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利用FM染料检测诱发性、自发性和微小突触活动期间的突触囊泡再循环

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DOI：

10.3791/50557

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2014年3月31日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

本文内容

摘要

我们介绍了使用苯乙烯基FM染料对功能性神经末梢中的突触囊泡循环进行成像的方法。该方案不仅适用于诱发性突触活动，还可用于自发性和微小突触活动的检测。本方案拓展了可有效评估的突触事件类型。

摘要

功能性神经末梢中的突触小泡会经历胞吐和胞吞过程。这种突触小泡的循环可通过苯乙烯类 FM 染料进行有效分析，这些染料能够显示膜的更新情况。传统的 FM 染料使用方案主要用于分析在刺激（诱发）突触活动后神经元的反应。近年来，已发展出可用于分析伴随较弱突触活动（如自发性或微小突触事件）的 FM 信号的实验方案。对这些微小 FM 信号变化的分析要求成像系统具有足够灵敏度以检测强度的微小变化，同时又能抑制大幅的人为干扰信号。本文描述了一种可适用于诱发性、自发性和微小突触活动的实验方案，并以培养的海马神经元为例进行说明。该方案还包含评估 FM 染料光漂白速率的方法，因为光漂白是成像强度微小变化时产生伪影的重要来源。

引言

突触小泡的功能是决定突触传递的重要因素。当这些小泡与突触前质膜融合时（胞吐作用），会释放神经递质；随后通过从质膜再生（内吞作用）并重新装载神经递质，它们便能准备进入下一轮释放循环。由于苯乙烯类FM染料的引入1，对突触小泡循环动态及其机制的研究得到了极大推进。这类两亲性分子具有带正电荷的亲水头部基团和疏水性尾部（图1A中的多种染料，FM1-43的立体视图见图1B），可逆地进出脂质膜而不会穿透膜结构。FM染料家族共享某些影响其发光波长范围的共同特性。例如，FM2-10、FM1-43和FM1-84在两个环状化合物之间含有一个双键，呈现绿色荧光发射。它们之间的区别在于疏水尾部的长度，该长度决定了其疏水性，从而影响其从膜中解离（departitioning）的速率。而对于FM5-95和FM4-64，三个双键连接环状化合物，呈现红色荧光发射。这些染料在亲水部分也有所不同。所有FM染料在插入生物膜后荧光强度均会增强，这是因为在疏水环境中其量子产率高于亲水环境。因此，FM荧光强度的变化反映了膜周转的变化。不同颜色（发射光谱）和不同疏水性的特性使FM染料成为研究突触小泡循环的多功能工具。

基于这些特性，FM 染料在分析突触囊泡循环时通常遵循以下方案（图 2）。将神经元浸浴于含有 FM 染料的细胞外溶液中，使染料在通过内吞作用形成突触囊泡（SVs）时被摄入（染色）。随后通过施加不含染料的细胞外溶液将染料洗脱；此步骤可揭示功能性的神经末梢，即 只有那些正在活跃进行内吞作用的末梢才会含有负载了染料的突触囊泡簇（图 2 底部）。随后发生的胞吐作用会导致 FM 染料释放至细胞外空间，同时伴随荧光信号的减弱（脱色；原因包括染料进入亲水环境后的解离以及从胞吐位点扩散离去）。因此，FM 荧光强度的变化可作为突触囊泡胞吐与内吞作用的指标。

FM染料已被用于对多种生物体和制备样本中的突触小泡进行染色和脱色2,3。实例包括哺乳动物神经元培养物4-9、哺乳动物脑切片10,11、神经肌肉接头12,13、视网膜双极神经元14,15以及耳蜗毛细胞16。

通常在这些实验中，染色和脱色均通过强烈刺激神经元（诱发活动）来触发。然而最近，研究人员也开始分析弱刺激条件下的突触囊泡再循环，以及在无外界刺激情况下的再循环（即自发性和微型突触活动）。9,17-19自发性和微小突触活动是指在没有外部刺激的情况下发生的现象，其中前者涉及动作电位的自发发放（图3）。这些微弱的突触活动所引起的FM信号变化比强刺激引发的变化更小。该测量要求FM荧光强度的变化能够准确反映突触小泡的胞吐或内吞过程，而非荧光强度的人为假象变化。其中一种假象来源是FM染料对质膜的非特异性染色。该成分在洗涤过程中会逐渐被清除，导致测得的荧光强度发生缓慢变化，从而被错误地归因于突触活动。这一因素可通过适当的方法予以降低（见实验方案）。最显著的假象来源是保留在突触小泡内的FM染料发生的光漂白。与所测量的生物学（突触）变化相比，由光漂白引起的FM荧光强度变化必须足够小。近年来高灵敏度相机的发展， 例如 电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机可通过缩短曝光时间并降低激发荧光团所用光的强度，从而最大限度地减少光漂白。另一类伪影的成因是光学显微镜聚焦水平的漂移。成像过程中发生的焦平面漂移可能由机械或热效应引起，并会错误地导致所测荧光强度发生变化。

本文介绍了相关方案和设备，使得即使在刺激微弱或无刺激的条件下（特别是微小突触活动）也能利用 FM 染料分析突触小泡的循环过程。我们以培养的大鼠海马神经元为例，展示了诱发性和自发性突触事件中囊泡的染色与脱色过程，并对脱色阶段进行成像观察。此外，我们还演示了如何评估 FM 染料在无突触活动导致染料丢失情况下的光漂白程度。

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方案

1. 哺乳动物脑组织神经元的原代培养

本研究中进行的所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会批准。

  1. 制备出生后0至1天小鼠或大鼠海马CA3-CA1区的离体细胞培养19,20将海马细胞以每孔12,000个细胞的密度接种于预先接种大鼠胶质 feeder 层的12 mm盖玻片（厚度编号0）上，置于24孔板中培养。
  2. 培养海马神经元至少8天，以发育出功能性的神经末梢21我们使用培养11至14天的神经元 体外 当单个神经末梢相对孤立且无明显聚集时。神经元可用于实验的时间长达约21-28天 体外 例如 Willig 等22 和 诺西列娃和 Kavalali23.
  3. 在进行功能研究时，使用透射光显微镜在染色前对盖玻片进行评估，以观察神经元健康的各项指标例如 使用10-20倍放大倍数的相差光学显微镜观察。健康细胞的指标包括：胶质细胞层均匀，神经元周围细胞边界清晰，树突延伸良好且无串珠样结构，胞体无成簇现象，神经突无成束现象。

2. 使用 FM 染料加载突触小泡（染色）

  1. 由电场刺激诱发的突触活动（涉及动作电位）所致的染色
    1. 通过将FM染料加入基于HEPES的无染料溶液中，制备染色溶液1， 例如 Tyrode 溶液（详见“溶液”部分）。FM 染料的浓度为 10 μM FM1-43 和 2.5 μM FM4-64。典型浓度范围为：2–15 μM FM1-43 或 2.5–20 μM FM4-64。3,6对于需要抑制反复性谷氨酸能突触活动并诱导突触可塑性的实验，需额外加入离子型谷氨酸受体拮抗剂：AMPA受体拮抗剂（例如 10 μM CNQX）和NMDA受体（例如 50 μM AP5
    2. 将载有细胞的盖玻片从培养基转移至预先装有普通Tyrode's溶液的成像室中。我们使用的成像室其侧壁附有刺激电极（铂丝，间距6.3 mm，RC-21BRFS）。该成像室设计为封闭式成像室，但我们将其用作开放式成像室（即 不加盖玻片，浴液体积约为 200 μl。转移过程中避免将培养的细胞暴露于空气中，并避免使用镊子夹压培养的细胞（应从盖玻片边缘而非中心位置夹取）。
    3. 用室温（23–25 °C）的普通Tyrode's溶液灌注成像室。
    4. 通过持续灌注施加染色液1。
    5. 通过施加电脉冲来诱发突触活动。为实现海马神经元中突触小泡总回收池的最大程度染色，以10 Hz频率刺激培养细胞60-120秒。 24在尝试实现最大场刺激效率时，需牢记以下几个要点：1）浴槽溶液的高度应尽可能低，同时确保神经元和刺激电极完全浸没于一层薄薄的Tyrode's溶液中（以维持神经元存活并获得均匀的电场）；2）应利用神经元兴奋性的指示指标来优化电流强度和持续时间。 例如 荧光 Ca2+ 成像；在本例中，30 的恒定电流 mA 强度和 1 毫秒持续时间可获得可靠结果。3) 刺激期间应以恒定流速施加灌流液；电刺激会导致电解，产生质子（H+) 在静态浴液中向阳极（正极）聚集，并导致阳极附近 pH 值迅速下降。通过在含有 pH 指示剂的溶液中施加数百次以上的脉冲，另设实验验证该酸化现象。例如 含酚红的汉克平衡盐溶液
    6. 刺激结束后，将神经元继续留在染色溶液1中60秒，以完成刺激后的内吞作用25.
    7. 用冲洗液1（无染料的Tyrode溶液，含AMPA受体和NMDA受体拮抗剂（见2.1.1节）以及电压门控Na⁺通道阻断剂）灌注成像腔，以洗去染色液+ 通道（例如 0.5–1 μM 河豚毒素（TTX）。该组合阻断剂将抑制因自发突触活动导致的FM染料流失。为最大程度提高清洗效率，可提高灌流速度（例如 最高可达 5-6 ml/min）持续 1-2 分钟，然后加入一次剂量（例如 使用移液器手动将1 ml冲洗液1直接加入开放的成像室中。控制手动灌注的力度和方向，以免扰动培养的神经元。
  2. 由高钾诱导的突触活动引起的染色+ 溶液（不涉及动作电位）。
    1. 通过将FM染料加入高钾溶液中来制备染色液2+ Tyrode 溶液。具体而言，通过以等摩尔浓度的 KCl 替代 NaCl，配制含 45 mM KCl 的改良 Tyrode 溶液。如需要，可添加 AMPA 和 NMDA 受体拮抗剂。该高钾+ 溶液将持续去极化神经元，从而激活Ca2+ 进入神经末梢，并最大程度地启动突触小泡的胞吐作用26较高浓度（70–90 mM）在其他研究中也有使用 例如 Klingauf 等27 和 Richards 等28
    2. 将载有培养神经元的盖玻片从培养基转移至预先加入普通Tyrode溶液的成像室中。
    3. 室温下，通过持续灌注或使用移液器加入染色液2，对神经元染色1-2分钟。26,28在后一种情况下，应通过将已知体积的染色液2加入已知体积的无染料溶液中，以控制最终染料浓度。
    4. 按照第2.1.7节所述，将成像室中的染色液冲洗干净。
  3. 自发性及微小突触活动引起的染色­
    1. 预热碳酸氢盐溶液（例如 将最低必需培养基（Minimum Essential Medium, MEM）放入培养箱中孵育超过60分钟，使其温度升至37 °C。
    2. 对于基于自发突触活动的染色，通过将FM染料加入MEM中配制染色液3。对于基于微小突触活动的染色，通过将TTX加入染色液3中配制染色液4。
    3. 将载有培养神经元的盖玻片从培养基转移至染色液3或4中，在37 °C下孵育10分钟以染色神经元。
    4. 用洗涤液1短暂清洗盖玻片。
    5. 将盖玻片转移至成像腔室中的洗涤液1。请注意以下事项：1）细胞不应暴露于空气中；如有必要，可不经过洗涤步骤，直接将盖玻片转移至成像腔室。2）可通过用基于HEPES的溶液替换染色液3或4，在室温下对神经元进行染色。3）可在高K⁺条件下对神经元诱发的突触活动进行染色。+ 采用该方法时，将染色液3或4替换为染色液2，并在室温下完成后续步骤，即可制备溶液。
    6. 按照第2.1.7节所述，将成像室中的染色液冲洗干净。

3. 洗去FM染料

  1. 在使用上述任一方法（第2.1.7节）完成神经元染色和初步清洗后，继续以冲洗液1在室温下灌流成像腔5–10分钟。此步骤将清除质膜及细胞外溶液中的FM染料。以本实验室所用成像腔为例，浴式灌流速率为600–1,200 μl/min。清洗过程也可在无细胞外Ca²⁺的条件下进行。2+ 抑制因突触活动导致的FM染料流失17. 可通过短暂使用 Advasep-7 增强洗涤效果，Advasep-7 是一种经修饰的环糊精，可作为细胞膜上 FM 染料的清除剂29-31. 保持 Advasep-7 暴露时间短暂至关重要（例如 5秒（单层培养情况下），以避免降低FM斑点的强度31 并损害细胞健康。通过应用无法进入突触囊泡的淬灭剂磺基罗丹明101（50-100 μM），可抑制质膜中FM1-43的荧光信号32.

4. 洗涤过程中寻找最佳成像视野 

  1. 使用高倍率、高数值孔径的物镜，通过透射光显微镜观察，确认待成像区域的细胞处于健康状态例如 40倍）起，继续使用配备相差或微分干涉对比光学系统的倒置显微镜（Eclipse Ti，Nikon）。该显微镜还配备有完美对焦系统（Perfect Focus System, PFS），可实现连续、实时的对焦校正，克服显微镜的焦平面漂移问题。该功能对于脱色过程中保持同一焦平面的时间序列成像至关重要。
  2. 使用荧光显微镜观察以确认染色效果。应避免FM斑点出现聚集，除非聚集本身是研究目标，因为这会使得单个突触小体难以分辨。注意观察FM斑点的形态：如果大多数染色的突触小体呈现为串状的圆形颗粒，则可能代表神经末梢处于非健康状态。尽量减少神经元暴露于强荧光激发光下的时间，以避免光漂白。

5. 从突触小泡中卸载 FM 染料（脱色）

  1. 电场刺激诱发突触活动导致的脱色现象。
    1. 用冲洗液2（与冲洗液1相同，但不含TTX）充分灌流神经元以洗去TTX。在独立实验中验证TTX洗脱效果，采用相同的洗涤参数（灌流速率和持续时间）。 例如 通过荧光 Ca2+ 细胞质钙成像2+ 由电场刺激诱导的瞬变电流，或通过膜片钳记录电压依赖性钠通道产生的瞬变电流+ 电流。
    2. 开始成像FM染料。对于FM1-43或FM4-64的成像，使用520 nm或650 nm 长 分别使用发射滤光片和490 nm激发滤光片，每1-2秒采集一次图像，采用较短的曝光时间（例如 10-20 毫秒），弱激发强度（例如 5-10% LED 功率）以及高灵敏度（例如 使用EM增益）。通过缩短曝光时间并降低荧光激发强度，以减少FM染料的光漂白。开启完美聚焦系统（Perfect Focus System），以减少显微镜的焦平面漂移。
    3. 在冲洗液2中，使用场刺激法刺激神经元例如 10 Hz 持续 120 秒20.
    4. 应用多轮刺激，并在各轮之间插入 1–2 分钟的休息期，以耗尽所有经 FM 染料标记的再循环突触囊泡中的染料。在评估先前状态中被 FM 染料标记的突触囊泡总再循环池大小时，此步骤至关重要。20,33.
  2. 在无动作电位的情况下由突触活动引发的褪色现象。
    1. 开始对FM染料进行成像。
    2. 将溶解于冲洗液1或2中的刺激试剂加入。此类试剂包括：KCl（高K⁺）+ 溶液, 例如 45 mM26，离子霉素（一种Ca2+ 提高细胞内 Ca 的离子载体2+ 通过允许 Ca 浓度2+ 从细胞外溶液进入细胞的内流，已使用 例如 在 5 μM 时20,34，以及蔗糖（一种高渗溶液，可刺激突触囊泡从易释放池中释放，用于 例如 500 mM时35,36使用快速局部灌注系统，以在施加试剂时实现可靠的时间控制。 例如 沃纳仪器公司的 SF-77B 系统37或Y型管系统38-40.
  3. 由自发性及微小突触活动引起的脱色现象。
    1. 为消除由自发突触活动引起的染料脱色，按照上述方法（第5.1.1节）使用冲洗液2洗去TTX。在用冲洗液2灌流神经元的同时，开始对FM染料进行成像。为消除由微小突触活动引起的染料脱色，在持续用含TTX的冲洗液1灌流神经元的同时，开始对FM染料进行成像。
    2. 在根据自发性或微小活动去染色后，通过诱发突触活动进行去染色来鉴定功能性神经末梢。诱发活动可采用上述任一方法实现。此鉴定步骤是必要的，因为被染色的结构可能并非功能性神经末梢，而是其他结构。例如 缓慢循环的内体或星形胶质细胞囊泡 大量由诱发活动引起的脱色有助于该过程。

6. 评估 FM 染料的光漂白速率

  1. 用可被醛类固定的FM染料对神经末梢进行染色（例如 FM1-43FX、FM4-64FX）。该操作可采用上述诱发性、自发性或微小染色法，并通过将FM染料替换为可固定FM染料来实现。
  2. 按照 2.1.7 节所述步骤洗去可固定的 FM 染料。
  3. 将盖玻片转移至固定液中，对神经元进行化学固定：在4 °C条件下，使用含4%多聚甲醛和4%蔗糖的Tyrode溶液固定30分钟。化学固定后，可固定的FM染料的荧光强度将得以保留。
  4. 用Tyrode's溶液将盖玻片转移至新鲜溶液中两次，每次10分钟，以洗去固定剂。
  5. 将盖玻片转移至成像室中的新鲜Tyrode溶液中。
  6. 使用与活神经元相同的成像参数开始对可固定的FM染料进行成像。在使用任何化学固定样本后，必须彻底冲洗成像腔室，因为残留的固定剂可能会影响在同一腔室中后续进行的活细胞成像实验。作为固定细胞成像的替代方案，可对染色后的活细胞进行成像以评估光漂白速率。然而需要注意的是，急性阻断微型突触活动较为困难；例如，通过去除细胞外Ca²⁺可将微型活动频率降低约50%。2+ 23，但并非完全阻断。  
  7. 每次成像结束后，采集一张背景图像，以评估FM荧光强度的绝对值。FM斑点的强度不仅包含来自神经末梢中FM染料的真实信号，还包括来自以下来源的背景噪声：1）位于神经元单层培养物下方的胶质细胞；2）盖玻片及光学组件例如 物镜、滤光片和反射镜），以及3）探测器（EMCCD相机）。背景噪声在成像视野中未染色的区域进行评估。当这些区域空间有限或强度不均一时，可改用关闭相机快门后采集的图像来获取探测器噪声，尽管该方法并非理想选择。使用相同的成像参数采集约10幅图像。

7. 图像分析

  1. 将获取的数据作为时间序列图像堆栈导入图像分析软件。我们使用 ImageJ（W. S. Rasband，NIH）及其相关插件， 例如 图像稳定插件（Kang Li），用于校正FM点状信号的轻微移动；时间序列分析器V2.0（Balaji Jayaprakash），用于分析时间序列数据。
  2. 计算系列图像开始和结束时的FM强度变化（ΔFM）。为此，对去染色开始前和去染色结束后的一系列图像进行平均处理（例如 5 个图像帧），并通过相减生成一幅差分图像。
  3. 通过将强度阈值应用于差分图像来识别潜在的功能性神经末梢，并检测强度高于该阈值的像素。设定阈值的一种方法是选择从裸盖玻片区域获得的背景强度的标准差。
  4. 将分离的功能性神经末梢识别为已检测到的、满足尺寸标准（连续像素的最小和最大数量）的相邻像素。此过程可从分析中排除背景噪声和聚集的神经末梢。
  5. 在检测到的像素簇上指定感兴趣区域（ROI）（每个独立的像素簇对应一个神经末梢）。去染过程中强度的总变化量（ΔFM）是常用的分析参数，代表诱发性、自发性或微小突触活动的累积量。根据实验目的，若ROI在记录期间出现强度增加、刺激前突然下降或刺激后潜伏期过长等情况，应予以排除。
  6. 通过将获取的时间序列数据导入图像分析软件来评估光漂白速率。对背景图像进行平均（例如 关闭快门后采集背景图像，并从各单幅图像中减去该背景图像。为推测为神经末梢的FM斑点分配感兴趣区域（ROI），并测量ROI荧光强度随时间的变化。

溶液

  1. 台氏液
    • 成分（单位：mM）：125 NaCl，2 KCl，2 CaCl2，2 MgCl2，30 葡萄糖，25 HEPES，310 mOsm，pH 7.4。
  2. 染色溶液 1
    • 台氏液加 FM 染料。
    • 该溶液用于通过电刺激诱发突触活动进行染色。
    • 必要时可添加 AMPA 受体和 NMDA 受体的拮抗剂。
  3. 染色溶液 2
    • 高 K+ 台氏液加 FM 染料。
    • 该改良台氏液通过将 KCl 浓度提高至 45 mM，并以等摩尔浓度的 KCl 取代 NaCl 配制而成。
    • 该溶液用于通过持续去极化诱发突触活动进行染色。
    • 必要时可添加 AMPA 受体和 NMDA 受体的拮抗剂。
  4. 染色溶液 3
    • MEM 溶液加 FM 染料。
    • 该溶液用于基于自发突触活动的染色。
  5. 染色溶液 4
    • MEM 溶液加 FM 染料和河豚毒素（TTX）。
    • 该溶液用于基于微型突触活动的染色。
  6. 洗涤溶液 1
    • 台氏液加 AMPA 受体和 NMDA 受体拮抗剂，以及河豚毒素（TTX）。
  7. 洗涤溶液 2
    • 台氏液加 AMPA 受体和 NMDA 受体拮抗剂，但不含河豚毒素（TTX）。

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结果

例如，我们展示了突触小泡脱色时间过程的代表性结果（图4）。培养的海马神经元通过自发突触活动加载FM4-64染料（步骤2.3），随后用无染料溶液（洗涤液2）冲洗。成像结果显示了利用自发活动进行的初始脱色时间过程（步骤5.3）（连续线的初始部分，图4A）。随后进行三轮诱发活动脱色，每轮采用10 Hz场刺激，持续120秒（步骤5.1）。通过双头箭头（ΔFMEvoked）示意了一种测量诱发脱色量的方法，该值对应于囊泡总可循环池的大小。

在给予第一个刺激之前，FM 荧光强度逐渐下降（见图4B放大图）。这种下降由自发突触活动引起的脱染（ΔFMSpont）和光漂白（ΔFMPB）共同构成。当光漂白的贡献较小时，可将成像前基线的变化（ΔFMSpont + ΔFMPB）近似作为自发活动导致的脱染量。

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讨论

我们已描述了针对诱发性、自发性和微小突触活动的突触小泡染色与去染色的实验方案，并介绍了在去染色阶段进行成像的方法。除了现有的方案外，我们还新增了一种基于微小突触活动观察FM去染色的新方案。利用这些方案，我们此前在一种运动障碍疾病——肌张力障碍的小鼠模型的培养神经元中鉴定出了异常表型。与野生型小鼠的神经元相比，这些神经元在高强度刺激下表现出加速的突触小泡胞吐作用，且该过程依赖于Ca2+ 20。此外，这些神经元还表现出更频繁的微小突触活动，这一现象已通过膜片钳电生理记录神经递质释放的结果得以证实19。

在使用FM染料进行此类分析时，该实验方案的关键在于评估并尽量减少光漂白。如果光漂白引起的荧光强度变化远小于突触活动所引发的变化，则可可靠地检测到FM荧光强度的细微变化。降低光漂白还有望抑制或消除细胞毒性。通过尽量减少荧光探针对激发光的暴露时间，可以降低光漂白，而在活体成像实验中，至少有两种设备组件可用于实现这一目的。其中一个重要的组件是高灵敏度的光子探测器，...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢Harata实验室成员在本研究实施过程中提供的有益讨论。本研究由美国心脏协会、肌张力障碍医学研究基金会、小爱德华·马林克罗特基金会、美国国家科学基金会以及Whitehall基金会向N.C.H.提供的资助项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脉冲发生器AMPIMaster-8
隔离式刺激器figure-materials-1 DigitimerDS3
倒置显微镜NikonEclipse TS100用于低倍率下评估细胞形态。
倒置显微镜NikonEclipse TiE用于高分辨率荧光和透射光成像，具有最小的焦距漂移。
物镜Nikon推荐使用水浸物镜。除非成像结构距离盖玻片表面较深（例如 >10 μm），否则也可使用油浸物镜。
滤光片组Nikon77032509FM1-43 使用 490/20 nm 激发，510 nm 双向分光镜，520 nm 长通发射
滤光片组Nikon77032809FM4-64 使用 490/420 nm 激发，510 nm 双向分光镜，650 nm 长通发射。 
EMCCD 相机Andor TechnologyiXon EM+ DU-860该 EMCCD 相机用于高灵敏度荧光检测。
液体循环冷却器Solid State Cooling SystemsOasis 160用于持续以冷却水灌流相机，维持 -80°C 温度，从而降低噪声。
LEDCoolLED-Custom Interconnect490 nm该光源用于快速开启/关闭荧光激发。
图像采集软件Andor TechnologySolis
成像腔室Warner InstrumentsRC-21BRFS
快速灌流系统Warner InstrumentsSF-77B
CNQXTocris Bioscience1045
D,L-AP5Tocris Bioscience0106
河豚毒素Tocris Bioscience1069注意：有毒试剂，小心操作。
FM1-43InvitrogenT35356
可醛固定 FM1-43（FM1-43FX）InvitrogenF35355
FM4-64InvitrogenT13320
可醛固定 FM4-64（FM4-64FX）InvitrogenF34653
离子霉素Sigma-AldrichI0634
Hanks’ 平衡盐溶液Sigma-AldrichH2387
最低必需培养基Invitrogen51200-038该溶液不含会干扰荧光成像的酚红。
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710注意：有毒试剂，小心操作。
蔗糖Sigma-AldrichS7903

参考文献

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305(2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146(2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34(2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

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