活体成像实验用于评估Ca2+和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

摘要

对暴露于亲脂性染料FM1-43的细胞进行活体成像，可精确测定孔形成毒素从质膜上被清除的动力学过程。该方法是一种灵敏的检测手段，可用于评估Ca²⁺、鞘磷脂酶及其他因素在质膜修复过程中的作用需求。

摘要

质膜损伤是一种常见事件，必须迅速修复伤口以确保细胞存活。Ca²⁺内流是一个关键的信号事件，可在约30秒内触发质膜机械性损伤的修复。最近的研究表明，哺乳动物细胞在被成孔毒素穿孔后，也能以依赖Ca²⁺的方式重新封闭其质膜，该过程涉及溶酶体酶酸性鞘磷脂酶的胞吐作用，随后发生孔道的内吞作用。本文描述了用于证明由毒素链球溶血素O（streptolysin O）导致通透化的细胞其重封过程同样迅速且依赖于Ca²⁺内流的实验方法。该实验设计可实现损伤事件的同步化，并通过成像和定量亲脂性染料FM1-43到达细胞内膜的程度，精确测定细胞恢复质膜完整性的能力。这一活细胞检测方法还可灵敏地评估外源添加的可溶性因子（如鞘磷脂酶）抑制FM1-43内流的能力，从而反映细胞修复其质膜的能力。本实验使我们首次证明，鞘磷脂酶的作用位于Ca²⁺依赖性胞吐作用的下游，因为在外源无Ca²⁺的条件下，向胞外添加该酶仍可促进已通透化细胞的重封。

引言

几十年来人们已经知道，细胞质膜在机械损伤后的修复是一个依赖于Ca²⁺的过程^1,2。后续研究表明，伤口处的Ca²⁺内流会触发细胞内囊泡在损伤部位剧烈地发生胞吐，这一过程对膜的重新封闭至关重要^3,4。通过检测加载到细胞胞质中的荧光染料的流失速率，可评估修复速度，结果表明膜的重新封闭在损伤后<30秒内完成⁵。最初提出了两种模型来解释胞吐作用在质膜修复中的必要性：1）“补丁”模型，该模型认为损伤处的Ca²⁺内流首先触发细胞内囊泡的同型融合，形成一个大的“补丁”，随后被应用于质膜以封闭伤口⁶；2）张力降低模型，该模型提出，在伤口周围通过Ca²⁺依赖性胞吐作用增加的膜成分可降低质膜张力，从而促进双分子层的重新封闭⁷。Ca²⁺触发的胞吐在质膜修复中的作用进一步得到了研究的支持，这些研究表明溶酶体含有Ca²⁺感受分子——突触结合蛋白VII型（synaptotagmin VII），它可促进溶酶体的胞吐以及受损细胞的质膜修复^8,9,10,11。

然而，更多证据表明，仅靠胞吐作用不足以促进质膜修复。除了质膜的机械性撕裂外，另一种常见的细胞损伤形式是由细菌^12,13 或免疫细胞^14,15产生的孔道形成毒素引起的通透化。与机械性撕裂不同，孔道形成蛋白会插入质膜中，形成稳定的、由蛋白质衬里的孔道，无法通过简单的膜“修补”或降低膜张力来重新封闭。有趣的是，研究发现哺乳动物细胞在孔道形成蛋白导致的通透化后，具有高效的质膜修复机制，且该过程同样需要细胞外Ca^{2+ 12}的存在。这一发现引发了一个问题：与机械性损伤类似，跨膜孔道从细胞表面的清除是否也是一个快速过程⁵？令人惊讶的是，我们最近的研究揭示，由孔道形成毒素导致通透化的细胞重新封闭过程与机械性损伤修复具有非常相似的特性：该过程依赖细胞外Ca²⁺，并在约30秒内完成。在对这一过程进行更深入研究时，我们最近发现，除了Ca²⁺调控的溶酶体胞吐作用外，质膜修复还涉及一种快速的内吞作用，该过程由溶酶体酶酸性鞘磷脂酶（ASM）的释放所触发，不仅对跨膜孔道的清除至关重要，而且对机械性损伤的修复也必不可少¹⁶。

为确定细胞在孔道形成蛋白作用导致通透性增加后的重新封闭动力学，本实验室改进了一种活体成像方法，该方法此前曾用于评估激光损伤的分离肌纤维的膜修复情况。¹⁷该检测方法依赖于亲脂性染料FM1-43的特性，该染料可稳定地嵌入脂质双分子层的外层，并伴随荧光强度的增强。当质膜双分子层发生破裂时，细胞外的染料得以进入并与细胞内膜结合，从而提供一种灵敏的检测方法，用于评估质膜损伤及修复情况^18,16,19,20. 为了将该检测方法用于评估细胞经成孔蛋白透化后重新封闭的能力，我们先将细胞在 4 °C 下与细菌毒素链球菌溶素 O（streptolysin O, SLO）预孵育，SLO 可结合膜胆固醇²¹随后可通过将细胞从冰上转移至加热显微镜载物台中的温热培养基中，实现细胞通透化的同步化，此过程可激活成孔蛋白的寡聚化及构象改变，从而形成跨膜孔道。与先前报道的激光损伤方法相比，该方法的优势在于可在显微镜视野中同时分析更多数量的细胞，从而更有效地取样细胞群体。鉴于机械损伤后细胞膜再封闭过程与孔道形成毒素诱导的细胞通透化在机制上的相似性，本文所述的实验方法为解析质膜修复这一基本生物学过程中所涉及的因素提供了极为通用且强大的工具。例如，我们展示了利用该方法可鉴定参与该过程的关键因子钙离子（Ca²⁺）²⁺ 修复过程中的依赖性与非依赖性步骤。

方案

1. ASM 的转录沉默

1. 在35 mm玻璃底培养皿（MatTek）中加入2 ml DMEM完全培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素），接种1.5 × 10⁵个HeLa细胞，于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。
2. 次日，吸除培养基，更换为2 ml DMEM低血清培养基（含4% FBS的DMEM），在转染siRNA复合物前至少孵育1小时。
3. 准备4个离心管用于siRNA寡核苷酸转染混合液。每转染一个35 mm培养皿，在A管和C管中各加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和4 μl Lipofectamine RNAiMax；在B管中加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和8 μl（160 pmol）对照用中等GC含量寡核苷酸（对照siRNA）；在D管中加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和8 μl（160 pmol）SMPD1寡核苷酸（siASM）。室温孵育5分钟。
4. 将A管与B管混合，形成对照siRNA的转染复合物；将C管与D管混合，形成ASM siRNA的转染复合物。室温孵育20分钟。
5. 将对照siRNA和ASM siRNA的转染反应混合物缓慢地逐滴加入相应的35 mm玻璃底培养皿中，于37 °C、5% CO₂条件下继续培养。转染后24小时，轻柔吸除培养基，更换为新鲜DMEM完全培养基。为实现高效的ASM基因敲低，应在活细胞成像前于37 °C、5% CO₂条件下进一步孵育约31小时（总计55小时）。

2. 活细胞显微镜观察用试剂的制备

1. 在不含 Ca²⁺ 的冷 1x PBS 中配制浓度为 100 ng/μl 的重组孔形成毒素链球菌溶素 O（Streptolysin O, SLO）溶液²⁺ 和 Mg²⁺这些实验中使用的SLO是一种组成型活性的半胱氨酸突变体，其活性不需要还原剂，由俄克拉荷马大学Rod Tweten博士惠赠。该毒素在 E. coli BL21 DE3中表达并按前述方法在天然条件下纯化¹⁶.
2. 配制FM1-43储存液：将FM1-43冻干粉溶于DMSO中，配制成25 mM的溶液。
3. 配制溶液A：将FM1-43储存液用含Ca²⁺的冷DMEM稀释²⁺ 至终浓度为 4 μM（每皿 MatTek 需要 1.5 ml），置于冰上保存，直至使用。
4. 制备溶液B：将FM1-43储存液用不含Ca的冷DMEM稀释²⁺ 和 10 mM EGTA（Ca²⁺-free DMEM) 至终浓度为 4 μM（每皿 MatTek 需 1.5 ml），置于冰上保存，直至使用。
5. 将溶液A和溶液B各1 ml分装至Eppendorf管中，预热至37 °C。
6. 将含钙的 DMEM 溶液保持在冰上²⁺和 Ca²⁺无血清DMEM

3. SLO 处理与未处理细胞中 FM1-43 摄入的活细胞成像

1. 将一个中等大小的浅金属容器装满碎冰，将其倒扣放入一个装有冰的大玻璃容器中，并额外添加冰块，仅使金属容器的底面暴露在外。在暴露的金属底部放置一块湿润的纸巾，以实现均匀的热传导。
2. 取一个经对照siRNA处理的MatTek培养皿（样本1），将其放置在冰冷的湿纸巾上。轻轻吸除所有培养基，并用冰冷的无Ca²⁺ DMEM洗涤3次。最后一次洗涤后，吸除培养皿中的全部培养基。
3. 为了在Ca²⁺存在条件下对未进行SLO损伤的细胞中与细胞结合的FM1-43进行成像（样本1），向35 mm玻璃底培养皿的中心玻璃盖玻片上加入180 μl冰冷的溶液B，并在冰上孵育5分钟（表1）。
4. 将MatTek培养皿置于配备环境控制舱（可维持温度、湿度和CO₂水平）的共聚焦显微镜载物台上，显微镜预热至37 °C。通过40X NA 1.3物镜（Nikon）找到待成像的细胞视野。如有条件，开启PerfectFocus或类似功能以校正热漂移。
5. 将1 ml预热的溶液A轻轻沿35 mm培养皿侧壁加入，并重新盖上环境控制舱的盖子（表1）。
6. 使用适当的成像软件（UltraView Vox Perkin Elmer转盘共聚焦显微镜系统中的Volocity），以每3秒1帧的速度连续采集图像4分钟。FM1-43的激发采用488 nm激光线，配合488 nm带通二向色镜，发射光通过527(W55)发射滤光片进行分辨。激光功率和相机灵敏度设定为获得100 msec的图像曝光时间。
7. 重复步骤3.2至3.6，以检测在无Ca²⁺条件下未经SLO损伤的对照siRNA处理细胞中的FM1-43（样本2），但在步骤3.5中应加入溶液B（表1）。
8. 为了测量在有（样本3）或无Ca²⁺（样本4）条件下经SLO损伤的对照siRNA处理细胞中FM1-43的内流情况，向35 mm玻璃底培养皿的中心玻璃盖玻片上加入含SLO的180 μl冰冷溶液B，并如步骤3.3所述在冰上孵育5分钟。重复步骤3.2至3.6；在步骤3.5中根据需要加入溶液A或溶液B（表1）。
9. 为确定ASM在细胞质膜修复中的作用，对ASM siRNA处理的细胞在所有条件下重复步骤3.2–3.6（样本5–8）（表1）。
10. 为研究外源性重组鞘磷脂酶（SM）对细胞质膜修复动力学（通过FM1-43内流的抑制反映）的影响（样本9–10），在步骤3.5中将SM（0–50 μU）加入溶液A或溶液B中，随后在活细胞成像过程中以总体积1 ml加入细胞（表1）。

4. 细胞中FM1-43内流的定量分析

1. 获取录像后，使用图像分析软件（Volocity Suite, PerkinElmer）测量细胞内 FM1-43 的荧光强度。在视野中每个细胞的胞质区域绘制感兴趣区域，并应用软件工具确定整个视频所有帧中 FM1-43 荧光强度的平均值。
2. 为校正初始 FM1-43 染色强度的差异，将每段视频的数据表示为随时间变化的荧光强度倍数增加，并针对不同实验条件分别作图。每个细胞在各个时间点的荧光强度倍数增加通过 F_T/F₀ 计算，其中 F_T 为特定时间点的平均荧光强度，F₀ 为 t = 0 时的平均荧光强度（图 1-2）。

结果

低浓度的细菌鞘磷脂酶（SM）可恢复溶酶体酸性鞘磷脂酶耗竭细胞的质膜修复功能。

我们先前利用FM1-43成像实验表明，在存在Ca²⁺的条件下，经SLO造成损伤后，溶酶体酶ASM缺陷的细胞表现出质膜修复缺陷，而该缺陷可通过在细胞外添加重组人源酶得到挽救¹⁹。由于人源溶酶体ASM的最适pH为酸性，我们进一步探究了是否可通过添加来自Bacillus cereus（Sigma）的鞘磷脂酶（SM），在中性pH下完全发挥活性，从而恢复膜的重封能力。如先前所示，在无Ca²⁺条件下（不支持修复的条件）经SLO处理后，对照siRNA或ASM siRNA寡核苷酸处理的细胞均表现出相似程度的通透化，表明ASM的缺失并不影响细胞对毒素的敏感性（图1A）。有趣的是，在ASM缺陷细胞中，添加低浓度的SM（5和7.5 μU/ml）即可完全恢复其在SLO处理后的膜重封能力（图1B）。随着培养基中酶浓度的增加，修复表型逐渐减弱——当SM浓度为10 μU/ml时，SLO处理后...

讨论

早期关于机械损伤和细胞质膜修复的研究依赖于多种细胞损伤方式，包括滴加玻璃珠、微量移液、剪切、划伤或刮擦。这些检测方法的结果均为定性而非定量，无法提供修复机制动力学的精确信息。细胞在经历上述损伤后重新封闭其质膜的能力，通常通过检测胞质中是否存在添加到细胞外液的示踪剂、膜不通透性染料的进入、胞质酶的流失、ATP水平变化或细胞的长期存活情况来评估。尽管其中一些检测方法可以实现定量分析，但这些研究中的一个主要障碍在于难以同步损伤事件，同时在单细胞水平上快速评估膜重新封闭的动力学过程。

采用紫外激光损伤肌纤维，随后检测亲脂性染料FM1-43的内流，这一方法的建立与应用是此类研究中的重大进展^17,20。与通过刮擦或其他机械方式对整个细胞群体造成广泛损伤的方法相比，这些检测手段引入了一种更为明确的细胞损伤方式，从而实现了单细胞水平的分析。然而，此类检测仍存在若干问题。激光诱导的损伤区域较大，且其大小随激光强度变化而显著波动，其性质也与生理条件下发生的膜损伤形式存在显著差异。另一个问题是，使用显微镜耦联的激光只能逐个对细胞或肌纤维进行损伤，限制了可追踪的膜修复事件数量，从而降...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
HeLa 229 细胞系	ATCC	CCL2-1
DMEM 高糖培养基	Invitrogen	11965
无钙 DMEM 高糖培养基	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
OptiMem 低血清培养基	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
对照 GC 含量 RNAi 寡核苷酸	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi 寡核苷酸	Invitrogen	HSS143988
胎牛血清（热灭活）	Gemini-Bioproducts	100-106
来自Bacillus cereus的鞘磷脂酶	Sigma	S7651
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-14
材料
倒置显微镜	Nikon	Eclipse Ti
相机	Hamamatsu Photonics	C9100-50
转盘共聚焦显微镜	PerkinElmer	UltraViewVoX
图像分析软件	PerkinElmer	Volocity Suite
环境培养箱	Pathology Devices	LiveCell System Chamber