鼻气管灌洗获取，并可将其数量与定植细菌密度进行关联分析，以更深入地理解感染的动力学过程。

方案

开始前须知：除非另有说明，所有步骤均在生物安全二级（BSL2）生物安全柜（BSC）中进行。请确保在实验开始前，已根据机构规定获得使用传染性细菌病原体所需的相应生物安全许可。此外，请确保已提前准备好进行该实验所需的所有材料和试剂。本实验中使用的小鼠包括来自Jackson Laboratories、Charles River或Taconic的雌性C57BL/6小鼠，年龄为10–14周（尽管我们未发现性别对鼻腔定植清除或感染动力学有显著影响）。所有用于实验的小鼠均在无特定病原体（SPF）条件下饲养和维持，并通过粪便样本检测以及对同设施房间内哨兵小鼠的频繁解剖评估，确认其无常见病毒（如LCMV、MNV、MPV、呼肠孤病毒、ECTV等）、细菌（例如 H. pylori）和寄生虫（例如 蛲虫、体外寄生虫）。进行本实验时，建议使用年龄不小于10–12周、不超过6个月的对照小鼠。年龄小于或大于此范围的小鼠更易出现较长的鼻咽部携带时间，并增加感染播散的风险。小鼠遗传背景是另一个可能影响定植实验结果的重要因素，已有多个研究证实，不同遗传背景的小鼠对S. pneumoniae D39（血清型2）菌株的易感性存在差异^9,10。S. pneumoniae并非自然感染小鼠的病原体，其唯一的自然宿主是人类鼻咽部。该菌通过呼吸道飞沫传播，但由于小鼠不产生呼吸道分泌物，单个小鼠无法将细菌传播给其他小鼠，因此不存在小鼠之间的传播风险

结果

图1为概述示意图，总结了本方案的主要步骤。图2-3展示了本方案中所涉及的微生物学方法的可视化内容。图4显示了进行小鼠鼻内定植时的正确体位，而图5则描绘了经S. pneumoniae菌株P1547定植后小鼠体重的典型变化。图6-7展示了鼻腔灌洗操作过程中的特定阶段，以辅助可视化理解这两种技术。图8-11为从小鼠鼻腔灌洗后采集的鼻咽部样本进行分析所得的代表性结果。具体而言，图8为通过培养经S. pneumoniae菌株P1121、P1547或P1542定植小鼠获得的鼻腔灌洗液所测定的鼻咽部细菌载量的代表性结果。图9为利用流式细胞术对分离的鼻咽部免疫细胞进行细胞表型分析的代表性结果。图10-11展示了通过定量PCR对鼻咽部mRNA表达水平进行分析的代表性结果。

讨论

本研究中，我们介绍了使用肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）临床分离株对小鼠进行鼻内定植的详细方法，以及随后对响应细菌定植而募集至鼻咽部的免疫细胞进行分离与表征的技术。我们展示了如何在营养丰富的培养基中培养细菌接种物，并用于在小鼠体内建立定植模型，该定植最初局限于鼻咽部。接着，我们说明了如何通过气管暴露、切口及使用套管针进行鼻腔灌洗，来分离募集至鼻咽部的响应性免疫细胞类型。鼻腔灌洗样本可收集于磷酸盐缓冲液（PBS）中，以分离完整且轻度黏附的细胞；而更紧密黏附的细胞及其周围上皮黏膜层的RNA，则可通过加入RNA裂解缓冲液进行二次冲洗后提取。前一类样本可用于流式细胞术对定植过程中募集的特定细胞类型进行表型分析，后一类样本则适用于定量PCR（Q-PCR）分析，通过检测目标免疫调节因子的转录表达水平，来确定这些募集细胞的效应功能。此外，鼻腔灌洗样本还可用于比较不同实验组之间细菌定植清除的动力学过程，以回答特定的研究问题。

采用这种鼻内定植方法，可建立仅初始局限于动物鼻咽部的定植事件。此后细菌向血液或器官的任何播散，均继发于鼻咽黏膜局部免疫防御屏障.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
抗小鼠 Ly6G PE	BD Pharmingen
抗小鼠 CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
抗小鼠 F4/80 抗原 APC	eBioscience	17-4801-82
抗小鼠 CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
抗小鼠 CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
抗小鼠 CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
抗小鼠 CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Intramedic 聚乙烯导管 - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml 注射器	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 皮内斜面针头	Becton Dickinson	305110
Buffer RLT 裂解缓冲液	Qiagen	79216
Difco 胰蛋白酶大豆琼脂	Becton Dickinson	236950
去纤维羊血	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro 试剂盒	Ambion	AM1931
M-MuLV 逆转录酶	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR 预混液	Promega	A6001