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方法文章

鼻腔定植Streptococcus pneumoniae期间炎症反应的表征

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DOI：

10.3791/50490

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2014年1月17日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

本文内容

摘要

小鼠鼻咽部的定植 肺炎链球菌 并描述了随后对黏附或募集细胞的提取方法。该技术包括冲洗鼻咽部并通过鼻孔收集冲洗液，适用于多种检测指标，包括差异细胞计数和mRNA表达分析。 原位.

摘要

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）在鼻咽部的定植是其侵入肺部或血液的前提1。该病原体能够定植于鼻咽黏膜表面，在此存活并增殖，并最终突破宿主防御机制，侵入其他组织。当感染在正常的下呼吸道建立时，可导致肺炎。此外，细菌还可播散至血液，引起菌血症，后者与高死亡率相关2，或直接导致 pneumococcal 脑膜炎的发生。了解鼻咽部定植的动力学过程及宿主免疫应答，是研究 S. pneumoniae 感染模型的重要环节。

我们的小鼠鼻腔定植模型借鉴了人类模型3，并已被多个研究团队用于研究鼻咽部宿主与病原体之间的相互作用4-7。在该模型的第一部分，我们使用一株临床分离的S. pneumoniae建立一种自限性细菌定植，类似于成年人中的细菌携带状态。本文详细描述的操作流程包括细菌接种物的制备，随后通过鼻内途径给予接种物以建立定植过程。在稳态条件下，鼻咽部主要的细胞类型为常驻巨噬细胞。通常情况下，未感染小鼠的鼻咽部仅有少量淋巴细胞存在8，但黏膜定植会引发轻度至重度的炎症反应（取决于细菌种类和菌株的毒力），从而触发免疫应答并继发性招募宿主免疫细胞。这些细胞可通过经鼻气管灌洗获取，并可将其数量与定植细菌密度进行关联分析，以更深入地理解感染的动力学过程。

方案

开始前须知：除非另有说明，所有步骤均在生物安全二级（BSL2）生物安全柜（BSC）中进行。请确保在实验开始前，已根据机构规定获得使用传染性细菌病原体所需的相应生物安全许可。此外，请确保已提前准备好进行该实验所需的所有材料和试剂。本实验中使用的小鼠包括来自Jackson Laboratories、Charles River或Taconic的雌性C57BL/6小鼠，年龄为10–14周（尽管我们未发现性别对鼻腔定植清除或感染动力学有显著影响）。所有用于实验的小鼠均在无特定病原体（SPF）条件下饲养和维持，并通过粪便样本检测以及对同设施房间内哨兵小鼠的频繁解剖评估，确认其无常见病毒（如LCMV、MNV、MPV、呼肠孤病毒、ECTV等）、细菌（例如 H. pylori）和寄生虫（例如 蛲虫、体外寄生虫）。进行本实验时，建议使用年龄不小于10–12周、不超过6个月的对照小鼠。年龄小于或大于此范围的小鼠更易出现较长的鼻咽部携带时间，并增加感染播散的风险。小鼠遗传背景是另一个可能影响定植实验结果的重要因素，已有多个研究证实，不同遗传背景的小鼠对S. pneumoniae D39（血清型2）菌株的易感性存在差异9,10。S. pneumoniae并非自然感染小鼠的病原体，其唯一的自然宿主是人类鼻咽部。该菌通过呼吸道飞沫传播，但由于小鼠不产生呼吸道分泌物，单个小鼠无法将细菌传播给其他小鼠，因此不存在小鼠之间的传播风险11。有关本文所述实验步骤的可视化概览，请参见图1。

1. 准备 S. pneumoniae 培养

  1. 接种5 ml胰蛋白酶大豆琼脂，用于肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的悬浮培养。
  2. 在37 °C、5% CO2条件下静置培养，直至细菌接种物达到对数生长期，液体密度为108 CFU/ml，该数值通过设定波长为600 nm的光密度计测定。对应此CFU值的精确读数因所选细菌菌株的不同而异；对于大多数肺炎链球菌（S. pneumoniae）菌株，其OD600范围为0.45–0.55。通常情况下，在推荐条件下，液体培养中的S. pneumoniae菌株在1.5–2.5小时内即可达到此密度，无需传代培养。培养过程中应避免过度生长（OD值超过0.75），因为此时细菌已不再处于对数生长期，并开始发生广泛的自溶。
  3. 每只小鼠将接种约107个细菌。因此，对于每9只待定植的小鼠，取1 ml接种物移入一个Eppendorf管中，在15,000 × g离心1分钟，应可见白色沉淀。小心移除上清液，避免扰动沉淀，并将细菌重悬于100 μl磷酸盐缓冲液（PBS）中，使浓度提高至109 CFU/ml。在此阶段，细菌应保持活性，但不会迅速增殖。
  4. 若使用多个等分试样，应合并至同一管中，以控制不同样品间细菌密度的微小差异。
  5. 将细菌置于冰上保存，直至准备接种，最长不超过1小时。
  6. 为获得精确的细菌计数，从原始细菌接种物开始进行对数级倍比稀释系列。进行10倍系列稀释，每次将10 μl加入90 μl无菌PBS中。
  7. 将10-5至10-9稀释度的样品各取10 μl，点样3滴，同时设置仅含PBS的污染对照，分别接种于添加5%绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板的不同标记区域（图2）。确保在从高CFU浓度向低CFU浓度逐级稀释时，每次更换移液器吸头，以避免过量细菌残留，减少结果变异性。也可使用人血琼脂（HBA）平板替代TSA。由于许多S. pneumoniae菌株对新霉素具有抗性（5–20 μg/ml），可在制备平板时将该抗生素添加至所选琼脂培养基中，有助于菌落计数，因其可抑制非抗性细菌生长。每种菌株的抗生素敏感性必须预先测试，以确定适用于该菌株的最佳抗生素浓度。
  8. 敞口静置干燥15–30分钟，然后盖上皿盖，倒置于设定为37 °C、5% CO2的细菌培养箱中，培养24小时以形成菌落。
  9. 确定菌落形成单位数量及其对应浓度。根据OD600值测定结果，浓度应在1–4 × 109 CFU/ml范围内。S. pneumoniae菌落应呈小而圆形，颜色为黄褐色，中心有轻微凹陷，呈现类似甜甜圈的外观（图3）。

2. 小鼠鼻内定植

  1. 将小鼠放入小鼠固定装置（一个已剪去尖端以形成开口的改良50 ml Falcon离心管）中进行固定，用拇指在身体基部将其固定，使小鼠的鼻部刚好从装置的锥形末端伸出（图4）。使用该装置可有效固定小鼠头部，并将其鼻孔分隔开，从而最大限度减少小鼠移动，并防止其咀嚼移液枪头，确保接种物完全递送。也可通过抓握颈部皮肤并手动固定来实现小鼠的固定。我们不建议在鼻腔接种前对动物实施麻醉。在麻醉状态下给予接种物会导致部分接种物扩散至肺部12,13。
  2. 使用P10或P20移液器，将10 μl制备好的菌液接种至每只小鼠，均匀分配至两个鼻孔（通过逐步脉冲式轻柔滴加，使接种物流入鼻腔，给予小鼠足够时间吸入）。为确保接种物完全递送，若小鼠出现明显鼻部移动，应暂停操作。由于小鼠在呼气过程中可能将少量接种物从鼻腔排出，因此并非全部接种物都能进入鼻腔；但因排出量通常极微，且接种物中含有极高浓度的细菌，故对定植菌载量无显著影响。此外，鼻咽黏膜可供定植的表面积有限，因此我们及其他研究者发现，推荐的107剂量足以在所有小鼠中实现稳定的细菌定植水平，使初始定植菌量的个体间差异最小化14,15。
  3. 若采用体重变化作为终点监测指标，则需对小鼠进行称重。每12–24小时监测一次小鼠的临床症状，包括嗜睡、毛发竖立和体重减轻。小鼠通常在定植后3–5天才开始出现疾病症状，且症状出现前常伴有体重下降，每日平均降幅约为总体重的5%。随着病情加重，小鼠将呈现弓背姿势，活动减少，对外界刺激（包括抓握）反应性降低。此时，疾病通常提示败血症和/或肺炎，往往具有致死性；尽管如此，每日皮下注射1 ml生理盐水可能有助于改善预后。存活小鼠通常在定植后第7天起开始出现恢复迹象，表现为体重趋于稳定并逐渐回升；但不同血清型的S. pneumoniae可能更快引发疾病，导致临床症状进展的时间线有所不同。有关P1547菌株定植小鼠体重变化的代表性结果，请参见图5。

3. 鼻腔灌洗样本采集

开始前： 使用带有26 3/8 G斜面针头的1 ml注射器制备套管针。用内径为0.38 mm的PE20聚乙烯管剪取2.5 cm长的管段，确保每端均具有斜面尖端。用镊子将一段2.5 cm长、内径0.38 mm的PE20聚乙烯管套在针头尖端，避免刺破管壁。套管针可保存在70%乙醇中，待用时取出。

  1. 处死实验小鼠。由于颈椎脱位可能会损伤气管，因此必须避免使用此种安乐死方法。我们首选的方法是异氟烷麻醉后放血处死，但在选择安乐死方式时，请务必遵循所在机构的相关指南。
  2. 使用70%水性乙醇对动物的前上方毛皮（尤其是颈部）进行消毒，注意防止乙醇进入鼻孔。
  3. 沿动物颈部中线做一条纵向切口，并在两端各做一条横向切口，以暴露气管区域。
  4. 小心将皮肤向两侧剥离，露出下方的颈部组织。
  5. 气管应已可见，其两侧被纵向肌肉包围。小心剪开这些肌肉，以清晰暴露气管本身，注意避免切断周围血管结构。
  6. 若血管被切断并有出血，应在继续操作前等待出血停止，然后多次滴加无菌PBS并用无菌纱布轻轻吸除局部多余液体，清洁操作区域。
  7. 当气管充分暴露后，在气管约中上部位置做一横向的半月形切口（图6）。
  8. 用预先准备好的套管针抽取1,000 μl无菌PBS。
  9. 将套管插入气管并向鼻部方向推进，插入时保持斜面边缘朝下以便顺利进入（图7）。套管到位后，将其旋转180°，然后轻柔向上探查，直至感到轻微阻力。
  10. 将用于样本收集的离心管置于小鼠鼻孔正下方。
  11. 通过快速注入少量（约20 μl）PBS灌洗液测试针头位置是否正确——液体应在小鼠鼻孔周围形成液滴；若出现此情况，则继续进行步骤3.13）。
  12. 若测试用PBS直接从动物口腔流出，则需将套管稍向后撤出，重新向前轻柔探查，直至感受到极轻微阻力为止——注意不要过度推进套管，否则会穿过鼻腭部进入口腔腔隙。
  13. 迅速注入针管内全部液体，以最大程度地冲出并收集细胞——液体应从鼻孔流出并进入收集管中。收集后立即将样本置于冰上。
  14. 若需收集用于RNA分析的样本，请在同一小鼠上重复步骤3.8–3.13），使用含有500 μl RNA裂解缓冲液的套管针进行操作。该步骤可收集残留细胞群体的裂解物，这些细胞主要由鼻咽黏膜上皮细胞组成，因为非黏附性细胞已在先前的PBS灌洗中被清除。请注意，RNA裂解缓冲液会使上皮细胞脱落并破坏周围组织，因此如需保留其他组织（如肺组织），应特别注意避免裂解液接触这些器官。样本收集后应立即放入RNA裂解缓冲液中，并置于干冰上速冻。加入裂解缓冲液后的样本可按照试剂生产商的说明进行保存，通常在-70 °C条件下可稳定保存数月。

4. 鼻咽部细菌载量的测定

  1. 通过为每份小鼠鼻腔灌洗样本制备系列稀释液来定量细菌。通常细菌载量预计在 0–104 CFU 之间，因此进行三次 10 倍系列稀释。取 10 μl 原液鼻腔灌洗样本（100 CFU/ml）加入第一支试管，使其浓度为 10-1 CFU/ml。充分涡旋混匀。
  2. 将细菌培养平板分为四个象限，每个象限标记为稀释系列中的一种（100–10-3 CFU/ml）。在添加 5% 羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板上，分别点加 3 滴 10 μl 的 3 种稀释液及原液样本，如图 2所示。
  3. 敞盖干燥 15–30 分钟后，盖上平板并倒置于细菌培养箱中，在适合细菌生长的最佳条件下培养（通常为 37 °C 和 5% CO2）。
  4. 将平板上的细菌菌落培养 18–24 小时。
  5. 通过计算每个稀释度平板上形成的菌落数量的平均值，确定定植细菌数量（图 3）。图 8 展示了在接种三种不同S. pneumoniae菌株后长达 21 天期间，通过鼻腔灌洗培养测定的小鼠在不同时间点的细菌密度。

5. 流式细胞术样品的制备

开始前： 准备抗体混合液。为定量白细胞亚群，我们推荐使用以下指定稀释浓度的抗体组合：PE-Ly6G（克隆号 1A8，1 μg/ml）、FITC-Ly6C（克隆号 AL-21，1 μg/ml）、eFluor 450-CD45（克隆号 30-F11，2.67 μg/ml）、APC-F4/80（克隆号 PM8 RUO，0.67 μg/ml）、PerCP-Cy5.5-CD11c（克隆号 N418 RUO，0.5 μg/ml）、PE-Cy7-CD11b（克隆号 M1/70，0.33 μg/ml）、Alexa Fluor 700-CD3（克隆号 1782，4 μg/ml）、eFluor 605NC-CD4（克隆号 GK1.5，6.67 μg/ml）。请注意，该混合液为 2 倍浓度（见步骤 5.5）。所有抗体应使用 FACs 洗涤缓冲液（含 0.5% 胎牛血清、2 mM EDTA、0.1% 叠氮化钠的 PBS 溶液）进行稀释，该缓冲液也需提前配制。同时应配制一组同型对照抗体混合液，理想情况下应与标记抗体来自同一供应商，并使用与特异性抗体相同的浓度。经同型对照抗体处理的样本将作为阴性对照。在同型对照抗体处理的样本中观察到的任何荧光信号均应视为背景信号。

  1. 将可离心1.5 ml Eppendorf管的离心机预冷至4 °C。
  2. 在4 °C下以2,000 × g离心鼻腔灌洗样本10分钟。小心吸去上清液并保留。注意：由于鼻咽部细胞数量较少，细胞沉淀通常不可见，除非存在不期望的红细胞污染，此时沉淀呈鲜红色。若观察到此情况，应弃用该样本。
  3. 用50 μl FACs洗涤缓冲液重悬样本，其中含FcγRIIb/CD16-2（2.4G2）抗体（可结合Fc受体并减少非特异性抗体结合），抗体浓度为4 μg/ml。
  4. 将样本置于冰上孵育30分钟。
  5. 向样本中加入50 μl预先配制的2倍浓缩荧光抗体混合液。为每个实验组保留一份代表性样本作为同型对照，并用同型抗体混合液替代染色混合液加入该样本中。
  6. 将样本置于冰上孵育1小时。
  7. 在4 °C下以2,000 × g离心样本10分钟。弃去上清液，加入200 μl PBS重悬沉淀。
  8. 重复步骤5.7。
  9. 第二次洗涤后，再次在4 °C下以2,000 × g离心样本10分钟。
  10. 用PBS（若立即上机检测）或2%多聚甲醛（若在染色后1–3天内检测）重悬样本。
  11. 进行流式细胞术检测时，应收集每个样本尽可能多的事件数，直至整个样本被完全吸尽。在未感染的健康年轻小鼠中，总事件数可能仅为1,000–2,000；而在细菌定植状态下，该数值可能增加2至5倍以上 ，具体取决于动物的疾病状态以及年龄和遗传背景等因素。图9展示了使用三激光Becton Dickinson LSRII流式细胞仪获得的代表性结果，前向散射设为450，侧向散射设为300；但我们建议在样本采集前根据所使用的具体流式细胞仪优化检测参数。注意：若样本中含有微量血液污染，所收集的总事件数将显著高于预期，此类样本应从分析中剔除。

6. 鼻腔灌洗液的定量 PCR（qPCR）分析

  1. 将步骤 3.14 的细胞裂解液在室温下解冻。
  2. 按照所选 RNA 提取试剂盒提供的推荐方案进行操作。
  3. 按说明完成 RNA 提取后，使用分光光度计或基于电泳的方法对 RNA 量进行定量（图 10）。我们通常每样本获得 975 至 3,250 ng 总 RNA，260/280 nm 比值>1.7，或 RNA 完整性数（RIN）约为 8.1±0.13。
  4. 使用 M-MULV 逆转录酶，按照制造商方案，以 1,000 ng RNA（最多 13 μl）进行 cDNA 反转录。
  5. 将所得 cDNA 样本稀释 8 倍，并等量分装至 4 个独立管中，于 -20 或 -80 °C 长期保存。
  6. 为通过 qPCR 检测基因表达，在冰上或冷块上配制 25 μl 反应体系，每样本设三个重复：包含 12.5 μl 自选 qPCR 试剂盒中的 2× qPCR 预混液、0.25 μl 参比染料、2 μl 稀释后的 cDNA（步骤 7.5）、1 μl 混合的上下游引物（终浓度 400 nM）、9.25 μl 无 RNase 和 DNase 的水。本方案改编自先前发表的方法16。
  7. 通常我们发现两步法 qPCR 扩增（95 °C 预变性 10 分钟，随后进行最多 40 个循环 × [95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟]）效果良好（图 11a）；然而，每对引物均需优化。扩增后必须进行解离（熔解）曲线分析，以确保无非特异性扩增产物（图 11b）。
  8. 我们通常对每个分析基因以及每块 96 孔板均运行标准曲线，并包含一个标准校准品（来源于肺或脾匀浆）。相对转录本含量的计算方法如下：首先将原始循环阈值（Ct）数据用参比染料归一化，再通过对应的标准曲线转换为相对量；随后根据标准校准品及适用的看家基因进一步归一化。

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结果

图1为概述示意图，总结了本方案的主要步骤。图2-3展示了本方案中所涉及的微生物学方法的可视化内容。图4显示了进行小鼠鼻内定植时的正确体位，而图5则描绘了经S. pneumoniae菌株P1547定植后小鼠体重的典型变化。图6-7展示了鼻腔灌洗操作过程中的特定阶段，以辅助可视化理解这两种技术。图8-11为从小鼠鼻腔灌洗后采集的鼻咽部样本进行分析所得的代表性结果。具体而言，图8为通过培养经S. pneumoniae菌株P1121、P1547或P1542定植小鼠获得的鼻腔灌洗液所测定的鼻咽部细菌载量的代表性结果。图9为利用流式细胞术对分离的鼻咽部免疫细胞进行细胞表型分析的代表性结果。图10-11展示了通过定量PCR对鼻咽部mRNA表达水平进行分析的代表性结果。

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讨论

本研究中，我们介绍了使用肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）临床分离株对小鼠进行鼻内定植的详细方法，以及随后对响应细菌定植而募集至鼻咽部的免疫细胞进行分离与表征的技术。我们展示了如何在营养丰富的培养基中培养细菌接种物，并用于在小鼠体内建立定植模型，该定植最初局限于鼻咽部。接着，我们说明了如何通过气管暴露、切口及使用套管针进行鼻腔灌洗，来分离募集至鼻咽部的响应性免疫细胞类型。鼻腔灌洗样本可收集于磷酸盐缓冲液（PBS）中，以分离完整且轻度黏附的细胞；而更紧密黏附的细胞及其周围上皮黏膜层的RNA，则可通过加入RNA裂解缓冲液进行二次冲洗后提取。前一类样本可用于流式细胞术对定植过程中募集的特定细胞类型进行表型分析，后一类样本则适用于定量PCR（Q-PCR）分析，通过检测目标免疫调节因子的转录表达水平，来确定这些募集细胞的效应功能。此外，鼻腔灌洗样本还可用于比较不同实验组之间细菌定植清除的动力学过程，以回答特定的研究问题。

采用这种鼻内定植方法，可建立仅初始局限于动物鼻咽部的定植事件。此后细菌向血液或器官的任何播散，均继发于鼻咽黏膜局部免疫防御屏障...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

作者谨此感谢宾夕法尼亚大学的 Jeffery Weiser 博士惠赠肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）临床菌株。本研究由加拿大卫生研究院资助。CV 获得了 M. G. DeGroote 博士后奖学金以及加拿大胸科学会奖学金的资助。本研究还得到了安大略肺脏协会和加拿大卫生研究院（CIHR）的资助。Bowdish 实验室的工作部分得到了 Michael G. DeGroote 传染病研究中心和麦克马斯特大学免疫学研究中心的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗小鼠 Ly6C FITCBD Pharmingen553104
抗小鼠 Ly6G PEBD Pharmingen
抗小鼠 CD45.1 eFluor 450eBioscience48-0453-82
抗小鼠 F4/80 抗原 APCeBioscience17-4801-82
抗小鼠 CD11c PerCP-Cy5.5eBioscience45-0114-82
抗小鼠 CD11b PE-Cy7eBioscience25-0112-82
抗小鼠 CD3 Alexa Fluor 700eBioscience56-0032-82
抗小鼠 CD4 eFluor 605NCeBioscience93-0041-42
Intramedic 聚乙烯导管 - PE20Becton Dickinson427406
BD 1 ml 注射器Becton Dickinson309659
BD 26 G 3/8 皮内斜面针头Becton Dickinson305110
Buffer RLT 裂解缓冲液Qiagen79216
Difco 胰蛋白酶大豆琼脂Becton Dickinson236950
去纤维羊血PML MicrobiologicalsA0404
RNAqueous-Micro 试剂盒AmbionAM1931
M-MuLV 逆转录酶New England BiolabsM0253L
GoTaq qPCR 预混液PromegaA6001

参考文献

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