合成、细胞递送及 在体 树状大分子基pH传感器的应用

摘要

荧光传感器是生命科学中的有力工具。本文介绍了一种合成和使用基于树状大分子的荧光传感器以测定活细胞内pH值的方法 体内树突状支架可增强共轭荧光染料的性能，从而改善其传感特性。

摘要

荧光探针的发展为生命科学领域带来了一场革命。具有感应能力的基因编码荧光蛋白和合成荧光染料使得生物相关物质能够以高空间和时间分辨率被可视化。合成染料因其高度可调性以及可检测分析物的广泛范围而备受关注。然而，这些小分子存在若干局限性，包括溶解性差、靶向困难，通常无法进行比率成像。本文介绍了基于树状大分子的传感器的开发，并提供了一种用于pH测量的实验方案。 关键词：荧光探针，基因编码荧光蛋白，合成染料，感应能力，空间分辨率，时间分辨率，可调性，分析物，小分子行为，溶解性，靶向，比率成像，树状大分子，pH测量 体外，在活细胞中 体内我们选择树状大分子作为传感器的理想平台，因其具备多种理想特性（单分散性、可调控的性质、多价性），使其成为多种生物医学装置中广泛使用的支架结构。将荧光pH指示剂与树状大分子支架偶联后，显著提升了其传感性能。特别是树状大分子表现出更低的细胞泄漏、更优的细胞内靶向性，并可实现比率型测量。这些新型传感器已成功用于活体HeLa细胞内的pH测定。 体内 在小鼠脑中。

引言

荧光分子用于标记特定的生物学相关分子，彻底改变了我们研究生物系统的方式。宽场显微镜和共聚焦显微镜实现了对生物过程的实时高分辨率可视化，如今已成为研究生物事件最常用的技术之一 体外，在细胞中 体内.¹ 荧光指示剂的开发代表了一项重要改进， 即 其荧光依赖于特定分子实体浓度的染料。尤其是pH值和钙离子指示剂，由于H⁺和Ca²⁺在细胞生理学中具有极其重要的作用，这些指示剂对细胞生理学研究产生了巨大影响⁺ 和 Ca²⁺ 生物学中的离子^2,3

然而，大多数传感染料因其小分子特性而存在若干内在局限性，例如：i）难以实现亚细胞器靶向；ii）在水中溶解度差，因而生物相容性差；iii）易从细胞中泄漏，从而无法进行长时间的延时成像。⁴ 此外，许多探针的信号无法校正染料浓度依赖性的影响（非比率成像），因此难以在细胞内进行绝对定量测量 体内 是不可能的。

我们最近描述了一种简单且有效的策略，以克服这些局限性，该策略基于将传感染料偶联到树状大分子支架上。⁵ 树状大分子是一类单分散的超支化聚合物，具有非常理想的生物学应用特性。⁶ 特别是，已有多种树状结构被开发并用于药物⁷和基因递送。⁸

方案

1. 传感器的合成

1. 在下述部分中，我们提供了一种将 pH 指示剂与 PAMAM 树状大分子偶联的实验方法。该相同方案经微小修改后也可适用于其他含氨基的树状大分子^5,17,13,14。市售的树状大分子和染料可直接使用，无需进一步纯化。
2. 将树状大分子溶解于无水 DMSO 中（终浓度为 50 μM）。用无水 DMSO 配制 10 mM 的荧光素-NHS 和四甲基罗丹明-NHS（TMR）储备液。
3. 向树状大分子溶液中加入所需量的荧光素和 TMR。混合物中的摩尔比将决定负载在树状大分子上的染料量。通常，在微量离心管中取 1 ml G4 PAMAM 树状大分子溶液，加入 8 当量（40 μl）荧光素和 8 当量（40 μl）TMR。室温下搅拌反应 12 小时。
4. 用去离子水将反应液稀释 10 倍，然后将溶液转移至透析袋（截留分子量 MWCO = 10 kDa）中。用去离子水透析 24 小时，期间频繁更换透析液。
5. 将透析后的溶液转移至样品瓶中，冷冻干燥 24 小时，应得到紫色粉末。称量所得固体，并将其溶解于 milliQ 水中，配制成终浓度为 10 μM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。

2. 体外 pH 测量

1. 对于 体外 校准：在石英比色皿中配制浓度为500 nM的树状大分子PBS（2 m....

结果

图1展示了将传感染料与不同树状支架连接的示意图。这些所得到的指示剂可通过一步简便的合成方法，从市售产品制备获得。含氨基的树状大分子在DMSO中与NHS活化的染料反应，随后通过透析纯化。该通用方法已成功用于标记多种树状大分子：i) 第2、4和6代PAMAM树状大分子¹²；聚乙二醇修饰的PAMAM树状大分子¹⁷以及PEG-树状杂合体¹⁸。由于不同的树状大分子在细胞和组织中表现出不同的相互作用（如定位、毒性、通透性和扩散性），因此树状结构的选择与预期应用及目标样本密切相关。

传感器包含两组荧光染料：i）pH 指示剂和 ii）作为内部参比的 pH 不敏感基团。尽管有多种指示剂和参比物质可供选择，但使用荧光素和四甲基罗丹明时获得的结果最佳。通过在反应中使用不同摩尔当量，即可简单调节两种染料的比例。 图2 显示一个典型的 体外 pH传感器的滴定。荧光素和罗丹明可分别在488 nm和550 nm处被激发，从而实现两个通道间的最小串扰。如图所示，荧.......

讨论

成功使用基于树状大分子的传感器进行pH成像的关键步骤包括：i）选择合适的树状支架及其偶联的指示剂数量，以及ii）优化传感器在细胞内的递送方案 体内

合成过程相当简便，几乎可适用于所有含氨基的超支化聚合物。该类传感器可通过市售的树状大分子和NHS活化染料一步法获得。我们相信，这种模块化且直接的合成方法将有利于此类传感器在多种生物学问题研究中的进一步应用。未结合染料可通过透析有效去除，实现产物的纯化。树状支架的选择至关重要，需根据具体应用需求而定。已有研究表明，不同类型的树状大分子由于与细胞内结构存在特异性相互作用，表现出独特的细胞内定位行为。中性树状大分子（例如乙酰化的PAMAM G4）在细胞内无明显相互作用，呈现弥散性分布，因此是全细胞成像的理想选择。相反，不同代数（G2至G6）的带正电荷树状大分子则会与带负电的生物分子发生静电相互作用，即 RNA）从而实现特异性细胞定位。因此，阳离子型树状大分子非常适用于细胞器特异性成像。

传感染料的选择至关重要。多种pH指示剂和pH不敏感染料具有不同的发.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
羧基荧光素 NHS 酯	Life technologies	C-1311
TMR NHS 酯	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
透析袋	Spectrum Labs	132117
WillCo 培养皿	WillCo Wells	GWSt-3512
氨基甲酸乙酯	Sigma-Aldrich	U2500