通过随机微晶种子矩阵筛选提高蛋白质结晶成功率

摘要

本文介绍了一种通用的随机微晶种子矩阵筛选方法。该技术可显著提高蛋白质结晶筛选实验的成功率，减少后续优化的需要，并为数据收集及配体浸泡实验提供稳定可靠的晶体来源。

摘要

随机微晶种子矩阵筛选（rMMS）是一种蛋白质结晶技术，该方法将晶种加入随机筛选条件中。通过提高晶体在蛋白质相图亚稳区生长的可能性，通常可获得更多的结晶条件，提升所获晶体的质量，并为数据收集和浸泡实验提供充足的晶体资源。本文介绍一种通用的rMMS方法，适用于坐滴或悬滴蒸气扩散实验，可通过手工操作或液体处理机器人建立，适用于96孔或24孔板格式。

引言

从Perutz、Kendrew及其同事最初将其应用于血红蛋白和肌红蛋白结构的测定，到如今结构基因组学联盟所采用的现代高通量自动化流程，大分子X射线晶体学为我们前所未有地揭示了蛋白质世界的结构细节。该技术仍是适用范围最广的实验方法，能够直接在原子或近原子分辨率（即 1–3 Å范围内）可视化蛋白质结构。应用X射线衍射技术测定蛋白质结构的前提是该蛋白质必须首先形成晶体，而这一环节至今仍是衍射方法解析结构过程中最主要的速率限制步骤^{1, 2}。尽管我们对蛋白质结晶过程的理解已取得显著进展，并且在结晶筛选试剂盒、结晶板及相关技术的质量与可及性方面也有了重大改进，但目前仍无法可靠预测结晶成功的可能性³。可采用生物化学与生物物理方法评估目标蛋白质是否具备有利于晶体成核与生长的特性，即 蛋白质是否正确折叠、均一、单分散等；然而，这些信息尚无法提供对结晶倾向性的明确预测。

长期以来，接种法被认为是一种有效的方法，可用于提高现有晶体或结晶材料的数量、尺寸和质量^4-7。该方法基于如下前提：支持晶体成核的条件可能并不适合后续晶体生长，反之亦然。通过将已成核的物质从一种条件转移至另一种条件，可尝试有效解耦这两个过程，从而探索新的、尚未开发的结晶空间，进而提高筛选实验的整体成功率。已有文献记录的成熟方法包括：（i）宏观接种（macroseeding），即将单个晶体整体从一种条件转移至另一种条件

方案

1. 战略考量

1. 用于微种子实验的晶种选择将根据实验目的的不同而有所变化。在项目初期，获得多个结晶初筛结果有助于为晶体优化提供不同的起始点。而重复微种子法（rMMS）极大地减少了晶体优化的需求，因为高质量晶体更有可能在相图的亚稳区中生长。 即 在系统经扰动或成核后能够恢复平衡的区域内，我们建议一旦获得首批晶体（或更准确地说，一旦首批晶体停止生长），即常规使用rMMS。
2. 对于第一轮微种子矩阵筛选（rMMS），应尽可能使用大量结晶材料制备种子储备液。如果仅有一个含有晶体的孔，或晶体较小，则可设置多个原始阳性条件的重复（不加种子）以增加晶体供应量。然而，若获得了多个不同的阳性条件，则可从多个条件中收集种子晶体并混合使用。
3. 为避免相分离，应在高盐条件下生长的晶体与在高聚乙二醇（PEG）条件下生长的晶体分别收获。若混合来自多个孔的晶体，应选择产生盐晶体可能性较低的储液溶液用于制备晶种悬浮液。例如，应避免使用高浓度的磷酸盐、硫酸盐、钙和镁。
4. 在项目后期，寻找具有不同晶胞的晶体可能非常重要，以改善衍射质量、避免孪晶，并获得适合结合配体的晶体。在此阶段，仅选择最合适的晶体（例如 应选用衍射质量最佳的晶体来制备晶种储备液。有时需要进行多轮微晶接种，每轮仅选用“最佳”晶体来制备下一轮的晶种储备液。若条件允许，应使用PEG 3000等“中性”沉淀剂悬浮晶种晶体，以促进形成新的晶体接触，并有助于在高盐溶液中不稳定的复合物结晶。 ^....

结果

（A）rMMS 实验示例

为了验证rMMS筛选方法的有效性，我们将该方法应用于鸡卵清溶菌酶（HEWL）和牛肝过氧化氢酶（BLC）的结晶。这两种酶均极易结晶，且其结构已被充分表征^{15, 16}，因此是展示rMMS所能实现的更高结晶成功率的理想测试对象。结晶实验采用96孔坐滴板格式，并通过液体处理机器人建立。将两种酶的冻干粉末分别溶解于20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中，配制成终浓度分别为100 mg/ml和20 mg/ml的蛋白溶液。针对每种蛋白，使用了三种包含96种条件的结晶筛选试剂盒：JCSG、PACT和Morpheus。非微晶接种的结晶筛选采用50 μl的储液体积，坐滴体积为2 μl，包含1 μl蛋白溶液和1 μl储液。六块结晶板被置于18 °C恒温室内，并每日使用双目显微镜进行观察，记录任何晶体生长的迹象。五天后，从每块板中选择一个能够支持晶体物质生长的条件，用于制备晶种储备液。rMMS筛选的操作方式与非rMMS筛选相同，唯一区别在于坐滴体积为2.5 μl，包含1 μl蛋白溶液、1 μl储液和0.5 μl晶种储备液。全部.......

讨论

本文介绍了一种用于rMMS蛋白质结晶筛选的通用方法。我们通过两种测试蛋白质的实验表明，使用该方法可显著提高结晶成功率。利用同步辐射对采用rMMS与非rMMS方法获得的部分晶体进行衍射分析，结果显示两种方法生长的晶体在衍射质量上差异不大，尽管此前有研究者报告称，在rMMS实验中更有可能获得高质量晶体^{11, 13}。溶菌酶（HEWL）和BLC的结果可能具有非典型性，因为这两种蛋白质异常易于结晶。我们还说明了优化rMMS实验中晶种储备液浓度的重要性，并展示了如何通过稀释调节该浓度，以确保产生适量可用于衍射的优质晶体。

rMMS 是一种简单、高通量且高度可扩展的方法，可用于补充传统的筛选方法。实验可通过手动或机器人操作，在96孔板或24孔板中进行，支持悬滴或坐滴形式。rMMS 的主要局限在于，最初需要获得目标蛋白（或同源蛋白）的某种晶体材料，以制备晶种储备液。但需要注意的是，并不需要高质量的晶体材料；事实上，作者已成功利用微晶和无定形沉淀物制备了晶种储备液。rMMS 筛选的应用不仅限于天然蛋白晶体的生长。例如，rMMS 非常适用于培养硒代甲硫氨酸或硒代半胱氨酸取代突.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MRC 96 孔结晶板	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	不适用于紫外光，用于机器人建立的筛选
ClearView 密封膜	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
鸡卵清溶菌酶	Sigma-Aldrich	L6876	纯度约 95%
牛肝过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C9322	>95% 纯度
木聚糖酶	Hampton Research	HR7-104
来自丹尼尔薯蓣果的索马甜	Sigma-Aldrich	T7630
来自嗜热蛋白解芽孢杆菌 rokko 的嗜热菌蛋白酶	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	用于机器人建立的筛选
PACT premier HT-96 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	用于机器人建立的筛选
Morpheus HT-96 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	用于机器人建立的筛选
Crystal Ph–nix 液体处理系统	Art Robbins Instruments	602-0001-10
晶种珠试剂盒	Hampton Research	HR2-320
双目光学立体显微镜	Leica	M165C
手术刀片	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1–2.5 μl 移液器	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2–20 μl 移液器	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100–1000 μl 移液器	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	用于手工建立的筛选
PACT premier 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	用于手工建立的筛选
Morpheus 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	用于手工建立的筛选
镊子	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene 18 mm 盖玻片	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml 玻璃巴斯德吸管	Sigma-Aldrich	Z722669
涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-360
24 孔 XRL 结晶板	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	用于手工建立的筛选
30% (w/v) PEG 8000，0.2 M 硫酸铵，0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000，0.2 M 醋酸镁，0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000，100 mM 柠檬酸，pH 5.0