一种利用固有多功能纳米囊泡——卟啉体实现一分钟内、亚瓦功率光热消融肿瘤的方法

摘要

我们开发了一种新型的内在多功能纳米囊泡，称为porphysosome。该囊泡具有结构依赖性的荧光自猝灭特性和独特的光热特性，因而可作为高效的光热治疗试剂。我们采用高压挤出法制备了porphysosome，并在异种移植肿瘤模型中评估了其光热治疗效果。

摘要

我们近期开发了卟啉体作为本质上的多功能纳米囊泡。将光敏剂焦脱镁叶绿酸α与磷脂共轭后，自组装形成类似脂质体的球形囊泡。由于卟啉-脂质双分子层中卟啉分子密度极高，卟啉体表现出巨大的消光系数、结构依赖性的荧光自猝灭特性以及优异的光热效应。在我们的制备方法中，采用高压挤出法合成卟啉体，其平均粒径约为120 nm。静脉注射卟啉体24小时后，对肿瘤部位以750 mW（1.18 W/cm²）、671 nm激光照射1分钟，局部温度迅速从30 °C升高至62 °C。肿瘤完全热消融后，焦痂形成并在2周内愈合；而在对照组中，肿瘤持续生长，均在3周内达到预设的实验终点。这些数据表明，卟啉体可作为高效的光热治疗（PTT）试剂。

引言

卟啉体是我们近期研发的一种新型多功能纳米囊泡，具有多模态成像与治疗能力¹由自组装的卟啉双分子层形成，含有极高密度的卟啉（每个卟啉体颗粒超过83,000个），因而具有大的消光系数，并产生依赖于结构的独特的荧光自猝灭效应。卟啉体具有良好的 体内 药代动力学与生物分布特性：系统给药后，其血液半衰期为12小时，并在注射后24小时以7.5% ID/g的水平被动富集于异种移植肿瘤中².

其独特的结构和理化特性使卟啉体成为多模态成像和影像引导治疗的良好候选材料。首先，由于含有卟啉，卟啉体在蓄积于肿瘤部位后，天然适用于肿瘤的荧光成像¹此外，每种卟啉都具有一个稳定的螯合放射性同位素位点，因此卟啉体可轻松标记放射性同位素（如用于PET成像的64Cu）³此外，当卟啉体结构完整时，在激光照射下吸收的光能会以热能形式耗散，因此卟啉体还表现出独特的光声成像和光热治疗能力。研究表明，静脉注射卟啉体24小时后，对富集了卟啉体的肿瘤进行激光照射，可迅速升温并实现强烈的光热消融。这证明了卟啉体是高效的光热增强剂，其消光系数与金纳米颗粒（AuNPs）相当。¹另一方面，与其他无机光热剂（如金纳米颗粒）相比，由于具有有机特性，卟啉体在生物安全性方面表现出显著优势。卟啉体可被酶降解，在小鼠中即使静脉注射剂量高达1,000 mg/kg也仅引起极低的急性毒性。¹此外，与脂质体类似，卟啉体的大水核可被动或主动载入治疗剂或成像剂。卟啉体的光学特性及生物相容性表明，有机纳米颗粒在生物光子成像与治疗中具有多模态应用潜力。

本文介绍了焦脱镁叶绿酸-脂质共轭物的合成方法，以及利用高压挤出法制备和表征卟啉体的方法。体内光热治疗实验在小鼠上进行，以验证在皮下移植瘤模型中，基于卟啉体的光热治疗在肿瘤治疗中的有效性。

方案

1. 原卟啉-脂质的合成

1. 将200 mmol焦脱镁叶绿酸（由Spirulina Pacifica藻类制备，制备方法见前文；Zheng et al., Bioconj. Chem., 2002, 13-392）⁴、98.7 mg 16:0 溶血磷脂酰胆碱（1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，Avanti Polar Lipids #855675）、76.3 mg EDC 和 48.7 mg DMAP（4-(二甲氨基)吡啶）溶于5 ml 戊烯稳定氯仿中，使Pyro:脂质:EDC:DMAP的摩尔比为1:1:2:2。
2. 在氩气保护下室温搅拌反应混合物24小时。使用旋转蒸发仪在减压条件下加热至40 °C，蒸发除去氯仿。得到焦脱镁叶绿酸-脂质异构体混合物（焦脱镁叶绿酸连接于sn-1或sn-2位）。
3. 将焦脱镁叶绿酸-脂质异构体混合物重新悬浮于含1 mM CaCl₂、50 mM Tris（pH 8）、0.5% Triton X-100和10%甲醇的溶液中，浓度为5 mg/ml。加入来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2（PLA2），终浓度为0.1 mg/ml，于37 °C孵育24小时，以消化sn-1位的焦脱镁叶绿酸-脂质，获得纯化的sn-2位焦脱镁叶绿酸-脂质异构体。
4. 加入2倍体积的氯仿和1.25倍体积的甲醇，进行萃取，然后在40 °C下通过减压旋转蒸发除去溶剂。将裂解产物重新溶解于含1%甲醇的二氯甲烷中，并通过小型二醇硅胶柱纯化，获得异构体纯的焦脱镁叶绿酸-脂质。

2. 原卟啉体的制备

1. 分别将焦脱镁叶绿酸-脂质、二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-甲氧基（聚乙二醇）（PEG-2000-PE）和胆固醇溶于氯仿中，并分别记录其浓度。
2. 在一支12×75 mm的硼硅酸盐试管中制备总脂质质量为5 mg/管的卟啉体脂质膜，其中包含65 mol% 卟啉-脂质、5 mol% PEG-2000-PE 和30 mol% 胆固醇。
3. 在氮气流下干燥脂质膜，并在真空条件下继续干燥1小时。将脂质膜在氩气环境中于-20 °C保存，直至后续进行水合与挤出操作。
4. 向每支含有脂质膜的试管中加入1 ml磷酸盐缓冲液（PBS，150 mM NaCl，10 mM磷酸盐，pH 7.4）。将试管浸入液氮中冷冻至完全凝固，然后在65 °C水浴中解冻至样品完全融化。涡旋振荡试管共30秒（每次10秒，共3次，每次间隔期间在65 °C水浴中重新加热5秒）。
5. 根据需要重复冻融循环至少5次，直至水合溶液中无明显大颗粒聚集体存在。完成后将卟啉体悬液置于冰上保存。
6. 组装高压挤出器（10 ml），安装两片堆叠的100 nm聚碳酸酯滤膜。将热控挤出器连接至恒温循环器，以维持65 °C循环水浴，并将挤出系统连接至氮气罐以提供高压。
7. 使用9英寸玻璃转移移液管将卟啉体悬液转移至挤出器腔室。通过调节氮气罐减压阀旋钮设定压力，使初始挤出压力读数在200至300 psig之间。逐渐打开压力调节阀，直至达到足够的卟啉体流速或压力最高达到800 psig（5,440 kPa）。
8. 完成第一次挤出后，关闭压力控制阀，并通过打开挤出器顶部的泄压阀释放系统压力。用新挤出的卟啉体溶液重新填充挤出器腔室，并至少重复挤出10次，以确保最终挤出液均匀一致。
9. 通过紫外-可见分光光度计测定甲醇稀释样品的吸光度，确定最终卟啉体溶液的浓度。使用以下公式计算浓度，其中焦脱镁叶绿酸-脂质在410 nm处的摩尔消光系数为97,000 M^-1cm^-1。

10. 使用马尔文Zetasizer ZS90通过动态光散射测定porphysome的最终粒径分布。将porphysome溶液用PBS稀释后，进行三次测量，每次测量包含15次运行，取平均结果。
11. 通过荧光分光光度计比较淬灭状态下的porphysome（1 mM PBS溶液）与未淬灭状态下的porphysome（1 mM含1% Triton X-100溶液）的荧光发射，以确定其荧光淬灭程度。分别在加入去垢剂（Triton X-100）前后采集荧光光谱，并将信号读数归一化至最大荧光强度。设定激发波长为410 nm，发射波长范围为600–800 nm。
12. 将porphysome溶液在4 °C下以氩气保护保存，并用铝箔包裹避光，以备后续使用。

3. 动物异种移植模型的制备

1. 在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养KB细胞，并将细胞置于37 °C、5% CO₂及湿润的环境中维持培养。
2. 采用标准细胞培养技术收集KB细胞。将细胞悬液（20,000个细胞/ml）置于冰上，用磷酸盐缓冲液（PBS）短期保存，直至注射前使用。
3. 在裸鼠上建立KB异种移植瘤模型。裸鼠购自Charles River Laboratories，体重20 g（货号# Crl:NU(NCr)-Foxn1^nu，6-7周龄），给予标准饮食和垫料（Harlan Laboratories；饲料：辐照LM-485，#7912；垫料：玉米芯垫料，¼”，#7097）。实验前对所有动物操作工具（注射器、镊子和动物垫）进行灭菌处理。使用2%（v/v）异氟烷以100%氧气为载气进行麻醉。所有动物实验方案均经本单位（本例为University Health Network）动物护理与使用委员会批准。
4. 将悬浮于PBS中的肿瘤细胞悬液皮下注射至小鼠右侧 flank 区域。接种10天后，当肿瘤直径达到4–5 mm、厚度达到2–3 mm时，小鼠即可用于实验。

4. 在体 光热治疗

1. 通过尾静脉静脉注射含750 nmol吡咯的porphysomes（体积为200 µl）。在注射porphysomes后24小时进行激光照射。
2. 本节所有操作均应在封闭的激光安全室内进行。激光照射期间需佩戴激光防护眼镜。
3. 设置激光照射设备。将激光光纤和散射器用夹子固定在支架上。将激光功率调至低水平并开启激光器。调节激光光纤高度，使照射区域直径达到9 mm（DPSS激光器，LaserGlow Technologies，多伦多，加拿大），使用功率计校准激光功率至750 mW（1.18 W/cm²），然后关闭激光器以准备动物实验。
4. 通过鼻罩给予2%（v/v）异氟烷与100%氧气混合气体麻醉动物（无废气收集系统，异氟烷可能对人类健康构成危害）。用镊子或手指轻夹动物后肢脚趾，确认动物已达到足够深度的麻醉状态。当动物对此刺激无反应时，即可进行激光照射。
5. 使用红外热成像相机（Mikroshot，LUMASENSE Technologies）监测肿瘤温度。将相机靠近肿瘤部位，调焦清晰，并在光热治疗（PTT）开始前采集一张预处理PTT图像及一张常规白光图像。
6. 再次开启激光器，将光功率增加至750 mW。将肿瘤置于激光束中心位置，确保肿瘤完全被覆盖，开始计时照射。在持续1分钟的激光治疗过程中，每5秒采集一次肿瘤温度图像。1分钟后关闭激光器。停止2%异氟烷气体供应，等待动物从麻醉中恢复后放回笼中。
7. 根据大学健康网络批准的动物实验方案，将小鼠饲养在恒温动物房中，维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。激光照射后一周内，皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg，每日两次），以减轻瘢痕引起的疼痛。每两天使用游标卡尺测量肿瘤直径并拍摄照片。采用以下公式计算肿瘤体积：V=π/6 · a · b²，其中a为长径，b为短径。
8. 当肿瘤长径达到10 mm时（此为本实验室规定的实验终点），将动物放入CO₂安乐死舱内实施安乐死。随后进行颈椎脱位处理。绘制生存曲线。

结果

焦脱镁叶绿酸与磷脂共价结合形成稳定的脂质单体（图1a），并通过高压挤出法经膜挤出工艺使这些偶联物自组装形成卟啉体。在挤出的前3个循环中，通常难以挤出卟啉体-脂质悬浮液，流速相对较慢。随着挤出次数增加，挤出溶液的流速逐渐提高，必要时可略微降低压力。粒径、浓度和淬灭效率是挤出后表征纳米颗粒的三个重要性质。所制备的卟啉体具有高度均一的粒径分布（主峰约120 nm）（图1b和1c），具有两个主要吸收峰（410 nm和677 nm，图1d），在4 °C保存时可保持稳定超过12个月。当纳米结构完整时，卟啉的荧光淬灭率可高达99.8%（图1e）。

对于 在体 PTT，在卟啉体给药后24小时进行激光照射可迅速产生热量（图2）。经激光照射后，卟啉体可使温度升高超过 35 °C 照射1分钟后，而单独使用激光仅引起不到 10 °C最终肿瘤温度达到这一点非常重要 55 °C 以确保肿瘤完全消融。PTT照射后，由于强烈的热...

讨论

在药物递送技术的开发过程中，多功能纳米颗粒因其能够在保持高载药量的同时精确追踪药物递送载体，正受到广泛研究。与直接使用卟啉相比，负载卟啉的脂质体具有更优的药代动力学特性和更高的递送效率，但仍存在一些障碍，包括卟啉负载量受限以及卟啉从脂质体快速重新分布至血浆蛋白^5,6。与传统的脂质体递送系统（将游离卟啉插入脂质体核心或脂双层中）不同，焦脱镁叶绿酸（pyro）可直接且稳定地共价连接至磷脂分子，并自组装形成类似脂质体的纳米结构，即卟啉体（porphysomes）。因此，卟啉体的双层结构实现了极高的卟啉堆积密度，从而导致焦脱镁叶绿酸荧光的结构依赖性自猝灭现象以及高消光系数。

这些热解脂质偶联物通过类似于脂质体的制备方法（如常用于制备尺寸均一的单层囊泡的膜挤出法），在水相缓冲液中自组装形成卟啉体^7-9挤出过程始于干燥的脂质膜，将其在水溶液中水合，并经历多次冻融循环，以形成粒径分布较宽的多层囊泡。¹⁰当水合后的porphysome脂质膜浓度超过1 mg/ml时，手动挤出在物理操作上变得困难，因此在需要扩大porphysome制备...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
旋转蒸发仪	Thermo-Savant	SPD131DDA
涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236	型号：G560
高压挤出器	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml 热控挤出装置
加热循环浴（恒温循环器）	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
聚碳酸酯滤膜	Avanti Polar Lipids	610005	孔径 100 nm，膜直径 19 mm
泽塔电位分析仪	Malvern Instruments	ZS90
紫外/可见分光光度计	Varian Australia	Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer
荧光分光光度计	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
透射电子显微镜（TEM）	Hitachi	H-7000
细胞培养箱	SANYO	MCO-18AIC
功率计	Thorlabs	PM100D	配备 S142C 传感器
671 nm 激光器	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	序列号：10097270
红外测温仪	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
激光防护眼镜	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	光学密度：630–700 nm 范围内 ≥1.5