利用FM染料检测诱发性、自发性和微小突触活动期间的突触囊泡再循环

摘要

我们介绍了使用苯乙烯基FM染料对功能性神经末梢中的突触囊泡循环进行成像的方法。该方案不仅适用于诱发性突触活动，还可用于自发性和微小突触活动的检测。本方案拓展了可有效评估的突触事件类型。

摘要

功能性神经末梢中的突触小泡会经历胞吐和胞吞过程。这种突触小泡的循环可通过苯乙烯类 FM 染料进行有效分析，这些染料能够显示膜的更新情况。传统的 FM 染料使用方案主要用于分析在刺激（诱发）突触活动后神经元的反应。近年来，已发展出可用于分析伴随较弱突触活动（如自发性或微小突触事件）的 FM 信号的实验方案。对这些微小 FM 信号变化的分析要求成像系统具有足够灵敏度以检测强度的微小变化，同时又能抑制大幅的人为干扰信号。本文描述了一种可适用于诱发性、自发性和微小突触活动的实验方案，并以培养的海马神经元为例进行说明。该方案还包含评估 FM 染料光漂白速率的方法，因为光漂白是成像强度微小变化时产生伪影的重要来源。

引言

突触小泡的功能是决定突触传递的重要因素。当这些小泡与突触前质膜融合时（胞吐作用），会释放神经递质；随后通过从质膜再生（内吞作用）并重新装载神经递质，它们便能准备进入下一轮释放循环。由于苯乙烯类FM染料的引入¹，对突触小泡循环动态及其机制的研究得到了极大推进。这类两亲性分子具有带正电荷的亲水头部基团和疏水性尾部（图1A中的多种染料，FM1-43的立体视图见图1B），可逆地进出脂质膜而不会穿透膜结构。FM染料家族共享某些影响其发光波长范围的共同特性。例如，FM2-10、FM1-43和FM1-84在两个环状化合物之间含有一个双键，呈现绿色荧光发射。它们之间的区别在于疏水尾部的长度，该长度决定了其疏水性，从而影响其从膜中解离（departitioning）的速率。而对于FM5-95和FM4-64，三个双键连接环状化合物，呈现红色荧光发射。这些染料在亲水部分也有所不同。所有FM染料在插入生物膜后荧光强度均会增强，这是因为在疏水环境中其量子产率高于亲水环境。因此，FM荧光强度的变化反映了膜周转的变化。不同颜色（发射光谱）和不同疏水性的特性使FM染料成为研究突触小泡循环的多功能工具。

基于这些特性，FM 染料在分析突触囊泡循环时通常遵循以下方案（图 2）。将神经元浸浴于含有 FM 染料的细胞外溶液中，使染料在通....

方案

1. 哺乳动物脑组织神经元的原代培养

本研究中进行的所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 制备出生后0至1天小鼠或大鼠海马CA3-CA1区的离体细胞培养^19,20将海马细胞以每孔12,000个细胞的密度接种于预先接种大鼠胶质 feeder 层的12 mm盖玻片（厚度编号0）上，置于24孔板中培养。
2. 培养海马神经元至少8天，以发育出功能性的神经末梢²¹我们使用培养11至14天的神经元 体外 当单个神经末梢相对孤立且无明显聚集时。神经元可用于实验的时间长达约21-28天 体外 例如 Willig 等²² 和 诺西列娃和 Kavalali²³.
3. 在进行功能研究时，使用透射光显微镜在染色前对盖玻片进行评估，以观察神经元健康的各项指标例如 使用10-20倍放大倍数的相差光学显微镜观察。健康细胞的指标包括：胶质细胞层均匀，神经元周围细胞边界清晰，树突延伸良好且无串珠样结构，胞体无成簇现象，神经突无成束现象。

2. 使用 FM 染料加载突触小泡（染色）

1. 由电场刺激诱发的突触活动（涉及动作电位）所致的染色

结果

例如，我们展示了突触小泡脱色时间过程的代表性结果（图4）。培养的海马神经元通过自发突触活动加载FM4-64染料（步骤2.3），随后用无染料溶液（洗涤液2）冲洗。成像结果显示了利用自发活动进行的初始脱色时间过程（步骤5.3）（连续线的初始部分，图4A）。随后进行三轮诱发活动脱色，每轮采用10 Hz场刺激，持续120秒（步骤5.1）。通过双头箭头（ΔFM_Evoked）示意了一种测量诱发脱色量的方法，该值对应于囊泡总可循环池的大小。

在给予第一个刺激之前，FM 荧光强度逐渐下降（见图4B放大图）。这种下降由自发突触活动引起的脱染（ΔFM_Spont）和光漂白（ΔFM_PB）共同构成。当光漂白的贡献较小时，可将成像前基线的变化（ΔFM_Spont + ΔFM_PB）近似作为自发活动导致的脱染量。

讨论

我们已描述了针对诱发性、自发性和微小突触活动的突触小泡染色与去染色的实验方案，并介绍了在去染色阶段进行成像的方法。除了现有的方案外，我们还新增了一种基于微小突触活动观察FM去染色的新方案。利用这些方案，我们此前在一种运动障碍疾病——肌张力障碍的小鼠模型的培养神经元中鉴定出了异常表型。与野生型小鼠的神经元相比，这些神经元在高强度刺激下表现出加速的突触小泡胞吐作用，且该过程依赖于Ca^2+ 20。此外，这些神经元还表现出更频繁的微小突触活动，这一现象已通过膜片钳电生理记录神经递质释放的结果得以证实¹⁹。

在使用FM染料进行此类分析时，该实验方案的关键在于评估并尽量减少光漂白。如果光漂白引起的荧光强度变化远小于突触活动所引发的变化，则可可靠地检测到FM荧光强度的细微变化。降低光漂白还有望抑制或消除细胞毒性。通过尽量减少荧光探针对激发光的暴露时间，可以降低光漂白，而在活体成像实验中，至少有两种设备组件可用于实现这一目的。其中一个重要的组件是高灵敏度的光子探测器，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脉冲发生器	AMPI	Master-8
隔离式刺激器	Digitimer	DS3
倒置显微镜	Nikon	Eclipse TS100	用于低倍率下评估细胞形态。
倒置显微镜	Nikon	Eclipse TiE	用于高分辨率荧光和透射光成像，具有最小的焦距漂移。
物镜	Nikon		推荐使用水浸物镜。除非成像结构距离盖玻片表面较深（例如 >10 μm），否则也可使用油浸物镜。
滤光片组	Nikon	77032509	FM1-43 使用 490/20 nm 激发，510 nm 双向分光镜，520 nm 长通发射
滤光片组	Nikon	77032809	FM4-64 使用 490/420 nm 激发，510 nm 双向分光镜，650 nm 长通发射。
EMCCD 相机	Andor Technology	iXon EM+ DU-860	该 EMCCD 相机用于高灵敏度荧光检测。
液体循环冷却器	Solid State Cooling Systems	Oasis 160	用于持续以冷却水灌流相机，维持 -80°C 温度，从而降低噪声。
LED	CoolLED-Custom Interconnect	490 nm	该光源用于快速开启/关闭荧光激发。
图像采集软件	Andor Technology	Solis
成像腔室	Warner Instruments	RC-21BRFS
快速灌流系统	Warner Instruments	SF-77B
CNQX	Tocris Bioscience	1045
D,L-AP5	Tocris Bioscience	0106
河豚毒素	Tocris Bioscience	1069	注意：有毒试剂，小心操作。
FM1-43	Invitrogen	T35356
可醛固定 FM1-43（FM1-43FX）	Invitrogen	F35355
FM4-64	Invitrogen	T13320
可醛固定 FM4-64（FM4-64FX）	Invitrogen	F34653
离子霉素	Sigma-Aldrich	I0634
Hanks’ 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H2387
最低必需培养基	Invitrogen	51200-038	该溶液不含会干扰荧光成像的酚红。
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	注意：有毒试剂，小心操作。
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903