我们旨在通过将三种脂肪酸（油酸、亚油酸和亚麻酸）及霍乱毒素溶解后进行细胞存活率检测，确定其对细胞存活无显著不利影响的可耐受浓度。
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摘要
摘要
脂肪酸在预防和缓解人及非人类疾病方面的作用已得到广泛记录，并持续受到深入研究。这些作用包括影响传染性和非传染性疾病，例如预防炎症以及增强对传染病的黏膜免疫。霍乱是由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）引起的一种急性肠道疾病，主要发生在发展中国家，若不及时治疗，可能导致死亡。尽管已有霍乱疫苗，但其保护效果并非总是理想，因此需要其他预防手段。本研究旨在分别利用小鼠BALB/C巨噬细胞和人肠道上皮细胞，确定三种脂肪酸（油酸、亚油酸和α-亚麻酸）以及霍乱毒素的可耐受浓度。我们对上述脂肪酸进行溶解处理，并通过细胞增殖实验确定这些脂肪酸中对人肠道上皮细胞活力无损害作用的浓度范围及具体浓度。同时，我们将霍乱毒素溶解后用于实验，以确定其在BALB/C巨噬细胞中不会显著降低细胞活力的浓度范围和具体浓度。
我们发现最佳脂肪酸浓度在1-5 ng/μl之间，霍乱毒素的浓度则应低于< 每次处理30 ng。该数据可能有助于未来研究探索脂肪酸在预防或缓解霍乱感染中所发挥的保护性黏膜作用。
引言
油酸、亚油酸和α-亚麻酸等脂肪酸的健康益处已被广泛记录，并持续受到关注。例如，油酸有助于促进亲脂性药物在体内的渗透1,2，当替代饱和脂肪酸时可使冠心病风险降低24%3，并可用于治疗肾上腺脑白质营养不良症4，后者是一种与脂肪酸代谢相关的X连锁遗传病。亚油酸在哺乳动物体内是花生四烯酸的必要前体，但与油酸不同，人体无法自行合成亚油酸，必须通过外部来源获取，例如摄入亚麻籽5。研究表明，亚油酸具有多种有益健康的效应，包括：延缓皮肤衰老6；抗炎作用7；抑制结肠直肠癌和前列腺癌细胞的增殖8；以及对抗肥胖和促进心血管健康的能力9。α-亚麻酸则在减轻牙周炎症10以及调节血栓素和前列环素的生物合成中发挥重要作用11。
Arpita12 研究了胆汁脂肪酸和胆固醇对 V. cholerae 毒力因子表达和运动性的影响。Yamasaki13 指出，红辣椒的甲醇提取物及其他天然提取化合物可能降低霍乱毒素的产生。可以设想，在预防和缓解霍乱等传染病方面，使用富含上述脂肪酸的食物（如亚麻籽）可能通过提供黏膜免疫发挥积极作用。我们开展了研究，以溶解脂肪酸，并利用细胞增殖实验确定人类肠上皮细胞在不影响细胞活力的前提下所能耐受的脂肪酸最高浓度。我们假设，油酸、亚油酸和α-亚麻酸在较低浓度下对细胞活力具有有益作用，但在较高浓度下会对细胞产生毒性。我们还对霍乱毒素进行了溶解处理，并确定了BALB/C小鼠巨噬细胞在细胞活力未显著下降的情况下所能耐受的霍乱毒素最高浓度。我们假设，即使在极低浓度下，霍乱毒素也会对细胞活力产生毒性作用。将霍乱毒素溶解并用于确定细胞在存活率无显著下降时所能耐受的最大毒素量的方法，为未来的研究提供了优势。例如，结合上述方法可用于判断脂肪酸是否能为细胞提供针对霍乱感染的黏膜免疫。据我们所知，这一思路和方法尚未被探索。
我们讨论了如何利用初步数据，在后续研究中确定油酸、亚油酸和亚麻酸是否能为细胞提供针对霍乱感染的黏膜免疫能力。
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方案
1. 组织培养
- 使用 Mus musculus 用于霍乱毒素检测的巨噬细胞（BALB/c小鼠）。首先将所有培养物 M. musculus 按照厂商说明书处理细胞。
- 在含有10%胎牛血清和1%抗生素/抗真菌剂的Dulbecco改良Eagle培养基（含L-谷氨酰胺）中，或在含有10%胎牛血清、5% L-谷氨酰胺和1%抗生素/抗真菌剂试剂的RPMI 1640基础培养基中培养BALB/c小鼠细胞。
- 在75 cm²培养瓶中培养细胞2 带透气盖的Corning培养瓶，37 °C、95% 空气和5% CO₂条件下培养2.
- 在送达后24小时内，按照制造商说明培养人肠道上皮细胞，用于脂肪酸测定。
- 在75 cm²培养瓶中培养人肠道上皮细胞2 Corning 培养瓶（带透气盖）中加入含 10% FBS 和 30 ng/ml 人 EGF 的 HybriCare 培养基，在 37 °C 培养。根据制造商说明，不得使用抗生素/抗真菌试剂。
- 当细胞融合度达到约70%时，按1:3比例进行传代。
- 在整个研究过程中，使用标准冻存方案冻存并复苏所有细胞。
- 注意： 对于大规模脂肪酸浓度测定，应首先使用生长更快、更易培养的小鼠巨噬细胞；对于精细尺度的脂肪酸浓度测定，则使用人上皮细胞。所有霍乱毒素处理实验均应使用小鼠巨噬细胞（见讨论部分）。
2. 脂肪酸与霍乱毒素处理
- 将公司提供的安瓿瓶中的油酸、亚油酸和亚麻酸转移至已灭菌的玻璃小瓶中。
- 将每种脂肪酸分别转移至已灭菌的离心管中，先用100%乙醇按1:6的比例溶解，再用RPMI 1640不完全培养基稀释，最终浓度为10 μg/μl。
- 涡旋混匀每种溶液，然后转移至玻璃小瓶中，于-20 °C冰箱中保存。
- 将细胞以每孔2,500个细胞的密度接种于96孔组织培养板中。
- 加入适量的完全培养基，使每孔总体积达到200 μl，用于脂肪酸处理，为MTT检测做准备。
- 经过24小时增殖期后，移除培养基并更换为新鲜培养基。
- 向各孔中加入待测脂肪酸的适当浓度（参见结果部分），再加入完全培养基使每孔总体积达到200 μl。
- 处理后的培养板在开始MTT检测前孵育24小时。
- 用PBS将霍乱毒素溶解至1 mg/ml的浓度，分装至冻存管中，并将冻存管储存在2-8 °C条件下。
- 对于细胞处理，将毒素用无菌PBS（pH 7.4）或不完全DMEM按1:100稀释，获得1 ng/μl的最终工作浓度。
- 为进行霍乱毒素处理以准备MTT检测，按上述方法接种细胞。
- 经过24小时增殖期后，按照脂肪酸处理所用的程序，向各孔中加入待测的适当浓度霍乱毒素（本研究的具体浓度参见结果部分）。
- 处理后的培养板在开始MTT检测前孵育24小时。
- 对于脂肪酸和霍乱毒素处理，分别以完全培养基处理作为阳性对照（本文中记为positive c），以70%乙醇处理作为阴性对照（negative c）。
- 所有样本和处理组至少进行三次重复（n=3），阳性对照组进行更多重复（本研究中n=6）。
3. MTT 检测
- 配制浓度为 2.5 mg/ml 的 MTT 储存液。
- 移除待测 96 孔板中每孔的溶液，并加入 200 μl 新鲜的完全培养基溶液。
- 向每孔中加入 10 μl MTT 溶液。
- 将培养板在 37 °C 下孵育 3–4 小时。
- 弃去培养基溶液，向每孔中加入 100 μl 含 0.04 M HCl 的异丙醇溶液。
- 在室温下孵育 5 分钟。
- 将每孔中的溶液转移至新的离心管中。
- 在室温下以 20,000 × g 离心 1 分钟，或直至形成沉淀。
- 取每份样品 20–40 μl 转移至微孔板读数仪中。
- 使用分光光度计在 570 nm 处测定吸光度。
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结果
脂肪酸最适浓度的确定
脂肪酸的最佳浓度定义为细胞生长与对照组细胞相当或超过对照组细胞时的最高浓度，且实验结果具有相对较低的变异性。为确定油酸、亚油酸和亚麻酸的最佳浓度，首先以较大浓度梯度对细胞进行处理，随后采用较小梯度进一步优化。图1展示了细胞存活率随脂肪酸浓度递增而变化的情况，以阳性对照为基准。显然，无论哪种脂肪酸，细胞均无法耐受高于100 ng/μl的浓度。单因素方差分析（one-way ANOVA）显示，每种处理中至少有一个均值与其他均值存在显著差异（p<0.001）。事后检验（Tukey法）表明，对于油酸处理，除1 ng/μl浓度外，其余各组均与阳性对照存在显著差异。有趣的是，由于变异性较高，该浓度组与阴性对照相比也仅呈现边缘性非显著差异。对于亚油酸和亚麻酸，单因素方差分析同样显示至少有一个均值与其他均值存在显著差异（p<0.001）。Tukey事后检验进一步揭示，这两种脂肪酸在10 ng/μl浓度下的处理均值与阳性对照无显著差异，但与阴性对照存在显著差异（p<0.05）。<...
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讨论
脂肪酸和霍乱毒素浓度的建议
尽管脂肪酸增强黏膜免疫的确切机制尚不明确，但已有若干研究试图探讨其有益作用。本研究旨在提供一种方法，用于确定细胞可耐受的脂肪酸最高浓度，以及在不影响细胞存活率的前提下细胞可耐受的霍乱毒素最高浓度。
为了确定三种脂肪酸（油酸、亚油酸和亚麻酸）以及霍乱毒素在对细胞处理时不会对细胞活力产生显著不良影响的浓度，我们将这些脂肪酸和霍乱毒素溶解后，以不同浓度处理培养的细胞，随后通过 MTT 实验评估细胞活力。根据我们的方法和结果，我们提供了适用于未来研究的脂肪酸和霍乱毒素浓度范围（见下文）。建议在使用人肠上皮细胞时，油酸、亚油酸和亚麻酸的浓度分别为 1、5–10 和 5–10 (ng/μl)。同时，建议在使用 BALB/C 小鼠巨噬细胞时，霍乱毒素的用量为 <30 ng（每 200 μl，见方法部分）。我们注意到，至少在霍乱毒素处理组中，与阳性对照相比，细胞活力未观察到显著差异。然而，我们的建议是基于在较高毒素浓度暴露下所观察到的细胞活力相对较大的变异性而提出的。
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披露
本研究的作者对本研究的结果无任何经济利益。本研究的资金由 Kean 大学提供给 FT；然而，FT 目前就职于 Kingsborough 社区学院。
致谢
我们感谢 Paula Cobos 和 Evros Vassiliou 博士分别在实验室协助和提供小鼠巨噬细胞方面给予的支持。我们还感谢实验室主管 Richard Criasia 在材料方面的指导和帮助。最后，作者感谢 Ramanpreet Kaur 在视频制作方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞/试剂 | |||
| Mus musculus 巨噬细胞 | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | ATCC | 30-2002 | |
| L-谷氨酰胺 | ATCC | 30-2115 | |
| 胎牛血清 | Bio-west | S0250 | |
| 抗生素/抗真菌剂 | Hyclone | SV3007901 | |
| 人肠上皮细胞 | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare 培养基 | ATCC | 46-X | |
| 油酸 | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| 亚油酸 | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| α-亚麻酸 | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| 仪器 | |||
| BD Falcon 96孔细胞培养板 | BD Biosciences | 351172 | |
| 配备 Dynex Revelations 4.22 软件的分光光度计 | Dynex | 91000101 |
参考文献
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