在本视频中，我们将演示用于多孔金属植入物的改性技术，以提升其功能并控制细胞迁移。这些技术包括构建孔隙梯度以调控三维环境中的细胞运动，以及制备模拟基底膜的结构以调控二维环境中的细胞运动。此外，还介绍了一种基于高效液相色谱（HPLC）的方法，通过分析血液蛋白来监测植入物在体内的整合情况。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
金属植入物，尤其是钛植入物，广泛应用于临床。植入物在组织中的长入与整合是决定临床效果成功与否的重要参数。为了改善组织整合，已开发出多孔金属植入物。金属泡沫的开孔结构极具优势，因其孔隙区域可在不损害整体结构机械性能的前提下进行功能化修饰。本文描述了基于钛微珠的多孔钛植入物的此类改性方法。利用钛固有的疏水性等物理特性，可在基于微珠的金属植入物内部构建疏水性孔隙梯度，同时基于亲水性天然聚合物构建类似基底膜的结构。三维孔隙梯度通过聚-L-乳酸（PLLA）等合成聚合物经冷冻萃取法制备而成。二维纳米纤维表面则通过胶原蛋白/海藻酸钠体系形成，并使用天然交联剂京尼平进行交联。该纳米纤维膜采用逐层（LbL）沉积法，由带相反电荷的两种分子——胶原蛋白与海藻酸钠交替沉积构建而成。最终可获得一种不同区域可容纳不同类型细胞的植入物，这对于许多多细胞组织的再生具有必要性。通过这种方式，可控制不同类型细胞在不同方向上的迁移行为。本文以气管再生为例描述了该系统，但其亦可针对其他靶器官进行调整。文中详细阐述了细胞迁移分析及构建不同孔隙梯度的可能方法。此类植入物分析的下一步是植入后的表征。然而，金属植入物的组织学分析过程漫长且繁琐，因此为监测宿主对金属植入物的反应 体内 一种基于监测绿原酸（CGA）和不同血液蛋白的替代方法也有所描述。这些方法可用于开发 体外 定制的迁移与定植实验，也可用于功能化金属植入物的分析 体内 无需组织学检查。
引言
目前可用的金属植入物适用于承重应用，但其不可降解性要求设计时必须确保与周围组织形成牢固的界面 1通过提供促进细胞长入和定植的结构 体内，金属植入物的使用寿命可以延长 2开放多孔金属植入物是组织界面工程及确保植入物良好定植的有前景材料。此类植入物已被广泛用于骨科植入物以及气管植入物。 3-5然而，仍存在一些需要解决的问题，例如对细胞在孔隙区域移动的精确控制。若无法有效控制这一过程，可能导致一端细胞定植不完全，而另一端发生再狭窄。此外，还需对这些植入物进行进一步的功能化修饰，以实现更高级的功能，如生长因子的递送、定向血管化以及不同类型细胞的同步迁移。 6-8对于气管植入物而言，这一点至关重要，因为希望植入物被血管化组织定植。然而，组织向气管腔内的不受控生长是不利的，因为它会降低植入物的通畅性。
控制细胞移动的一种方法是利用尺寸排阻效应。通过了解目标细胞的尺寸及其与特定合成聚合物相互作用的能力，可以构建出具有梯度孔径的材料，从而有效控制细胞迁移的深度。例如，设计一种孔径结构，使其足够大，允许成纤维细胞等结缔组织细胞从管外进入，但又足够小（小于10 μm），以阻止这些细胞向管腔内部迁移，从而实现对管状植入物定植过程的有效调控。
在现有的造孔方法中，例如冷冻干燥、粒子沥滤和气体发泡9,10，最易于适应且能以最少设备快速形成孔隙梯度的方法是冷冻萃取法11。该方法将聚合物溶液在有机溶剂与水的二元混合体系中冷冻，随后通过与乙醇等可混溶的预冷液体进行萃取，实现溶剂交换。冷冻和萃取条件决定了孔隙的形态和尺寸；若以可控的方式进行萃取液的流动，则可实现孔隙大小和形状的定向调控。
多细胞组织的第二步是形成不同类型细胞之间的多孔屏障，以调控它们之间的相互作用。根据各类细胞的不同需求，这一结构对于建立不同的微环境也十分必要12,13。气管是一种连接喉部与支气管的管状器官，其内壁由假复层纤毛上皮构成，并散布有分泌黏液的杯状细胞。气管的三维结构和稳定性由呈C形的软骨环支撑。因此，在人工气管中，结缔组织与纤毛上皮层之间应具有明确的连接界面。结缔组织部分需要具备三维结构，而上皮细胞的迁移则需要类似基底膜的表面，以实现定向移动和创面闭合。聚电解质多层膜（PEMs）是获得基底膜模拟结构的一种可行选择。逐层自组装法（LbL）是一种获得薄而功能性表面涂层的通用技术，其原理基于两种带相反电荷的聚电解质通过静电相互作用依次沉积，形成纳米级表面涂层，且可通过简单调节聚电解质种类、pH值、层数、封端层的添加、交联等变量来调控涂层性能。LbL方法的主要优势之一是能够顺应底层基材的表面形貌。因此，在受控条件下，该方法也可用于对多孔结构实现表面覆盖。若将胶原蛋白作为其中一种聚电解质，则可形成纳米纤维结构，从而模拟基底膜表面。钛的疏水性有利于此类结构的形成，并可在较厚涂层中保持纤维结构14。通过这种方式，也可调控细胞在表面的黏附与移动行为。结合冷冻萃取与LbL薄膜涂覆的顺序操作，可构建一种能够在横向、纵向及周向上均实现细胞运动控制的结构15。
本文介绍了两种利用钛植入物疏水特性的新型改性方法，这些方法可扩展应用于多种多孔植入物的改性：i) 在大孔钛植入物内部形成微孔梯度结构，并使用疏水性合成聚合物进行修饰；ii) 在植入物表面形成一层较厚的聚合物薄膜，通过聚电解质多层膜支持细胞生长和内衬层的形成。这两种方法可依次使用，也可单独使用。它们可提供特定结构，以确保多细胞组织中不同类型细胞的受控迁移和空间有序排列16,17。以气管修复为例，理想的植入物效果是在微孔梯度区域内由纤维血管组织实现充分定植，且不发生再狭窄，同时在聚电解质多层膜表面形成由纤毛柱状上皮细胞构成的内衬层。
控制植入物与宿主整合的一种方法是在植入物与宿主整合期间进行微小的外科干预 原位为了能够确定干预措施的时机，了解植入物的全身性影响至关重要。C反应蛋白（CRP）已用于临床环境中感染和炎症反应的监测。嗜铬粒蛋白A（CGA）也可用于类似目的，并可能提供更为准确的炎症水平评估结果。 18. 作为一种观察金属植入物整合的可能方法 体内我们提出一种通过高效液相色谱法（HPLC）分析动物血液样本并结合后续蛋白质测序，以持续监测植入物全身效应的方法。该方法的完善有望避免常规的终点组织学分析。金属植入物的组织切片是一项耗时、繁琐且昂贵的操作，且仅能在特定时间点进行。因此，根据欧盟近期关于动物实验的规定，设计合理的血液检测方法以提供有关植入物状态的可靠信息，将成为减少动物实验的可行途径。
本文介绍的方法可用于通过功能化改性提升金属植入物的性能，或为监测现有植入物提供一种替代方案。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 大孔金属植入物中微孔梯度的制备
- 用乙醇清洗植入物（例如由医用级钛珠制成的植入物，粒径范围为400-500 μm，Neyco SAS，法国），然后在丙酮中进行15分钟的超声处理。
- 根据植入物的尺寸和形状设计并制造聚四氟乙烯（Teflon）模具（标准实验使用直径1.5 cm、高2 cm的圆柱形模具）。模具应具有模块化结构，以便在提取过程中移除特定部分。此类模具设计可通过引导提取液定向流动，从而实现对提取过程的控制。
- 对于用于替代气管的管状植入物，其结构应由三部分组成：i）确定植入物尺寸的底部部分，ii）芯轴，以及iii）可拆卸的外层芯体。通过这种方式，可形成由外向内逐渐变化的孔径梯度。
- 制备合成聚合物（PLLA）溶液：用于冷冻/萃取的PLLA溶液需在二噁烷与水的二元混合液（87:13%，v:v）中配制。
- 将混合物加热至60 °C，以获得均一溶液。选择60 °C是因为这是必须用于将溶液注入植入物的精密玻璃注射器所能耐受的最高温度。
- 若使用高浓度（≥6%）、高分子量的PLLA溶液，应在加热后立即注入植入物中。否则溶液会在未完全浸润的情况下发生凝胶化。
- 根据植入物的孔隙率计算所需聚合物溶液的体积，为提高准确性，可考虑冷冻后溶液体积的变化。
- 使用精度为0.1 μl的精密玻璃注射器将溶液注入植入物中。为实现可重复的孔径梯度形成，聚合物浓度下限为3%，而当浓度超过6%时，在较厚样品中难以获得均匀分布。然而，针对特定应用也可使用其他浓度。
- 将样品直接置于-80 °C下冷冻，或先在室温下孵育30分钟后再冷冻。冷冻条件部分决定了孔结构的形成，因此可根据目标孔隙率调整冷冻条件。将样品在-80 °C下保存过夜。
- 萃取：将植入物浸入预冷的80%乙醇（EtOH）中，在-20 °C下过夜进行萃取。为获得孔隙梯度，对于管状植入物，仅保留芯轴；对于盘状植入物，仅保留底部部分，其余模具部件均需移除。使用预冷的手术刀可更易于分离模具。
- 在-20 °C下萃取过夜后19，移除剩余的模具部件，并将植入物自然晾干。为表征结构的整体孔隙率，需进行汞孔隙率分析。汞孔隙率测定结果显示了对应于植入物两侧及分散小孔的明显峰。然而更为关键的数据是管腔内表面与管腔外表面孔隙率之间的差异，该差异可通过Image J结合扫描电子显微镜（SEM）分析孔径分布20。为验证孔隙梯度，可对样品进行冷冻断裂处理，并用SEM观察其横截面。
- 由于所用植入物具有开放多孔结构，且钛具有较强的光反射能力，因此可在多孔植入物内部对标记细胞进行z轴层扫成像。使用PKH26或Calcein-AM标记细胞，并通过共聚焦激光显微镜观察植入物。
2. 胶原蛋白/海藻酸盐多层膜在多孔金属植入物表面的涂层
- 为构建多层结构，使用浸渍机器人可获得最高的重复性。然而，若无浸渍机器人，这些步骤也可手动完成。
- 使用医用级I型胶原蛋白和海藻酸钠。优化的浓度为每种成分在pH 3.8的柠檬酸盐缓冲液（含150 mM NaCl）中均为0.5 g/L。
- 将胶原溶液溶解过夜，以确保溶液的均一性。pH 3.8的酸性环境对于稳定多层结构的构建至关重要，因为在中性pH条件下交联前，该结构在中性环境中不稳定。
- 通过浸渍机器人系统将植入物交替浸入胶原和海藻酸钠溶液中以沉积各层。每层沉积时间为15分钟。每次沉积步骤之间，用pH 3.8的150 mM NaCl溶液冲洗5分钟。
- 设计专用夹具，以便在用于聚电解质多层膜制备的浸渍机器人上使用植入物。将多层结构沉积在仅含钛的植入物表面，或沉积在如第1节所述经过修饰的植入物表面。
- 使用京尼平稳定基底膜模拟物：将交联溶液按1:4体积比配制为二甲基亚砜（DMSO）与柠檬酸盐缓冲液（150 mM NaCl，pH 3.8）的混合液。可使用较宽范围的浓度，其中100 mM浓度足以实现交联。先将京尼平溶于DMSO组分中，随后再加入水相组分，以避免结块。
- 将样品浸入交联溶液中12–24小时进行交联。之后用大量pH 3.8的柠檬酸盐缓冲液冲洗。
- 洗涤步骤完成后，可通过紫外照射（30分钟）或抗生素/抗真菌溶液处理（青霉素/链霉素，Fungizone）对样品进行灭菌。
- 决定基底膜模拟物质量的主要参数为其厚度和纤维直径。使用接触模式下获得的原子力显微镜（AFM）图像计算纤维直径。成像前用氮气流干燥样品。每幅图像中至少量化10根纤维，利用Image J软件确定平均原纤维厚度。
- 薄膜厚度可通过AFM进行划痕测试测定。干燥(COL/ALG)24/COL多层膜，用注射器针头在膜表面划痕。在光学显微镜下定位划痕后，在划痕边缘处获取10 × 10 μm2区域的AFM图像。利用AFM软件获得的剖面图计算高度，从而得到薄膜层的厚度。
3. 通过血液血浆分析对植入物整合进行体内间接监测
- 应根据各国管理动物实验的相关规定，取得所有必要的伦理委员会批准21。在本研究中，遵循《实验动物护理与使用指南》（国家研究委员会，2010年），并已获得斯特拉斯堡大学伦理委员会的批准。
- 在目标部位进行植入操作。此处提供的血液监测方案用于新西兰白兔15 mm气管切除后的气管替代手术。
- 植入后需进行每日随访，包括监测动物的一般健康状况（手术部位愈合情况、呼吸频率）并记录其体重变化。
- 为验证血液检测结果，应采用成熟的方法，例如使用ELISA法检测血液中C反应蛋白（CRP）水平。多种动物的CRP检测试剂盒均可获得，本研究中用于兔子的特异性试剂盒列于表1。同样，采用蛋白质印迹法（Western blotting）测定嗜铬粒蛋白A（CGA）水平。本方案中使用了抗CGA的单克隆抗体（抗-CGA47-68）。
- 进行血浆表征时，从兔耳缘静脉采集血液样本。在4 °C条件下以5,000 rpm离心20分钟，取上清液用于分析。在本实验流程中，上述检测每周进行一次，但也可根据需要更频繁地开展。
- 血浆蛋白成分的反相高效液相色谱（HPLC）纯化：用含0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液按1:1（v:v）比例提取兔血浆。使用Dionex HPLC系统（Ultimate 3000；美国加利福尼亚州森尼韦尔）和Nucleosil反相C18柱（300-5C18，4 × 250 mm，粒径5 μm，孔径300 Å）对提取物进行纯化。
- 记录214 nm和280 nm处的吸光度。所用溶剂系统为：i）溶剂A：含0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）的水溶液；ii）溶剂B：含0.09%（v/v）TFA的70%（v/v）乙腈-水溶液。
- 设置流速为700 μl/min，并采用梯度洗脱。收集各峰对应的组分。通过真空离心浓缩法（speed-vacuum）浓缩各组分。注意应在样品完全干燥前停止真空浓缩过程。
- 比对植入期间不同时间点获得的色谱峰。选择在植入过程中呈现一致变化趋势的纯化肽段，用于后续的自动Edman测序鉴定。
- 肽段的自动Edman测序：使用Procise蛋白质测序仪通过自动Edman降解法测定纯化肽段的N端氨基酸序列。将样品加载至聚溴化苯乙烯处理的玻璃纤维滤膜上。下一步是通过C18色谱柱（PTH C-18，2.1 × 200 mm）进行苯基硫代乙内酰脲-氨基酸（Pth-Xaa）的色谱鉴定22。获得序列后，可利用Blast软件结合SWISS-Prot数据库进行比对鉴定。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
孔隙梯度的形成
通过改变PLLA溶液的浓度，可以调控植入物外腔侧孔隙的尺寸。孔隙的大小和形状受到钛植入物存在的显著影响（图1a 和 图1b）。孔径范围为40–100 μm，使用较低浓度的溶液会形成更小的孔隙。而在内腔侧，孔径受限于溶剂的有限萃取，约为9 μm 23，小于成纤维细胞的平均尺寸。通过在室温下增加一个孵育步骤，可获得双层多孔结构，即较大孔隙的孔壁本身也具有微孔性。这一特性对于较厚的植入物尤为重要，因为它有助于气体和营养物质的传输（图1c）。
纳米原纤维基底膜模拟物的形成
在形成孔隙梯度后，可将胶原/海藻酸盐薄膜层添加到结构的顶部（图2）。该薄膜层在聚-L-乳酸（PLLA）泡沫上方具有良好的稳定性，即使在无泡沫的情况下也能维持在表面（图3a 和 图3b）...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
孔隙梯度是界面组织工程中的重要工具，此处描述的系统可单独使用，也可与金属植入物结合使用，以形成孔隙梯度用于研究细胞迁移。该系统除需使用化学通风橱处理有机溶剂外，无需额外设置或额外设备，因此可在生物学实验室中应用。类似聚合物如聚乙醇酸（Poly(glycolic acid), PGA）、聚乳酸-乙醇酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA）和聚己内酯（Poly(caprolactone), PCL）也可通过轻微调整后使用。其他在有机溶剂中不溶解的大孔结构也可被采用。若需在一侧表面获得更小的孔径（纳米尺度），还可额外形成一层薄的纳米多孔膜。该膜可通过先将聚合物的稀溶液（1%）溶于高挥发性溶剂（如氯仿）并滴加至结构顶部，随后立即浸入纯乙醇溶液中引发相分离而实现。由此可构建仅基于一种材料的共培养系统。
聚四氟乙烯模具的设计对于控制孔径至关重要，因为萃取液的流动由该设计决定。萃取液的流动以及萃取液与溶剂之间的交换速率会影响孔隙的形成。通过在植入物中施加萃取液的层流，可进一步提高控制精度。萃取液体积是一个重要参数，应根据所用聚合物的量以及植入物的尺寸进...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
NE Vrana 是 Protip SAS 公司的员工。
致谢
作者感谢Andre Walder博士和Nicolas Perrin制造了钛植入物，K. Benmlih协助搭建聚四氟乙烯模具，以及G. Prevost博士在动物实验中提供的帮助。我们还感谢阿尔萨斯地区和阿尔萨斯材料与纳米科学中心（PMNA）提供的经费支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 二恶烷 | Sigma-Aldrich | 360481 | 有毒物质，须在通风橱内严格操作 |
| 聚-L-乳酸（PLLA） i. 聚-L-乳酸特性粘度 ~0.5 dl/g ii. 聚-L-丙交酯 特性黏度 ~2.0 dl/g | Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | 分子量和特性粘度的选择取决于具体应用。 |
| PRONOVA UP LVG（海藻酸钠） | 诺瓦矩阵 | 4200006 | 低黏度（20–200 mPa·s） |
| I型胶原蛋白（牛源） | Symatese | CBPE2US100 | |
| 青霉素/链霉素，两性霉素B | Promocell | C42020 | |
| 京尼平 | Wako | 0703021 | |
| 硅氮化物探针，其弹簧常数为 0.03 N/m-1. | Bruker | MSCT | |
| 高效液相色谱用三氟乙酸，≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | 危险材料，请严格遵循材料安全数据表（MSDS） |
| 乙腈，用于高效液相色谱≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（通用型细胞膜标记） | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| 兔C反应蛋白（CRP）ELISA试剂盒 | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO，生物试剂 ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 设备 | |||
| Multimode Nanoscope IV 原子力显微镜 | Bruker | ||
| Procise 微量测序仪 | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC 系统 | Dionex | ||
| 日立扫描电子显微镜 TM 100 | 日立 | ||
| 共聚焦扫描激光显微镜 Zeiss LSM 510 | 蔡司 | ||
| 表1. 材料与试剂列表 |
参考文献
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480(2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186(2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032(2012).
- Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
