通过随机微晶种子矩阵筛选提高蛋白质结晶成功率

摘要

本文介绍了一种通用的随机微晶种子矩阵筛选方法。该技术可显著提高蛋白质结晶筛选实验的成功率，减少后续优化的需要，并为数据收集及配体浸泡实验提供稳定可靠的晶体来源。

摘要

随机微晶种子矩阵筛选（rMMS）是一种蛋白质结晶技术，该方法将晶种加入随机筛选条件中。通过提高晶体在蛋白质相图亚稳区生长的可能性，通常可获得更多的结晶条件，提升所获晶体的质量，并为数据收集和浸泡实验提供充足的晶体资源。本文介绍一种通用的rMMS方法，适用于坐滴或悬滴蒸气扩散实验，可通过手工操作或液体处理机器人建立，适用于96孔或24孔板格式。

引言

从Perutz、Kendrew及其同事最初将其应用于血红蛋白和肌红蛋白结构的测定，到如今结构基因组学联盟所采用的现代高通量自动化流程，大分子X射线晶体学为我们前所未有地揭示了蛋白质世界的结构细节。该技术仍是适用范围最广的实验方法，能够直接在原子或近原子分辨率（即 1–3 Å范围内）可视化蛋白质结构。应用X射线衍射技术测定蛋白质结构的前提是该蛋白质必须首先形成晶体，而这一环节至今仍是衍射方法解析结构过程中最主要的速率限制步骤^{1, 2}。尽管我们对蛋白质结晶过程的理解已取得显著进展，并且在结晶筛选试剂盒、结晶板及相关技术的质量与可及性方面也有了重大改进，但目前仍无法可靠预测结晶成功的可能性³。可采用生物化学与生物物理方法评估目标蛋白质是否具备有利于晶体成核与生长的特性，即 蛋白质是否正确折叠、均一、单分散等；然而，这些信息尚无法提供对结晶倾向性的明确预测。

长期以来，接种法被认为是一种有效的方法，可用于提高现有晶体或结晶材料的数量、尺寸和质量^4-7。该方法基于如下前提：支持晶体成核的条件可能并不适合后续晶体生长，反之亦然。通过将已成核的物质从一种条件转移至另一种条件，可尝试有效解耦这两个过程，从而探索新的、尚未开发的结晶空间，进而提高筛选实验的整体成功率。已有文献记录的成熟方法包括：（i）宏观接种（macroseeding），即将单个晶体整体从一种条件转移至另一种条件⁸；（ii）划线接种（streak seeding），即通过施加定向压力（例如使用猫须接触已有晶体表面）获取成核物质，随后将猫须划过新的结晶液滴以实现转移⁹；以及（iii）“经典”微接种（microseeding），即将研碎的晶体（或结晶物质）收集后产生的晶体“种子”转移至与产生种子时相似的结晶条件中¹⁰。值得注意的是，这三种方法均耗时较长且难以规模化，尤其是与现代液体处理结晶机器人所能实现的效率相比。这些因素在一定程度上导致人们认为接种法仅应在其他方法未能获得成果时才予以考虑。

随机矩阵微晶接种（rMMS）是一种较新的方法学创新，结合了传统微晶接种与高通量筛选及可扩展性的优势^11-13。该方法依赖于由已成核的晶体材料制备的种子储备液，可将此种子液分装至标准96条件结晶筛选板中的每个子孔或盖玻片上。该方法适用于坐滴或悬滴蒸气扩散实验，可在24孔或96孔板格式中通过手工或液体处理机器人建立。实验已证明，rMMS可显著提高结晶成功率，并产生衍射质量更高、数量更多的晶体^{11, 13, 14}，是晶体学家在持续追求结晶成功过程中所采用的一种创新技术手段。本文描述了一种通用的rMMS操作方法，并提供了展示该技术有效性的示例数据。

方案

1. 战略考量

1. 用于微种子实验的晶种选择将根据实验目的的不同而有所变化。在项目初期，获得多个结晶初筛结果有助于为晶体优化提供不同的起始点。而重复微种子法（rMMS）极大地减少了晶体优化的需求，因为高质量晶体更有可能在相图的亚稳区中生长。 即 在系统经扰动或成核后能够恢复平衡的区域内，我们建议一旦获得首批晶体（或更准确地说，一旦首批晶体停止生长），即常规使用rMMS。
2. 对于第一轮微种子矩阵筛选（rMMS），应尽可能使用大量结晶材料制备种子储备液。如果仅有一个含有晶体的孔，或晶体较小，则可设置多个原始阳性条件的重复（不加种子）以增加晶体供应量。然而，若获得了多个不同的阳性条件，则可从多个条件中收集种子晶体并混合使用。
3. 为避免相分离，应在高盐条件下生长的晶体与在高聚乙二醇（PEG）条件下生长的晶体分别收获。若混合来自多个孔的晶体，应选择产生盐晶体可能性较低的储液溶液用于制备晶种悬浮液。例如，应避免使用高浓度的磷酸盐、硫酸盐、钙和镁。
4. 在项目后期，寻找具有不同晶胞的晶体可能非常重要，以改善衍射质量、避免孪晶，并获得适合结合配体的晶体。在此阶段，仅选择最合适的晶体（例如 应选用衍射质量最佳的晶体来制备晶种储备液。有时需要进行多轮微晶接种，每轮仅选用“最佳”晶体来制备下一轮的晶种储备液。若条件允许，应使用PEG 3000等“中性”沉淀剂悬浮晶种晶体，以促进形成新的晶体接触，并有助于在高盐溶液中不稳定的复合物结晶。 ¹².
5. 经典的微晶接种实验通常在确定了有前景的结晶条件之后以及后续优化过程中非常有用，该方法仅使用单一结晶条件。为了获得每滴中理想数量的晶体，通常需要对种子母液进行稀释。一种“组合式”微晶接种实验（即将一系列梯度稀释的种子母液加入同一结晶条件中）是快速确定种子母液最佳稀释度的有效方法。该方法的具体操作如下所述。

2. 种子库的制备

1. 使用本生灯火焰将玻璃巴斯德移液管制成圆头玻璃探针。
   1. 将移液管在中部附近加热至变软，然后迅速从火焰中取出，通过拉伸两端将其拉开。目标是将玻璃拉至直径小于0.25 mm。
   2. 在玻璃直径约为0.25 mm处将其折断，并将断端短暂浸入火焰中。重复此操作，直至末端形成直径约0.75 mm的玻璃半球形探针。该探针适用于研碎结晶物质，因其尺寸适宜敲击0.01–1.0 mm尺度的固体样品，且不会损伤结晶板亚孔或盖玻片的塑料表面。较大的探针（约1.0 mm）可能更有效地压碎微小晶体，因为晶体可被夹在玻璃与塑料之间而受到挤压。
2. 将含有种子珠的1.5 ml 微离心管置于冰上。
3. 使用双目显微镜或晶体成像系统检查已建立的结晶板，从板中选择一个或多个合适的孔，用于收获晶体材料以制备晶种储备液。可选用的材料包括细针状晶体、球晶、微晶以及形态不规则或发育不良的晶体。应在晶体停止生长后尽快制备晶种储备液，因为较陈旧的晶体材料更可能发生部分交联，从而降低其在晶种实验中的适用性。若对拟收获的晶体物质是否为盐或蛋白质存在疑问，可在打开前使用紫外荧光显微镜或成像系统观察该孔，或对晶体材料进行 原位 在托盘中进行X射线衍射分析。采用前一种方法时，蛋白质晶体在紫外照射下会发出荧光，而盐晶体则呈无色。
4. 打开选定的结晶板孔。对于96孔坐滴板，使用手术刀片沿选定孔周围的上层塑料密封膜切割。对于24孔悬滴板，使用镊子取下盖玻片，将盖玻片翻转后放置在稳定且洁净的表面上。吸取50 μl储液并转移至含有晶种微珠的微量离心管中，确保该管在整个操作过程中始终置于冰上。
5. 使用第2.1节中准备的玻璃探针，在显微镜下将位于96孔板小孔或24孔板盖玻片上的晶体液滴彻底压碎。较小的晶体可能需要数分钟才能完全粉碎。此步骤可使实验者确认晶体易于压碎，表明其未发生交联，同时确认其并非盐结晶。盐结晶在压碎时会产生特有的“咔哒”声，并可被听见和感知。若晶体坚韧难以压碎，建议尝试获取并使用更新鲜的样品。
6. 从Seed Bead管中取出5 μl储液，转移至含有待收获晶体材料的相应子孔（坐滴实验）或盖玻片（悬滴实验）中。用移液器将液体上下吹打5–6次，尽可能充分重悬子孔或盖玻片中的内容物。将悬液重新移回Seed Bead管中，并重复此步骤两次，确保尽可能多地收获晶体材料。
7. 涡旋种子珠2分钟，每30秒停止一次，将管置于冰上冷却。
8. 制备稀释系列，将种子储备液用储液溶液逐级稀释4至10倍。通常，使用未稀释的种子储备液会产生过多晶体，因此需使用稀释后的种子储备液以控制每个孔中的晶体数量。在第一轮重复微种子悬滴法（rMMS）中，重要的是不要稀释种子储备液，因为种子浓度越高，获得结晶的几率越大。
9. 若不立即使用，将种子储备液及其稀释液转移至 -20 °C 或 -80 °C 冰箱中保存。为避免反复冻融可能降低种子储备液的效价，应将该样品分装成小体积 aliquot 后储存。 即 10–20 μl。冻存后，种子储备可长期保存，直至需要时使用。

3. 结晶板的制备

1. 根据结晶设施的可用情况以及实验人员的偏好，可采用24孔板进行悬滴蒸气扩散法，或采用96孔板进行坐滴蒸气扩散法来开展rMMS结晶筛选。rMMS结晶板的设置可通过手工操作、使用液体处理机器人分配仪，或两者结合的方式完成。
2. 手工设置的典型rMMS实验包含1.0 μl蛋白溶液、1.0 μl结晶条件溶液和0.5 μl晶种储备液。使用结晶机器人设置的典型实验则包含0.3 μl蛋白溶液、0.2 μl结晶条件溶液和0.1 μl晶种储备液。
3. 在24孔悬滴板中进行rMMS筛选时，首先使用手动移液器将96孔结晶筛选试剂板（以10 ml单管格式）中的每种条件溶液各300 μl转移至4块预涂油脂的24孔结晶板的相应孔中。
   1. 将每种300 μl储液池中的1 μl结晶条件溶液转移至对应的塑料盖玻片表面，该盖玻片的正反两面保护背条均已去除。
   2. 在每1 μl结晶条件溶液中加入1 μl蛋白溶液，随后加入0.5 μl晶种储备液。将盖玻片翻转，使液滴朝下，并置于对应的孔上方。
   3. 向下按压盖玻片，压缩密封油脂，形成牢固密封。待全部96个液滴设置完成后，应将板转移至培养箱或恒温房间中储存，通常温度范围为4–18 °C。
4. 在96孔坐滴板中进行rMMS筛选时，首先将深孔块格式的96孔结晶筛选板中的每种条件溶液各20–50 μl转移至结晶板的相应孔中。此转移步骤可使用结晶机器人或八通道移液器手工完成。
   1. 通过手工或机器人按照步骤3.1中所述体积将储液池溶液、蛋白溶液和晶种储备液加入各液滴中。某些 commercially available 结晶机器人不采用接触式分配，使用此类系统进行晶种储备液转移可能导致分配针头或相关管路堵塞。加样顺序可变：部分机器人可同时分配所有溶液；若无法实现，则应先加蛋白溶液，再加储液池溶液，最后加晶种储备液。
   2. 若无接触式分配机器人，可使用配备钝头针头的微量玻璃注射器进行晶种转移。先将针头穿过储液池溶液进行冲洗，然后将晶种储备液逐滴加入各液滴中。
   3. 使用透明密封膜密封板，随后转移至培养箱或恒温房间中储存。

4. 结晶板的检查

1. 使用双目显微镜或晶体成像系统观察所有结晶实验。前者通常比后者能为用户提供更好的视野深度和放大倍数控制，但耗时更长。
2. 依次检查每个子孔/盖玻片，并记录任何晶体形成的迹象。实验建立后，应每24小时检查一次，持续5天，之后每7天检查一次，最长持续4周。
3. 通常需要进行多轮重复的微种子筛选（rMMS）才能获得适合衍射的高质量晶体。

结果

（A）rMMS 实验示例

为了验证rMMS筛选方法的有效性，我们将该方法应用于鸡卵清溶菌酶（HEWL）和牛肝过氧化氢酶（BLC）的结晶。这两种酶均极易结晶，且其结构已被充分表征^{15, 16}，因此是展示rMMS所能实现的更高结晶成功率的理想测试对象。结晶实验采用96孔坐滴板格式，并通过液体处理机器人建立。将两种酶的冻干粉末分别溶解于20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中，配制成终浓度分别为100 mg/ml和20 mg/ml的蛋白溶液。针对每种蛋白，使用了三种包含96种条件的结晶筛选试剂盒：JCSG、PACT和Morpheus。非微晶接种的结晶筛选采用50 μl的储液体积，坐滴体积为2 μl，包含1 μl蛋白溶液和1 μl储液。六块结晶板被置于18 °C恒温室内，并每日使用双目显微镜进行观察，记录任何晶体生长的迹象。五天后，从每块板中选择一个能够支持晶体物质生长的条件，用于制备晶种储备液。rMMS筛选的操作方式与非rMMS筛选相同，唯一区别在于坐滴体积为2.5 μl，包含1 μl蛋白溶液、1 μl储液和0.5 μl晶种储备液。全部...

讨论

本文介绍了一种用于rMMS蛋白质结晶筛选的通用方法。我们通过两种测试蛋白质的实验表明，使用该方法可显著提高结晶成功率。利用同步辐射对采用rMMS与非rMMS方法获得的部分晶体进行衍射分析，结果显示两种方法生长的晶体在衍射质量上差异不大，尽管此前有研究者报告称，在rMMS实验中更有可能获得高质量晶体^{11, 13}。溶菌酶（HEWL）和BLC的结果可能具有非典型性，因为这两种蛋白质异常易于结晶。我们还说明了优化rMMS实验中晶种储备液浓度的重要性，并展示了如何通过稀释调节该浓度，以确保产生适量可用于衍射的优质晶体。

rMMS 是一种简单、高通量且高度可扩展的方法，可用于补充传统的筛选方法。实验可通过手动或机器人操作，在96孔板或24孔板中进行，支持悬滴或坐滴形式。rMMS 的主要局限在于，最初需要获得目标蛋白（或同源蛋白）的某种晶体材料，以制备晶种储备液。但需要注意的是，并不需要高质量的晶体材料；事实上，作者已成功利用微晶和无定形沉淀物制备了晶种储备液。rMMS 筛选的应用不仅限于天然蛋白晶体的生长。例如，rMMS 非常适用于培养硒代甲硫氨酸或硒代半胱氨酸取代突...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MRC 96 孔结晶板	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	不适用于紫外光，用于机器人建立的筛选
ClearView 密封膜	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
鸡卵清溶菌酶	Sigma-Aldrich	L6876	纯度约 95%
牛肝过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C9322	>95% 纯度
木聚糖酶	Hampton Research	HR7-104
来自丹尼尔薯蓣果的索马甜	Sigma-Aldrich	T7630
来自嗜热蛋白解芽孢杆菌 rokko 的嗜热菌蛋白酶	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	用于机器人建立的筛选
PACT premier HT-96 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	用于机器人建立的筛选
Morpheus HT-96 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	用于机器人建立的筛选
Crystal Ph–nix 液体处理系统	Art Robbins Instruments	602-0001-10
晶种珠试剂盒	Hampton Research	HR2-320
双目光学立体显微镜	Leica	M165C
手术刀片	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1–2.5 μl 移液器	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2–20 μl 移液器	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100–1000 μl 移液器	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	用于手工建立的筛选
PACT premier 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	用于手工建立的筛选
Morpheus 筛选试剂盒	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	用于手工建立的筛选
镊子	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene 18 mm 盖玻片	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml 玻璃巴斯德吸管	Sigma-Aldrich	Z722669
涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-360
24 孔 XRL 结晶板	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	用于手工建立的筛选
30% (w/v) PEG 8000，0.2 M 硫酸铵，0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000，0.2 M 醋酸镁，0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000，100 mM 柠檬酸，pH 5.0