鸡胚尿囊膜上的 in ovo CAM-实验作为肉瘤的异种移植模型

摘要

将新鲜的肉瘤来源肿瘤组织、单细胞悬液以及稳定和瞬时荧光标记的永生化肉瘤细胞系移植到鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）上。in ovo 模型用于研究移植物（存活率、Ki67 增殖指数、坏死、浸润）和宿主（成纤维细胞浸润、血管长入）的行为特征。

摘要

肉瘤是一种极为罕见且具有异质性的疾病，这些特点均阻碍了新疗法的开发。肉瘤患者在经过分层后是实施个体化治疗的理想候选者，这也解释了目前人们为何致力于开发一种可重复且低成本的该疾病异种移植模型。鸡胚尿囊绒毛膜是一种天然的免疫缺陷宿主，能够支持移植物组织和细胞的生长，且不受物种特异性的限制。此外，该膜易于接触、操作，并可通过光学和荧光体视显微镜进行成像观察。组织学分析还可进一步实现对异源性细胞相互作用的详细研究。

本方案详细描述了将新鲜的肉瘤来源肿瘤组织、单细胞悬液以及稳定转染和瞬时荧光标记的已建立肉瘤细胞系（Saos-2 和 SW1353）在鸡胚内接种至尿囊绒毛膜（in ovo）的技术。鸡胚存活率可达 75%。该模型可用于研究移植物相关指标（活性、Ki67 增殖指数、坏死、浸润）以及宿主反应（成纤维细胞浸润、血管长入）。对于单细胞悬液的局部接种，ECM 凝胶相较于惰性包埋材料具有显著优势。Ki67 增殖指数与细胞距离尿囊绒毛膜（CAM）表面的深度以及细胞在 CAM 上作用的时间有关，后者决定了添加治疗药物的时间窗口。

引言

肉瘤是一种罕见的结缔组织肿瘤，由于对治疗产生耐药性，其死亡率较高^1,2。患者生存率的提高受到以下因素的限制：年发病率低、肿瘤类型高度异质，以及据报道肉瘤细胞在体外培养中难以生长in vitro^3,4。

利用培养细胞进行临床前治疗评估已表明，一些新的、看似具有活性的分子 体外 并不总能反映临床环境中的结果。此外，基因表达芯片揭示的基因组异常并不总是与个体患者的肿瘤行为特征相关。^5-7为了解决这些问题，个性化医学的重要性日益凸显，这体现在对异种移植模型的需求不断增加^8-12.

一个 体内 该检测方法能够反映实体瘤中癌细胞与宿主组织微环境之间复杂的相互作用，而这种相互作用对于癌细胞的增殖和侵袭至关重要¹³目前我们正在研究使用绒毛尿囊膜实验（CAM实验）作为肉瘤可重复的异种移植模型^14,15该检测方法被广泛用于肿瘤血管生成的研究。^16,17然而，在文献中，我们发现该实验存在不同的实验方案，而其他研究则观察到，根据不同的实验方案，其生长或血管生成表现出显著差异。^18,19.

本文中，我们利用肿瘤移植物、肿瘤来源的单细胞悬液以及已建立的肉瘤细胞培养物，....

方案

概述请参见图1。

肿瘤组织

1. 肿瘤样本的获取与制备

使用患者材料需获得伦理委员会的批准，并且必须从患者处获取知情同意。

1. 在干预时采集具有代表性的组织样本（至少 1 cm³），可以是肉瘤的活检或切除组织。活检的合适部位应通过动态增强 MRI 确定。
2. 立即将组织样本放入含有 DMEM 的无菌小瓶中，DMEM 中需添加 1,000 U 青霉素和 1 mg/ml 链霉素。
3. 立即（30–90 分钟内）将小瓶运送至实验室。

所有后续操作均在层流条件下进行。

4. 将小瓶中的内容物倒入无菌培养皿中。
5. 使用无菌手术刀将肿瘤样本切成最大体积为 1 mm³ 的小块。去除所有钙化组织，因其会影响后续组织处理。
6. 随机选取 10 个肿瘤移植物用于 CAM 接种。

2. 肿瘤来源单细胞悬液的制备

预计耗时：3 小时。

1. 称量样品的剩余组织。
2. ....

结果

CAM 的评估

肿瘤移植物会黏附于尿囊绒毛膜（图 2A）。来自患者组织的单细胞悬液常呈现干燥、略微隆起的斑块状结构（图 2D）。切除尿囊绒毛膜后，膜会出现明显的皱缩现象（图 2E 和 图 2F）。

对于商业细胞系，随着时间推移，病灶会变得更加不透明，表明细胞增殖。不同细胞系在ECM凝胶中于鸡胚尿囊膜（CAM）上表现出独特的生长模式。SAOS2形成扩散性病灶，自接种后第7天起表面显著增大，同时GFP信号保持较强，提示细胞具有活性。SAOS2细胞的迁移可沿CAM的血管平行可视化（图3）。通过体视显微镜观察时，若不使用滤光片，可见到血管结构，但肿瘤细胞无法分辨；而插入GFP滤光片后则无法观察到血管。通过交替切换滤光片的开启与关闭，可清晰看到迁移细胞与血管之间的紧密接触。病灶内部可观察到点状出血（图4， 第.......

讨论

接种与收获时间

接种时间的确定采用SAOS2细胞在ECM凝胶中进行（共36个CAM），接种时间在胚胎发育的第5天至第10天之间变化。

在孵育第9天之前，绒毛尿囊膜（CAM）的尺寸尚不足以稳定支撑我们所施加的细胞外基质（ECM）凝胶。在收获时，肿瘤细胞有时需从较深的CAM层中回收，部分ECM凝胶样本则松散地漂浮在蛋清中或位于CAM表面。在第5和第6天接种时，难以避免将肿瘤细胞直接接触鸡胚，从而导致鸡胚畸形或死亡。自第9天起，大多数鸡蛋中的CAM已完全覆盖窗口下方的区域，且ECM凝胶斑块在收获时能牢固黏附于CAM表面。因此，我们确定鸡胚发育第9天为最佳接种时间。

为了确定最佳收获时间，SAOS2 和 SW1353 分别在接种后第 1、2（仅 SAOS2-GFP）、4、5、6、7 和 8 天，或在胚胎发育第 10 至 17 天期间收获。根据这些变化，观察到在 CAM 上的应用时间长度差异为 1 至 12 天。

Knigh.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系核转染试剂盒 V	Amaxa	VCA-1003
胶原酶 2 溶液（500 U/ml RPMI 1640）	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
DNase 溶液	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
小鼠单克隆抗体 Ki67	Dako Denmark	MIB-1
多聚甲醛	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 载体	Clontech	632470
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Invitrogen	25300054
Vybrant 细胞标记 DiI	Lifetechnologies	22885
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen	C10227
数码彩色相机	Leica	DFC 340 FX
数字式蛋孵箱	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C 型管	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs 组织解离仪	Miltenyi Biotech	130-093-235
含 h_tumor 方案的 Gentlemacs 解离仪用户手册	Miltenyi Biotech
[header]
半透性粘性薄膜（Suprasorb F）	Lohmann&Rauscher	20468
体视荧光显微镜	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film 自动盖片机	Sakura	6400
ultraView 通用 DAB 检测试剂盒	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana 自动玻片染色机	Ventana Medical Systems	Benchmark XT