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方法文章

富含亮氨酸重复序列激酶1和2的放射性磷酸盐代谢标记

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DOI：

10.3791/50523

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2013年9月18日

 ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

本文内容

摘要

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有多个结构域的蛋白质，包含GTP酶和激酶结构域，并可在细胞内发生磷酸化。本文中，我们介绍一种在细胞中使用32P正磷酸盐标记LRRK1和LRRK2的实验方案，从而提供一种检测其在细胞内总体磷酸化水平的方法。

摘要

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有相似结构域组织的同源蛋白，包括丝氨酸-苏氨酸激酶结构域、复杂蛋白中的Ras结构域（ROC）、ROC的C端结构域（COR），以及位于N端的富含亮氨酸重复序列和类似锚蛋白的重复序列。LRRK1和LRRK2在细胞内的确切功能尚未完全阐明，但已有研究表明LRRK1参与酪氨酸激酶受体信号通路1,2，而LRRK2则与帕金森病的发病机制相关3,4。本报告中，我们介绍一种利用32P-正磷酸盐对细胞中的LRRK1和LRRK2蛋白进行标记的实验方案，从而实现对这两种蛋白在细胞内总体磷酸化水平的测定。简言之，将带有亲和标签的LRRK蛋白在HEK293T细胞中表达，并将细胞置于含有32P-正磷酸盐的培养基中孵育。细胞仅需数小时即可将32P-正磷酸盐吸收，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子被放射性标记。通过亲和标签（3xflag），利用免疫沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离出来。免疫沉淀产物经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，并通过放射自显影（32P信号）和蛋白质印迹检测（蛋白信号）对掺入的磷酸基团进行分析。该方案可轻易地被调整用于监测任何可在细胞中表达并可通过免疫沉淀分离的其他蛋白的磷酸化状态。

引言

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有相似结构域组织的多结构域旁系同源蛋白。这两种蛋白均编码一个类似于Ras家族GTP酶的GTP酶序列（即复杂蛋白中的Ras，Ras of Complex Proteins，ROC），以及一个ROC结构域的C端结构域（COR），因此被归类为ROCO蛋白家族成员5,6。在ROC-COR结构域串联的N端，两种蛋白均含有一个富含亮氨酸重复序列的结构域和一个类似锚蛋白的结构域，而只有LRRK2还额外编码一个犰狳重复结构域6-8。在ROC-COR结构域的C端，两种蛋白均具有一个丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，而只有LRRK2在C端区域编码一个WD40结构域8。LRRK1和LRRK2确切的细胞功能尚未完全阐明，但已有研究表明LRRK1参与酪氨酸激酶受体信号通路1,2，而遗传学证据则表明LRRK2在帕金森病的发病机制中发挥重要作用3,4。

蛋白质的磷酸化是细胞中常见的调控机制。例如，磷酸化对于酶的激活或蛋白质向信号复合物的募集可能是必需的。LRRK2 的细胞磷酸化已被广泛表征，磷酸化位点作图显示，大多数细胞磷酸化位点位于锚蛋白重复区与富含亮氨酸重复区之间的簇状区域9-11。尽管目前尚未完成对 LRRK1 细胞磷酸化位点的定位，但来自 COS7 细胞中免疫沉淀的 LRRK1 蛋白印迹的磷酸化蛋白染色研究的证据表明，LRRK1 蛋白在细胞中会发生磷酸化12。

本文提供了一种利用32P-正磷酸盐代谢标记法测定细胞系中LRRK1和LRRK2总体磷酸化水平的基本实验方案。整体策略简明直接：在HEK293T细胞中表达带有亲和标签的LRRK蛋白，并将其置于含有32P-正磷酸盐的培养基中孵育。细胞仅需数小时即可吸收32P-正磷酸盐，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子被放射性标记。随后利用亲和标签（3xflag）通过免疫沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离出来。免疫沉淀产物经SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，再通过放射自显影（32P信号）和蛋白质印迹检测（蛋白信号）对蛋白条带中掺入的磷酸基团进行分析。

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方案

本实验方案采用放射性32P标记的正磷酸盐来追踪细胞内LRRK2的磷酸化过程。需要注意的是，所有涉及放射性试剂的操作均应采取适当的防护措施，以尽量减少操作人员和环境受到放射性辐射的暴露。含有可释放电离辐射同位素的化合物可能对人体健康造成危害，其使用受到机构和国家层面的严格许可和法规管控。本方案中的实验是在比利时鲁汶天主教大学（Katholieke Universiteit Leuven，KU Leuven）完成开放源辐射使用培训后，并遵循该校健康、安全与环境部门提供的良好实验室规范指南进行的。本方案中包含多个常规广泛使用的技术步骤，如细胞培养、SDS-PAGE、蛋白质印迹（western blotting），此处提供的是本实验室具体应用的实验细节。需要指出的是，不同实验室的实验条件可能存在差异，因此确保放射性物质安全操作的具体措施应根据每个新实验室的具体情况进行相应调整。

使用开放源辐射需事先获得监管批准，而负责实验室研究中开放源辐射的监管机构因国家而异。用户应咨询所在机构的辐射安全官员，以确保操作符合当地的法规和规定。有关监管机构的信息如下：比利时联邦核控制局（http://www.fanc.fgov.be，网站语言为法语或荷兰语）；英国健康与安全执行局（http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm）；美国核管理委员会（http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html）；加拿大核安全委员会（http://nuclearsafety.gc.ca/eng/）；德国联邦辐射防护局（http://www.bfs.de/de/bfs）。本实验方案相关的安全注意事项已在文中注明，并以放射性三叶符号标示（放射性危险警示符号；核安全或辐射研究概念。）。

1. 细胞代谢标记

  1. 准备细胞以进行标记。
    1. 在 DMEM 培养基（含 8% 胎牛血清和庆大霉素）中，按照标准培养条件（37 °C，5% CO2）培养 HEK293T 细胞系。
    2. 将细胞扩增至足够数量，以获得每样品至少 1 × 106 个细胞用于检测。
    3. 用胰蛋白酶消化细胞，并以每孔 106 个细胞的密度接种至 6 孔板（直径 35 mm）中。
    4. 接种细胞后 24 小时，通过转染或慢病毒载体介导的转导表达 3xflag-LRRK2 蛋白。
      1. 进行转染时，每样品将 4 μg DNA（pCHMWS-3xflag-LRRK2 质粒13-15 或 pCHMWS-3xflag-LRRK1 质粒15）与 8 μl 线性聚乙烯亚胺（线性 PEI，1 mg/ml）加入 80 μl DMEM（无添加物）中混合。室温孵育 15–30 分钟使其形成复合物，然后将复合物加入细胞培养液中并充分混匀。
      2. 进行慢病毒载体介导的转导时，将编码 3xflag-LRRK1 或 3xflag-LRRK2 的慢病毒载体（LV-3xflag-LRRK1、LV-3xflag-LRRK2）稀释后加入培养基中（一般建议使用的转导单位数为细胞数量的两倍，i.e. 慢病毒载体中功能性病毒颗粒的数量）。LV-3xflag-LRRK1/2 的制备方法此前已有描述15。
    5. 当细胞融合度达到 80–100%（转染或转导后约 48 小时），用预热（37 °C）的无磷酸盐 DMEM 洗涤细胞。
  2. 用 32P-正磷酸盐标记细胞。
    1. 操作放射性物质时，应牢记一般安全原则。
      1. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。所有涉及 32P 的操作均应在指定的放射性工作区域进行。
      2. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。应穿戴适当的个人防护装备——根据本实验室的标准操作规程，包括实验服、双层手套和护目镜。
      3. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。所有涉及 32P 的操作应使用 6 mm 厚的有机玻璃屏蔽板，以最大限度减少人员暴露。
      4. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。应始终使用个人监测设备——在 KUL，所有经认证的开放源辐射使用者均需在实验服胸前口袋佩戴胶片徽章，以监测实验过程中的辐射暴露。
      5. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。所有实验台面应在使用前后用盖革计数器检测放射性。
      6. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。所有可能被污染的一次性耗材必须严格按照机构关于放射性废物处理的指南进行处置。
    2. 在超净工作台中，为每块待标记的 6 孔板细胞准备一个 Falcon 管，其中加入 2.1 ml 无磷酸盐 DMEM（预热至 37 °C）。
      1. 例如，若要标记 6 孔板中所有孔的细胞，则需准备 12.6 ml 培养基（=6 × 2.1）。此体积可确保每孔使用 2 ml 培养基，并额外提供 5% 的体积余量。
    3. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。准备进行电离辐射实验的工作台。工作区域应铺设防溅垫，并在其上放置吸水衬垫。若使用单面防水的衬垫，请将吸水面朝上放置。
    4. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。在工作台上放置一个有机玻璃罐，并将无磷酸盐培养基的试管置于其中。
    5. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。从冰箱中取出装有 32P 标记正磷酸盐的小瓶的铅衬容器，并将其带至放射性工作台。使用盖革计数器检测容器外部是否存在放射性污染。
    6. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将 32P 标记的正磷酸盐稀释至无磷酸盐 DMEM 试管中，终浓度为 24 μCi/ml。
      1. 注：按每 6 孔板孔 2 ml 计算，相当于每平方厘米培养细胞使用 5 μCi 32P 标记的正磷酸盐/cm2。
      2. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将试管保持在有机玻璃罐内。
    7. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将剩余的 32P 标记正磷酸盐小瓶密封后放回冰箱。
    8. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将待标记的细胞 6 孔板从培养箱中取出，并放置于放射性工作台上。
    9. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。吸去培养基上清并弃去。每孔加入 2 ml 含 32P 标记正磷酸盐的无磷酸盐培养基。
    10. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将培养板放入有机玻璃盒中，然后使用盖革计数器检测容器外部是否存在放射性污染。
    11. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将装有细胞的有机玻璃盒转移至专用于同位素代谢标记的真核细胞培养箱中。
    12. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1–20 小时。
      1. 通常建议标记时间不少于 3 小时。可根据具体蛋白需求通过时间进程实验确定最佳孵育时间。
    13. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。可选：对细胞进行化合物处理。
      1. 在涉及化合物处理（如激酶抑制剂）的实验中，可在无化合物条件下进行初始孵育以完成标记，随后加入化合物处理步骤。在完成所需孵育时间后，将装有培养板的有机玻璃盒从培养箱中取出并转移至放射性工作台。
      2. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。吸去标记培养基，并更换为预热的无磷酸盐培养基，其中已按所需浓度稀释化合物。将废弃的培养基收集至置于有机玻璃罐中的 50 ml 离心管中。
      3. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将细胞重新放回有机玻璃盒中，并置于细胞培养箱中孵育所需时间。
  3. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。收集标记细胞的裂解液。
    1. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。吸去细胞培养基并弃入置于有机玻璃罐中的废液收集管中。
    2. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。用冰浴 TBS（Tris 50 mM，NaCl 150 mM，pH 7.4，每次 2 ml）冲洗细胞两次，每次冲洗液均弃入置于有机玻璃罐中的废液收集管中。
    3. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。每孔加入 0.5 ml 冰浴免疫沉淀（IP）裂解缓冲液，通过反复吹打使所有裂解细胞悬浮，从而收集裂解液。
      1. 提前配制所需体积的 IP 裂解缓冲液（每样品 0.5 ml 加 5% 余量），并在使用前新鲜加入蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。
      2. 裂解缓冲液的组成为：Tris 20 mM（pH 7.5）、NaCl 150 mM、EDTA 1 mM、Triton 1%、甘油 10%、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。
    4. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将裂解液转移至微量离心管中，在冰上孵育至少 10 分钟。
    5. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。在微量离心机中以 >5,000 × g 离心 10 分钟。
    6. 放射性警示符号；核安全或辐射研究概念。将放射性废物弃置于专用的废物桶中，废物桶应存放于有机玻璃屏蔽板后方。

2. 分析目的蛋白的标记情况

  1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.通过免疫纯化（IP）分离目标蛋白。
    1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将含有离心后裂解液的微量离心管放回冰上，用移液器吸取上清液，转入另一含有10 μl平衡好的Flag-M2琼脂糖珠（equilibrated flag-M2 agarose beads）的微量离心管中。
      1. 提前准备好含有平衡好的flag-M2琼脂糖珠的离心管。
      2. 为此，用移液器取适量的Flag-M2琼脂糖浆液，每份样品对应10 μl床体积，并额外增加5%过量。
        1. 通常，10 μl 沉淀体积的微珠相当于 20 μl 悬液。更多细节请参考产品数据表。
      3. 用IP裂解缓冲液以3倍于凝胶床体积的体积重复洗涤3次，使磁珠达到平衡。
      4. 将平衡好的磁珠均匀分配至与样本数量相同的离心管中，每管10 μl床体积。用各样本的标识符标记各管。
    2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将微量离心管转移至已标记放射性三叶符号的50 ml离心管中（每管约6个微量离心管），并置于冰上保存。
    3. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将样品转移至冷室指定区域内、亚克力防护罩后的旋转装置上，在4 °C条件下旋转混匀1-20小时。
    4. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将样品转移至冰上指定的工作区域。
    5. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在微型离心机中离心（1,000 × g，1 分钟）收集与蛋白结合的 Flag-M2 琼脂糖珠，弃去上清液至废液收集管中。
    6. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.用1 ml免疫沉淀洗涤缓冲液重悬结合有蛋白的Flag-M2琼脂糖珠进行洗涤。
      1. IP洗涤缓冲液的组成：25 mM Tris（pH 7.5）、400 mM NaCl、1% Triton。建议在洗涤缓冲液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以防止目标蛋白因共纯化的蛋白酶作用而降解，或因共纯化的磷酸酶作用而发生去磷酸化。
      2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在微型离心机中离心收集与Flag-M2琼脂糖珠结合的蛋白质（1,000 × g，1分钟），弃去上清液至废液收集管中。
      3. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.重复洗涤步骤3次。
    7. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.洗涤后，将珠子重悬于1 ml IP漂洗缓冲液（Tris 25 mM pH 7.5, MgCl2 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）2 mM，吐温-0.02%，β-甘油磷酸钠 5 mM，Na3VO4 0.1 mM
    8. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在微量离心机中离心（1,000 × g，1 分钟）结合有蛋白的 Flag-M2 琼脂糖珠，弃去上清液至废液收集管中。彻底去除所有过量缓冲液。
    9. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将珠子重悬于40 μl IP样品SDS上样缓冲液（Tris-HCl 160 mM pH 6.8，SDS 2%，DTT 0.2 M，甘油40%，溴酚蓝2 mg/ml）中。
      1. 样品可立即进行分析，或于-20 °C冰箱中保存以供后续分析。
        1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在 -20 °C 下储存样品时，应将样品放入试管架或盒子中，再置于丙烯酸箱内，并存入标有放射性三叶符号、专用于储存放射性样品的冰箱中。
    10. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将放射性废物弃置于专用废物桶中，废物桶存放于有机玻璃屏蔽板后方。
  2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.通过 SDS-PAGE 分离免疫沉淀样品，并转印至 PVDF 膜。
    1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将样品在上样缓冲液中于 95 °C 加热 2 分钟，并在 1 分钟内离心 >1,000 × g 离心以收集珠子。
    2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在放射性工作台的亚克力屏蔽板后方准备蛋白质凝胶电泳装置。
    3. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将样品上样至3-8% Tris-乙酸SDS-PAGE凝胶。
      1. 此类凝胶适用于分离高分子量（HMW）蛋白质。其他类型的凝胶也可能适用，例如4-20% Bis-Tricine凝胶或Tris-甘氨酸4-20%凝胶。
      2. 使用适合分辨高分子量蛋白质大小的分子量标记物。
    4. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在150 V电压下电泳1小时。
    5. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.电泳结束后，将凝胶从其塑料外壳中取出，并转移至含有蛋白质印迹转膜缓冲液的容器中。
      1. Western blot 转膜缓冲液成分：Tris 50 mM，Glycine 40 mM，SDS 0.04%，甲醇 20%。
      2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.切下凝胶中突出的部分，例如加样孔间的隔片以及凝胶底部突出的部分。
    6. 每块凝胶准备一张聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，浸入甲醇中1分钟，然后置于转移缓冲液中。
      1. 将膜裁剪至与凝胶相同大小，外加3 mm的边距。
    7. 将半干转印模块放置于放射性工作台，取下盖子和上层电极板。
    8. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在半干式转印模块的表面制备转印夹心结构。
      1. 用转移缓冲液润湿一张超厚（2.5 mm 厚，7.5 × 10 cm 大）的印迹滤纸，置于印迹模块的底板上。
      2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将预先润湿的PVDF膜置于印迹滤纸上。
      3. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将凝胶小心地放置在PVDF膜上，并去除任何气泡。
      4. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.用转移缓冲液浸湿一张额外厚的印迹滤纸，并将其放置在印迹模块的底板上，完成印迹三明治结构。彻底去除印迹三明治中可能存在的所有气泡。
        请注意，此处所述方法适用于BioRad trans-blot SD系统，该系统电极设置使蛋白质向下迁移并转印至膜上。其他印迹系统也可采用这些步骤，仅需进行少量调整，例如根据不同的转印方向进行相应修改，或在使用槽式转印时，额外产生的液体废液需参照上述电泳缓冲液的方式进行处理。
    9. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.用吸水纸吸去多余的缓冲液，然后装上半干转印模块的上层板和盖子。
    10. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.以15 V电压转移蛋白质1-2小时。
    11. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.在此期间，清洁电泳模块。
      1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将放射性废物弃置于专用废物桶中，废物桶存放于有机玻璃屏蔽板后方。
      2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.用蒸馏水（AD）冲洗电泳模块，并将冲洗液弃入放射性液体废物容器中。
    12. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.转膜后，从转印模块中取出带有印迹蛋白的PVDF膜。
    13. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.可选：对转印后的蛋白质进行Ponceau S染色以观察蛋白质。
      1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将印迹转移至含有丽春红S溶液的浅孵育容器中，孵育5分钟。
      2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.用AD快速冲洗2次。
    14. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.干燥膜。
  3. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.进行放射自显影。
    1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将膜暴露于磷光板上1-5天。
    2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.使用 Storm 840 磷光扫描仪或同等设备读取暴露的32P磷光板，并将图像保存为高分辨率 tiff 格式。
  4. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept. 通过免疫检测法检测蛋白质水平。
    1. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.用甲醇短暂浸泡膜以使其复水，然后转移至含有 PBS 的浅型印迹孵育容器中。
    2. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.用含5%脱脂奶粉的PBST（含0.1% Triton的PBS）封闭膜。
    3. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.将印迹膜与抗 LRRK2 抗体孵育13,16 或抗Flag抗体，并进行相应的洗涤步骤和二抗孵育。
    4. Radioactive symbol for hazard warning; nuclear safety or radiation study concept.进行化学发光检测以确认 LRRK2 蛋白的相对表达水平。
  5. 量化掺入 32P 在 LRRK2 中。
    1. 使用适当的软件（如美国国立卫生研究院网站提供的免费 ImageJ 软件）对印迹放射自显影图和免疫反应条带进行密度分析http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. 以放射自显影信号与免疫反应性水平的比值计算磷酸盐掺入量。

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结果

为了比较细胞中LRRK1和LRRK2的整体磷酸化水平，将带有3xflag标签的LRRK1和LRRK2在HEK293T细胞中表达15。细胞培养于6孔板中，并用32P标记，随后按照上述方案文本所述进行分析。图1显示了LRRK1和LRRK2在HEK293T细胞中代谢标记的代表性结果。 在LRRK1和LRRK2中均观察到放射性磷酸盐的掺入。通过对32P信号水平进行定量，并以抗flag抗体免疫检测信号的密度分析结果归一化蛋白表达量，发现LRRK1的平均磷酸化水平低于LRRK2，但在所测试条件下该差异未达到统计学显著性（P>0.05）。

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讨论

本文提供了一种利用代谢标记法检测细胞系中LRRK1和LRRK2总体磷酸化水平的基本实验方案 32P-正磷酸盐。总体策略十分直接。在HEK293T细胞中表达带有亲和标签的LRRK蛋白，并将细胞暴露于含有 32P-正磷酸盐。该 32P-正磷酸盐在孵育数小时后即被细胞吸收，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子均被放射性标记。随后利用亲和标签（3xflag）通过免疫共沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离。免疫沉淀物经SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜，通过放射自显影分析掺入的磷酸基团32P信号）以及印迹上蛋白质的Western检测（蛋白信号）。本方案应与测量LRRK2自磷酸化的方案相区分。17 在细胞培养中而非在体外进行LRRK1或LRRK2的标记 体外 使用纯化蛋白进行磷酸化反应。

需要注意的是，此处提供的详细实验方案可根据实验需求进行多种调整。例如，由于标记在大多数常见的实验室细胞系中效率较高，因此本方案并不局限于使用 HEK293T 细胞系。此外，也可使...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们还感谢迈克尔·J·福克斯基金会对本研究的支持。感谢弗拉芒研究基金会（FWO）（FWO 项目 G.0666.09，授予 JMT 的高级研究员奖学金）、IWT SBO/80020 项目 Neuro-TARGET 以及鲁汶大学（OT/08/052A 和 IOF-KP/07/001）提供的支持。本研究还部分得到了由博杜安国王基金会管理的 Druwé-Eerdekens 基金对 JMT 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷-32 放射性核素，1 mCi，1 ml 水中含磷酸氢二钠缓冲液Perkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’s 修饰型 Eagle 培养基 (D-MEM) (1X)，液体（高葡萄糖）Invitrogen11971-025该培养基不含磷酸盐
抗 Flag M2 亲和凝胶SigmaA2220如需使用颜色为红色的凝胶（便于更清晰地观察珠粒），可选用货号 F2426 的等效产品。
加厚型印迹滤纸Bio-Rad1703965
丽春红 S 溶液SigmaP7170

参考文献

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