活体成像实验用于评估Ca2+和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

摘要

对暴露于亲脂性染料FM1-43的细胞进行活体成像，可精确测定孔形成毒素从质膜上被清除的动力学过程。该方法是一种灵敏的检测手段，可用于评估Ca²⁺、鞘磷脂酶及其他因素在质膜修复过程中的作用需求。

摘要

质膜损伤是一种常见事件，必须迅速修复伤口以确保细胞存活。Ca²⁺内流是一个关键的信号事件，可在约30秒内触发质膜机械性损伤的修复。最近的研究表明，哺乳动物细胞在被成孔毒素穿孔后，也能以依赖Ca²⁺的方式重新封闭其质膜，该过程涉及溶酶体酶酸性鞘磷脂酶的胞吐作用，随后发生孔道的内吞作用。本文描述了用于证明由毒素链球溶血素O（streptolysin O）导致通透化的细胞其重封过程同样迅速且依赖于Ca²⁺内流的实验方法。该实验设计可实现损伤事件的同步化，并通过成像和定量亲脂性染料FM1-43到达细胞内膜的程度，精确测定细胞恢复质膜完整性的能力。这一活细胞检测方法还可灵敏地评估外源添加的可溶性因子（如鞘磷脂酶）抑制FM1-43内流的能力，从而反映细胞修复其质膜的能力。本实验使我们首次证明，鞘磷脂酶的作用位于Ca²⁺依赖性胞吐作用的下游，因为在外源无Ca²⁺的条件下，向胞外添加该酶仍可促进已通透化细胞的重封。

引言

几十年来人们已经知道，细胞质膜在机械损伤后的修复是一个依赖于Ca²⁺的过程^1,2。后续研究表明，伤口处的Ca²⁺内流会触发细胞内囊泡在损伤部位剧烈地发生胞吐，这一过程对膜的重新封闭至关重要^3,4。通过检测加载到细胞胞质中的荧光染料的流失速率，可评估修复速度，结果表明膜的重新封闭在损伤后<30秒内完成⁵。最初提出了两种模型来解释胞吐作用在质膜修复中的必要性：1）“补丁”模型，该模型认为损伤处的Ca²⁺内流首先触发细胞内囊泡的同型融合，形成一个大的“补丁”，随后被应用于质膜以封闭伤口⁶；2）张力降低模型，该模型提出，在伤口周围通过Ca²⁺依赖性胞吐作用增加的膜成分可降低质膜张力，从而促进双分子层的重新封闭⁷。Ca²⁺触发的胞吐在质膜修复中的作用进一步得到了研究的支持，这些研究表明溶酶体含有Ca²⁺感受分子——突触结合蛋白VII型（synaptotagmin VII），它可促进溶酶体的胞吐以及受损细胞的质膜修复^8,9,10,11。

然而，更多证据表明，仅靠胞吐作用不足以促进质膜修复。除了质膜的机械性撕裂外，另一种常见的细胞损伤形式是由细菌^12,13 或免疫细胞^14,15产生的孔道....

方案

1. ASM 的转录沉默

1. 在35 mm玻璃底培养皿（MatTek）中加入2 ml DMEM完全培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素），接种1.5 × 10⁵个HeLa细胞，于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。
2. 次日，吸除培养基，更换为2 ml DMEM低血清培养基（含4% FBS的DMEM），在转染siRNA复合物前至少孵育1小时。
3. 准备4个离心管用于siRNA寡核苷酸转染混合液。每转染一个35 mm培养皿，在A管和C管中各加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和4 μl Lipofectamine RNAiMax；在B管中加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和8 μl（160 pmol）对照用中等GC含量寡核苷酸（对照siRNA）；在D管中加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和8 μl（160 pmol）SMPD1寡核苷酸（siASM）。室温孵育5分钟。
4. 将A管与B管混合，形成对照siRNA的转染复合物；将C管与D管混合，形成ASM siRNA的转染复合物。室温孵育20分钟。
5. 将对照siRNA和ASM siRNA的转染反应混合物缓慢地逐滴加入相应的35 mm玻璃底培养皿中，于37 °C、5% CO₂条件下继续培养。转染后24小时，轻柔吸除培养基，更换为新鲜DME....

结果

低浓度的细菌鞘磷脂酶（SM）可恢复溶酶体酸性鞘磷脂酶耗竭细胞的质膜修复功能。

我们先前利用FM1-43成像实验表明，在存在Ca²⁺的条件下，经SLO造成损伤后，溶酶体酶ASM缺陷的细胞表现出质膜修复缺陷，而该缺陷可通过在细胞外添加重组人源酶得到挽救¹⁹。由于人源溶酶体ASM的最适pH为酸性，我们进一步探究了是否可通过添加来自Bacillus cereus（Sigma）的鞘磷脂酶（SM），在中性pH下完全发挥活性，从而恢复膜的重封能力。如先前所示，在无Ca²⁺条件下（不支持修复的条件）经SLO处理后，对照siRNA或ASM siRNA寡核苷酸处理的细胞均表现出相似程度的通透化，表明ASM的缺失并不影响细胞对毒素的敏感性（图1A）。有趣的是，在ASM缺陷细胞中，添加低浓度的SM（5和7.5 μU/ml）即可完全恢复其在SLO处理后的膜重封能力（图1B）。随着培养基中酶浓度的增加，修复表型逐渐减弱——当SM浓度为10 μU/ml时，SLO处理后.......

讨论

早期关于机械损伤和细胞质膜修复的研究依赖于多种细胞损伤方式，包括滴加玻璃珠、微量移液、剪切、划伤或刮擦。这些检测方法的结果均为定性而非定量，无法提供修复机制动力学的精确信息。细胞在经历上述损伤后重新封闭其质膜的能力，通常通过检测胞质中是否存在添加到细胞外液的示踪剂、膜不通透性染料的进入、胞质酶的流失、ATP水平变化或细胞的长期存活情况来评估。尽管其中一些检测方法可以实现定量分析，但这些研究中的一个主要障碍在于难以同步损伤事件，同时在单细胞水平上快速评估膜重新封闭的动力学过程。

采用紫外激光损伤肌纤维，随后检测亲脂性染料FM1-43的内流，这一方法的建立与应用是此类研究中的重大进展^17,20。与通过刮擦或其他机械方式对整个细胞群体造成广泛损伤的方法相比，这些检测手段引入了一种更为明确的细胞损伤方式，从而实现了单细胞水平的分析。然而，此类检测仍存在若干问题。激光诱导的损伤区域较大，且其大小随激光强度变化而显著波动，其性质也与生理条件下发生的膜损伤形式存在显著差异。另一个问题是，使用显微镜耦联的激光只能逐个对细胞或肌纤维进行损伤，限制了可追踪的膜修复事件数量，从而降.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
HeLa 229 细胞系	ATCC	CCL2-1
DMEM 高糖培养基	Invitrogen	11965
无钙 DMEM 高糖培养基	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
OptiMem 低血清培养基	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
对照 GC 含量 RNAi 寡核苷酸	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi 寡核苷酸	Invitrogen	HSS143988
胎牛血清（热灭活）	Gemini-Bioproducts	100-106
来自Bacillus cereus的鞘磷脂酶	Sigma	S7651
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-14
材料
倒置显微镜	Nikon	Eclipse Ti
相机	Hamamatsu Photonics	C9100-50
转盘共聚焦显微镜	PerkinElmer	UltraViewVoX
图像分析软件	PerkinElmer	Volocity Suite
环境培养箱	Pathology Devices	LiveCell System Chamber