富含亮氨酸重复序列激酶1和2的放射性磷酸盐代谢标记

摘要

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有多个结构域的蛋白质，包含GTP酶和激酶结构域，并可在细胞内发生磷酸化。本文中，我们介绍一种在细胞中使用³²P正磷酸盐标记LRRK1和LRRK2的实验方案，从而提供一种检测其在细胞内总体磷酸化水平的方法。

摘要

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有相似结构域组织的同源蛋白，包括丝氨酸-苏氨酸激酶结构域、复杂蛋白中的Ras结构域（ROC）、ROC的C端结构域（COR），以及位于N端的富含亮氨酸重复序列和类似锚蛋白的重复序列。LRRK1和LRRK2在细胞内的确切功能尚未完全阐明，但已有研究表明LRRK1参与酪氨酸激酶受体信号通路^1,2，而LRRK2则与帕金森病的发病机制相关^3,4。本报告中，我们介绍一种利用³²P-正磷酸盐对细胞中的LRRK1和LRRK2蛋白进行标记的实验方案，从而实现对这两种蛋白在细胞内总体磷酸化水平的测定。简言之，将带有亲和标签的LRRK蛋白在HEK293T细胞中表达，并将细胞置于含有³²P-正磷酸盐的培养基中孵育。细胞仅需数小时即可将³²P-正磷酸盐吸收，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子被放射性标记。通过亲和标签（3xflag），利用免疫沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离出来。免疫沉淀产物经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，并通过放射自显影（³²P信号）和蛋白质印迹检测（蛋白信号）对掺入的磷酸基团进行分析。该方案可轻易地被调整用于监测任何可在细胞中表达并可通过免疫沉淀分离的其他蛋白的磷酸化状态。

引言

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有相似结构域组织的多结构域旁系同源蛋白。这两种蛋白均编码一个类似于Ras家族GTP酶的GTP酶序列（即复杂蛋白中的Ras，Ras of Complex Proteins，ROC），以及一个ROC结构域的C端结构域（COR），因此被归类为ROCO蛋白家族成员^5,6。在ROC-COR结构域串联的N端，两种蛋白均含有一个富含亮氨酸重复序列的结构域和一个类似锚蛋白的结构域，而只有LRRK2还额外编码一个犰狳重复结构域^6-8。在ROC-COR结构域的C端，两种蛋白均具有一个丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，而只有LRRK2在C端区域编码一个WD40结构域⁸。LRRK1和LRRK2确切的细胞功能尚未完全阐明，但已有研究表明LRRK1参与酪氨酸激酶受体信号通路^1,2，而遗传学证据则表明LRRK2在帕金森病的发病机制中发挥重要作用^3,4。

蛋白质的磷酸化是细胞中常见的调控机制。例如，磷酸化对于酶的激活或蛋白质向信号复合物的募集可能是必需的。LRRK2 的细胞磷酸化已被广泛表征，磷酸化位点作图显示，大多数细胞磷酸化位点位于锚蛋白重复区与富含亮氨酸重复区之间的簇状区域^9-11。尽管目前尚未完成对 LRRK1 细胞磷酸化位点的定位，但来自 COS7 细胞中免疫沉淀的 LRRK1 蛋白印迹的磷酸化蛋白染色研究的证据表明....

方案

本实验方案采用放射性³²P标记的正磷酸盐来追踪细胞内LRRK2的磷酸化过程。需要注意的是，所有涉及放射性试剂的操作均应采取适当的防护措施，以尽量减少操作人员和环境受到放射性辐射的暴露。含有可释放电离辐射同位素的化合物可能对人体健康造成危害，其使用受到机构和国家层面的严格许可和法规管控。本方案中的实验是在比利时鲁汶天主教大学（Katholieke Universiteit Leuven，KU Leuven）完成开放源辐射使用培训后，并遵循该校健康、安全与环境部门提供的良好实验室规范指南进行的。本方案中包含多个常规广泛使用的技术步骤，如细胞培养、SDS-PAGE、蛋白质印迹（western blotting），此处提供的是本实验室具体应用的实验细节。需要指出的是，不同实验室的实验条件可能存在差异，因此确保放射性物质安全操作的具体措施应根据每个新实验室的具体情况进行相应调整。

使用开放源辐射需事先获得监管批准，而负责实验室研究中开放源辐射的监管机构因国家而异。用户应咨询所在机构的辐射安全官员，以确保操作符合当地的法规和规定。有关监管机构的信息如下：比利时联邦核控制局（http://www.fanc.fgov.be，网站语言为法语或荷兰语）；英国健康与安全执行局（

结果

为了比较细胞中LRRK1和LRRK2的整体磷酸化水平，将带有3xflag标签的LRRK1和LRRK2在HEK293T细胞中表达¹⁵。细胞培养于6孔板中，并用³²P标记，随后按照上述方案文本所述进行分析。图1显示了LRRK1和LRRK2在HEK293T细胞中代谢标记的代表性结果。 在LRRK1和LRRK2中均观察到放射性磷酸盐的掺入。通过对³²P信号水平进行定量，并以抗flag抗体免疫检测信号的密度分析结果归一化蛋白表达量，发现LRRK1的平均磷酸化水平低于LRRK2，但在所测试条件下该差异未达到统计学显著性（P>0.05）。

讨论

本文提供了一种利用代谢标记法检测细胞系中LRRK1和LRRK2总体磷酸化水平的基本实验方案 ³²P-正磷酸盐。总体策略十分直接。在HEK293T细胞中表达带有亲和标签的LRRK蛋白，并将细胞暴露于含有 ³²P-正磷酸盐。该 ³²P-正磷酸盐在孵育数小时后即被细胞吸收，从而使细胞内所有含磷酸基团的分子均被放射性标记。随后利用亲和标签（3xflag）通过免疫共沉淀法将LRRK蛋白从其他细胞组分中分离。免疫沉淀物经SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜，通过放射自显影分析掺入的磷酸基团³²P信号）以及印迹上蛋白质的Western检测（蛋白信号）。本方案应与测量LRRK2自磷酸化的方案相区分。¹⁷ 在细胞培养中而非在体外进行LRRK1或LRRK2的标记 体外 使用纯化蛋白进行磷酸化反应。

需要注意的是，此处提供的详细实验方案可根据实验需求进行多种调整。例如，由于标记在大多数常见的实验室细胞系中效率较高，因此本方案并不局限于使用 HEK293T 细胞系。此外，也可使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷-32 放射性核素，1 mCi，1 ml 水中含磷酸氢二钠缓冲液	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’s 修饰型 Eagle 培养基 (D-MEM) (1X)，液体（高葡萄糖）	Invitrogen	11971-025	该培养基不含磷酸盐
抗 Flag M2 亲和凝胶	Sigma	A2220	如需使用颜色为红色的凝胶（便于更清晰地观察珠粒），可选用货号 F2426 的等效产品。
加厚型印迹滤纸	Bio-Rad	1703965
丽春红 S 溶液	Sigma	P7170