一种利用固有多功能纳米囊泡——卟啉体实现一分钟内、亚瓦功率光热消融肿瘤的方法

摘要

我们开发了一种新型的内在多功能纳米囊泡，称为porphysosome。该囊泡具有结构依赖性的荧光自猝灭特性和独特的光热特性，因而可作为高效的光热治疗试剂。我们采用高压挤出法制备了porphysosome，并在异种移植肿瘤模型中评估了其光热治疗效果。

摘要

我们近期开发了卟啉体作为本质上的多功能纳米囊泡。将光敏剂焦脱镁叶绿酸α与磷脂共轭后，自组装形成类似脂质体的球形囊泡。由于卟啉-脂质双分子层中卟啉分子密度极高，卟啉体表现出巨大的消光系数、结构依赖性的荧光自猝灭特性以及优异的光热效应。在我们的制备方法中，采用高压挤出法合成卟啉体，其平均粒径约为120 nm。静脉注射卟啉体24小时后，对肿瘤部位以750 mW（1.18 W/cm²）、671 nm激光照射1分钟，局部温度迅速从30 °C升高至62 °C。肿瘤完全热消融后，焦痂形成并在2周内愈合；而在对照组中，肿瘤持续生长，均在3周内达到预设的实验终点。这些数据表明，卟啉体可作为高效的光热治疗（PTT）试剂。

引言

卟啉体是我们近期研发的一种新型多功能纳米囊泡，具有多模态成像与治疗能力¹由自组装的卟啉双分子层形成，含有极高密度的卟啉（每个卟啉体颗粒超过83,000个），因而具有大的消光系数，并产生依赖于结构的独特的荧光自猝灭效应。卟啉体具有良好的 体内 药代动力学与生物分布特性：系统给药后，其血液半衰期为12小时，并在注射后24小时以7.5% ID/g的水平被动富集于异种移植肿瘤中².

其独特的结构和理化特性使卟啉体成为多模态成像和影像引导治疗的良好候选材料。首先，由于含有卟啉，卟啉体在蓄积于肿瘤部位后，天然适用于肿瘤的荧光成像¹此外，每种卟啉都具有一个稳定的螯合放射性同位素位点，因此卟啉体可轻松标记放射性同位素（如用于PET成像的64Cu）³此外，当卟啉体结构完整时，在激光照射下吸收的光能会以热能形式耗散，因此卟啉体还表现出独特的光声成像和光热治疗能力。研究表明，静脉注射卟啉体24小时后，对富集了卟啉体的肿瘤进行激光照射，可迅速升温并实现强烈的光热消融。这证明了卟啉体是高效的光热增强剂，其消光系数与金纳米颗粒（AuNPs）相当。¹另一方面，与其他无机光热剂（如金纳米颗粒）相比，由于具有有机特性，卟啉体在生物安全性方面表现出显著优势。卟啉体可被酶降解，在小鼠中即使静脉注射剂量高达1,000 mg/kg也仅引起极低的急性毒性。¹此外，与脂质体....

方案

1. 原卟啉-脂质的合成

1. 将200 mmol焦脱镁叶绿酸（由Spirulina Pacifica藻类制备，制备方法见前文；Zheng et al., Bioconj. Chem., 2002, 13-392）⁴、98.7 mg 16:0 溶血磷脂酰胆碱（1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，Avanti Polar Lipids #855675）、76.3 mg EDC 和 48.7 mg DMAP（4-(二甲氨基)吡啶）溶于5 ml 戊烯稳定氯仿中，使Pyro:脂质:EDC:DMAP的摩尔比为1:1:2:2。
2. 在氩气保护下室温搅拌反应混合物24小时。使用旋转蒸发仪在减压条件下加热至40 °C，蒸发除去氯仿。得到焦脱镁叶绿酸-脂质异构体混合物（焦脱镁叶绿酸连接于sn-1或sn-2位）。
3. 将焦脱镁叶绿酸-脂质异构体混合物重新悬浮于含1 mM CaCl₂、50 mM Tris（pH 8）、0.5% Triton X-100和10%甲醇的溶液中，浓度为5 mg/ml。加入来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2（PLA2），终浓度为0.1 mg/ml，于37 °C孵育24小时，以消化sn-1位的焦脱镁叶绿酸-脂质，获得纯化的sn-2位焦脱镁叶绿酸-脂质异构体。
4. 加入2倍体积的氯仿和1.25倍体积的甲醇，进行萃取，然后在40 °C下通过减压旋转蒸发除去溶剂。将裂解产....

结果

焦脱镁叶绿酸与磷脂共价结合形成稳定的脂质单体（图1a），并通过高压挤出法经膜挤出工艺使这些偶联物自组装形成卟啉体。在挤出的前3个循环中，通常难以挤出卟啉体-脂质悬浮液，流速相对较慢。随着挤出次数增加，挤出溶液的流速逐渐提高，必要时可略微降低压力。粒径、浓度和淬灭效率是挤出后表征纳米颗粒的三个重要性质。所制备的卟啉体具有高度均一的粒径分布（主峰约120 nm）（图1b和1c），具有两个主要吸收峰（410 nm和677 nm，图1d），在4 °C保存时可保持稳定超过12个月。当纳米结构完整时，卟啉的荧光淬灭率可高达99.8%（图1e）。

对于 在体 PTT，在卟啉体给药后24小时进行激光照射可迅速产生热量（图2）。经激光照射后，卟啉体可使温度升高超过 35 °C 照射1分钟后，而单独使用激光仅引起不到 10 °C最终肿瘤温度达到这一点非常重要 55 °C 以确保肿瘤完全消融。PTT照射后，由于强烈的热.......

讨论

在药物递送技术的开发过程中，多功能纳米颗粒因其能够在保持高载药量的同时精确追踪药物递送载体，正受到广泛研究。与直接使用卟啉相比，负载卟啉的脂质体具有更优的药代动力学特性和更高的递送效率，但仍存在一些障碍，包括卟啉负载量受限以及卟啉从脂质体快速重新分布至血浆蛋白^5,6。与传统的脂质体递送系统（将游离卟啉插入脂质体核心或脂双层中）不同，焦脱镁叶绿酸（pyro）可直接且稳定地共价连接至磷脂分子，并自组装形成类似脂质体的纳米结构，即卟啉体（porphysomes）。因此，卟啉体的双层结构实现了极高的卟啉堆积密度，从而导致焦脱镁叶绿酸荧光的结构依赖性自猝灭现象以及高消光系数。

这些热解脂质偶联物通过类似于脂质体的制备方法（如常用于制备尺寸均一的单层囊泡的膜挤出法），在水相缓冲液中自组装形成卟啉体^7-9挤出过程始于干燥的脂质膜，将其在水溶液中水合，并经历多次冻融循环，以形成粒径分布较宽的多层囊泡。¹⁰当水合后的porphysome脂质膜浓度超过1 mg/ml时，手动挤出在物理操作上变得困难，因此在需要扩大porphysome制备.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
旋转蒸发仪	Thermo-Savant	SPD131DDA
涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236	型号：G560
高压挤出器	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml 热控挤出装置
加热循环浴（恒温循环器）	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
聚碳酸酯滤膜	Avanti Polar Lipids	610005	孔径 100 nm，膜直径 19 mm
泽塔电位分析仪	Malvern Instruments	ZS90
紫外/可见分光光度计	Varian Australia	Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer
荧光分光光度计	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
透射电子显微镜（TEM）	Hitachi	H-7000
细胞培养箱	SANYO	MCO-18AIC
功率计	Thorlabs	PM100D	配备 S142C 传感器
671 nm 激光器	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	序列号：10097270
红外测温仪	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
激光防护眼镜	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	光学密度：630–700 nm 范围内 ≥1.5