在本视频中，我们将演示用于多孔金属植入物的改性技术，以提升其功能并控制细胞迁移。这些技术包括构建孔隙梯度以调控三维环境中的细胞运动，以及制备模拟基底膜的结构以调控二维环境中的细胞运动。此外，还介绍了一种基于高效液相色谱（HPLC）的方法，通过分析血液蛋白来监测植入物在体内的整合情况。
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本文内容
摘要
摘要
金属植入物，尤其是钛植入物，广泛应用于临床。植入物在组织中的长入与整合是决定临床效果成功与否的重要参数。为了改善组织整合，已开发出多孔金属植入物。金属泡沫的开孔结构极具优势，因其孔隙区域可在不损害整体结构机械性能的前提下进行功能化修饰。本文描述了基于钛微珠的多孔钛植入物的此类改性方法。利用钛固有的疏水性等物理特性，可在基于微珠的金属植入物内部构建疏水性孔隙梯度，同时基于亲水性天然聚合物构建类似基底膜的结构。三维孔隙梯度通过聚-L-乳酸（PLLA）等合成聚合物经冷冻萃取法制备而成。二维纳米纤维表面则通过胶原蛋白/海藻酸钠体系形成，并使用天然交联剂京尼平进行交联。该纳米纤维膜采用逐层（LbL）沉积法，由带相反电荷的两种分子——胶原蛋白与海藻酸钠交替沉积构建而成。最终可获得一种不同区域可容纳不同类型细胞的植入物，这对于许多多细胞组织的再生具有必要性。通过这种方式，可控制不同类型细胞在不同方向上的迁移行为。本文以气管再生为例描述了该系统，但其亦可针对其他靶器官进行调整。文中详细阐述了细胞迁移分析及构建不同孔隙梯度的可能方法。此类植入物分析的下一步是植入后的表征。然而，金属植入物的组织学分析过程漫长且繁琐，因此为监测宿主对金属植入物的反应 体内 一种基于监测绿原酸（CGA）和不同血液蛋白的替代方法也有所描述。这些方法可用于开发 体外 定制的迁移与定植实验，也可用于功能化金属植入物的分析 体内 无需组织学检查。
引言
目前可用的金属植入物适用于承重应用，但其不可降解性要求设计时必须确保与周围组织形成牢固的界面 1通过提供促进细胞长入和定植的结构 体内，金属植入物的使用寿命可以延长 2开放多孔金属植入物是组织界面工程及确保植入物良好定植的有前景材料。此类植入物已被广泛用于骨科植入物以及气管植入物。 3-5然而，仍存在一些需要解决的问题，例如对细胞在孔隙区域移动的精确控制。若无法有效控制这一过程，可能导致一端细胞定植不完全，而另一端发生再狭窄。此外，还需对这些植入物进行进一步的功能化修饰，以实现更高级的功能，如生长因子的递送、定向血管化以及不同类型细胞的同步迁移。 6-8对于气管植入物而言，这一点至关重要，因为希望植入物被血管化组织定植。然而，组织向气管腔内的不受控生长是不利的，因为它会降低植入物的通畅性。
控制细胞移动的一种方法是利用尺寸排阻效应。通过了解目标细胞的尺寸及其与特定合成聚合物相互作用的能力，可以构建出具有梯度孔径的材料，从而有效控制细胞迁移的深度。例如，设计一种孔径结构，使其足够大，允许成纤维细胞等结缔组织细胞从管外进入，但又足够小（小于10 μm），以阻止这些细胞向管腔内部迁移，从而实现对管状植入物定植过程的有效调控。
在现有的造孔方法中，例如冷冻干燥、粒子沥滤和气体发泡9,10，最易于适应且能....
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方案
1. 大孔金属植入物中微孔梯度的制备
- 用乙醇清洗植入物（例如由医用级钛珠制成的植入物，粒径范围为400-500 μm，Neyco SAS，法国），然后在丙酮中进行15分钟的超声处理。
- 根据植入物的尺寸和形状设计并制造聚四氟乙烯（Teflon）模具（标准实验使用直径1.5 cm、高2 cm的圆柱形模具）。模具应具有模块化结构，以便在提取过程中移除特定部分。此类模具设计可通过引导提取液定向流动，从而实现对提取过程的控制。
- 对于用于替代气管的管状植入物，其结构应由三部分组成：i）确定植入物尺寸的底部部分，ii）芯轴，以及iii）可拆卸的外层芯体。通过这种方式，可形成由外向内逐渐变化的孔径梯度。
- 制备合成聚合物（PLLA）溶液：用于冷冻/萃取的PLLA溶液需在二噁烷与水的二元混合液（87:13%，v:v）中配制。
- 将混合物加热至60 °C，以获得均一溶液。选择60 °C是因为这是必须用于将溶液注入植入物的精密玻璃注射器所能耐受的最高温度。
- 若使用高浓度（≥6%）、高分子量的PLLA溶液，应在加热后立即注入植入物中。否则溶液会在未完全浸润的情况下发生凝胶化。
- 根据植入物的孔隙率计算所需聚合物溶液的体积，为提高准确性，可考虑冷冻后溶液体积的变化。
- 使用精度为0.1 μl的精密玻璃注射器将溶液注入植入物中。为实现可重复的孔径梯度形成，聚合物浓度下限为3%，而当浓度超过6%时，在较厚样....
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结果
孔隙梯度的形成
通过改变PLLA溶液的浓度，可以调控植入物外腔侧孔隙的尺寸。孔隙的大小和形状受到钛植入物存在的显著影响（图1a 和 图1b）。孔径范围为40–100 μm，使用较低浓度的溶液会形成更小的孔隙。而在内腔侧，孔径受限于溶剂的有限萃取，约为9 μm 23，小于成纤维细胞的平均尺寸。通过在室温下增加一个孵育步骤，可获得双层多孔结构，即较大孔隙的孔壁本身也具有微孔性。这一特性对于较厚的植入物尤为重要，因为它有助于气体和营养物质的传输（图1c）。
纳米原纤维基底膜模拟物的形成
在形成孔隙梯度后，可将胶原/海藻酸盐薄膜层添加到结构的顶部（图2）。该薄膜层在聚-L-乳酸（PLLA）泡沫上方具有良好的稳定性，即使在无泡沫的情况下也能维持在表面（图3a 和 图3b）.......
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讨论
孔隙梯度是界面组织工程中的重要工具，此处描述的系统可单独使用，也可与金属植入物结合使用，以形成孔隙梯度用于研究细胞迁移。该系统除需使用化学通风橱处理有机溶剂外，无需额外设置或额外设备，因此可在生物学实验室中应用。类似聚合物如聚乙醇酸（Poly(glycolic acid), PGA）、聚乳酸-乙醇酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA）和聚己内酯（Poly(caprolactone), PCL）也可通过轻微调整后使用。其他在有机溶剂中不溶解的大孔结构也可被采用。若需在一侧表面获得更小的孔径（纳米尺度），还可额外形成一层薄的纳米多孔膜。该膜可通过先将聚合物的稀溶液（1%）溶于高挥发性溶剂（如氯仿）并滴加至结构顶部，随后立即浸入纯乙醇溶液中引发相分离而实现。由此可构建仅基于一种材料的共培养系统。
聚四氟乙烯模具的设计对于控制孔径至关重要，因为萃取液的流动由该设计决定。萃取液的流动以及萃取液与溶剂之间的交换速率会影响孔隙的形成。通过在植入物中施加萃取液的层流，可进一步提高控制精度。萃取液体积是一个重要参数，应根据所用聚合物的量以及植入物的尺寸进.......
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披露
NE Vrana 是 Protip SAS 公司的员工。
致谢
作者感谢Andre Walder博士和Nicolas Perrin制造了钛植入物，K. Benmlih协助搭建聚四氟乙烯模具，以及G. Prevost博士在动物实验中提供的帮助。我们还感谢阿尔萨斯地区和阿尔萨斯材料与纳米科学中心（PMNA）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 二恶烷 | Sigma-Aldrich | 360481 | 有毒物质，须在通风橱内严格操作 |
| 聚-L-乳酸（PLLA） i. 聚-L-乳酸特性粘度 ~0.5 dl/g ii. 聚-L-丙交酯 特性黏度 ~2.0 dl/g | Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | 分子量和特性粘度的选择取决于具体应用。 |
| PRONOVA UP LVG（海藻酸钠） | 诺瓦矩阵 | 4200006 | 低黏度（20–200 mPa·s） |
| I型胶原蛋白（牛源） | Symatese | CBPE2US100 | |
| 青霉素/链霉素，两性霉素B | Promocell | C42020 | |
| 京尼平 | Wako | 0703021 | |
| 硅氮化物探针，其弹簧常数为 0.03 N/m-1. | Bruker | MSCT | |
| 高效液相色谱用三氟乙酸，≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | 危险材料，请严格遵循材料安全数据表（MSDS） |
| 乙腈，用于高效液相色谱≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（通用型细胞膜标记） | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| 兔C反应蛋白（CRP）ELISA试剂盒 | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO，生物试剂 ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 设备 | |||
| Multimode Nanoscope IV 原子力显微镜 | Bruker | ||
| Procise 微量测序仪 | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC 系统 | Dionex | ||
| 日立扫描电子显微镜 TM 100 | 日立 | ||
| 共聚焦扫描激光显微镜 Zeiss LSM 510 | 蔡司 | ||
| 表1. 材料与试剂列表 |
参考文献
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautie....
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重印与许可
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