在小鼠前列腺癌模型中，利用靶向肿瘤间质中凝结的血浆蛋白的小肽类磁共振成像（MRI）对比剂，展示磁共振癌症分子成像技术。
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本文内容
摘要
摘要
肿瘤细胞外基质富含与癌症相关的蛋白质，这些蛋白质可作为癌症分子成像的生物标志物。在本研究中，我们展示了一种有效的磁共振（MR）癌症分子成像方法，采用一种小分子肽靶向的钆-DO3A单酰胺复合物作为靶向性MRI对比剂，特异性识别肿瘤间质中凝结的血浆蛋白。我们在小鼠原位PC-3前列腺癌模型中，开展了利用MRI无创检测前列腺肿瘤的实验，评估该对比剂的有效性。该靶向对比剂在低剂量（0.03 mmol Gd/kg）下即可产生显著的肿瘤对比增强效果。这种肽靶向的MRI对比剂在前列腺肿瘤的MR分子成像中具有良好的应用前景。
引言
有效成像癌症相关分子靶点对于提高癌症早期检测和诊断的准确性具有重要意义。磁共振成像（MRI）是一种强大的临床成像手段，具有高空间分辨率且无电离辐射1。然而，目前尚无可用于临床的靶向MRI对比剂。创新设计和开发靶向MRI对比剂将极大推动磁共振癌症分子成像的应用。研究人员已投入大量努力，致力于开发用于成像癌细胞表面表达的生物标志物的靶向对比剂。由于MRI的灵敏度相对较低，且这些生物标志物的浓度较低，使用小分子靶向对比剂实现有效磁共振分子成像所需的足够对比增强仍具挑战性2,3。为了获得足够的增强效果，已制备了多种递送系统，例如脂质体、纳米颗粒和高负载顺磁性Gd(III)螯合物的聚合物偶联物，以提高对比剂在靶部位的局部浓度4,5。尽管这些递送系统在动物模型中能够产生显著的肿瘤增强效果，但其较大的尺寸导致体内清除缓慢且不完全，从而引起有毒Gd(III)离子的长期蓄积，可能带来严重的安全性问题6。最近一些研究表明，通过选择在病灶局部高表达的合适分子生物标志物，并使用可快速排泄的小分子试剂，有望克服MRI在分子成像方面的局限性7,8。这类试剂的关键特征是靶向在病变组织中大量存在而在正常组织中极少表达的分子标志物。对比剂可高浓度结合于这些靶点，从而实现有效磁共振分子成像所需的足够对比增强。由于其分子尺寸小于肾滤过阈值，未结合的对比剂可迅速从体内排出，降低背景噪声。我们选择了一种普遍存在的癌症相关生物标志物——凝结的血浆蛋白，其在肿瘤间质中大量存在，而在正常组织中罕见9。我们合成了一个靶向对比剂，包含一个小分子靶向肽CGLIIQKNEC（CLT1），该肽在PC3前列腺肿瘤模型中表现出强特异性结合能力10，以及四个Gd-DOTA单酰胺螯合物。本文提供了在小鼠中进行磁共振癌症分子成像以检测肿瘤的方法学。
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方案
方案改编自先前的研究11。
1. CLT1 肽与 Gd-DOTA 的偶联
- 采用标准固相肽合成法，以Fmoc保护的氨基酸在2-氯三苯甲基氯树脂（1.0 mmol）上合成CLT1肽（CGLIIQKNEC）。
- 添加最后一个氨基酸后，在0 °C下用三氟乙酸铊(III)（1.09 g，2.0 mmol，2当量）的DMF溶液（20 ml）处理树脂上的线性肽，反应2小时，实现环化。
- 随后，在树脂上依次将PEG和赖氨酸偶联至CLT1肽（1.0 mmol）的N端，依次与Fmoc-NH-PEG-COOH（3.0 mmol）、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH（3.0 mmol）以及第二批Fmoc-Lys(Fmoc)-OH（6 mmol）反应。
- 用哌啶去除Fmoc保护基。加入DOTA-三(叔丁基酯)（4.58 g，8.0 mmol，每个氨基2当量），与树脂上赖氨酸树状结构产生的四个游离氨基反应，持续2小时。
- 最后，用三氟乙酸、水和三异丁基硅烷（TIS）的混合液（20 ml，95/2.5/2.5）在室温下处理8小时，将产物从树脂上裂解并脱保护。过滤除去树脂，并用三氟乙酸（TFA）洗涤。将合并的滤液逐滴加入冰冷的乙醚（200 ml）中，离心后用乙醚洗涤4次。真空干燥得到无色固体（1.99 g，61%产率）。
- 采用制备型高效液相色谱（HPLC）纯化粗产物，流动相A为含0.1% TFA的水溶液，流动相B为含0.1% TFA的乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0–20分钟内B相从0%升至40%，20–30分钟内B相从40%升至90%。
- 将CLT1-dL-(DOTA)4（250 mg，0.077 mmol）溶于去离子水（15 ml）中，用1 M NaOH调节pH至6。分批加入Gd(OAc)3·4H2O（472 mg，0.462 mmol，相对于DOTA单酰胺为1.5当量），同时用1 M NaOH维持反应体系pH为6。室温下搅拌反应48小时。
- 用乙二胺四乙酸（EDTA）（90 mg，0.31 mmol）络合残留的Gd(III)，并通过凝胶过滤柱纯化粗产物，得到最终产物CLT1-dL-(Gd-DOTA)4（169 mg，57%）。
2. 对比剂的表征
- 采用电感耦合等离子体-原子发射光谱法测定 Gd(III) 含量。
- 以 2,5-二羟基苯甲酸（2,5-DHB）为基质，在线性模式下获取基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱。
- 在 37 °C 下，使用弛豫仪在 60 MHz（1.5 T）条件下测定 CLT1-dL-(Gd-DOTA)4 对比剂及其非靶向对照剂 sCLT1-dL-(Gd-DOTA)4 在不同浓度水溶液中的弛豫时间。采用反转恢复脉冲序列测量 T1，采用具有 500 个回波的 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 序列测量 T2。根据 1/T1 和 1/T2 对 Gd 浓度作图曲线的斜率，计算各试剂的 T1 和 T2 弛豫率。
3. 原位PC3前列腺肿瘤细胞培养及动物模型的建立
- 在添加了5%胎牛血清和青霉素/链霉素/两性霉素B的RPMI培养基中培养稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的PC3前列腺癌细胞，通过胰酶消化收获细胞，并重悬于PBS中，细胞密度为2.5 × 104 个细胞/μl。
- 根据凯斯西储大学（CWRU）机构动物护理与使用委员会批准的动物实验方案，在凯斯西储大学无胸腺动物核心设施中饲养4–5周龄的雄性NIH无胸腺裸鼠。
- 手术区域喷洒2%氯己定溶液，随后覆盖吸水手术巾。操作过程中佩戴无菌外科手套。动物手术前，腹腔注射Avertin（250 mg/kg）以麻醉小鼠；也可选用浓度为50/5/1 mg/kg的氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪替代。使用眼用软膏涂抹小鼠眼部，以在麻醉期间维持角膜湿润。
- 使用无菌手术刀沿下腹正中线切开约1 cm长的小切口，穿透皮肤和腹膜，开始手术。在存活手术期间，切口周围需覆盖无菌手术巾。
- 轻柔地将前列腺背侧叶外翻并固定，以暴露前列腺组织。使用30号针头将PC3-GFP细胞的PBS悬液（20 μl）注射至前列腺内。最后使用伤口自动夹闭器关闭切口12。
- 术后监测期间，每天观察动物两次，持续1周。疾病征象包括拒食、尿道周围出现深色尿液积聚以及步态不稳，这些可能提示存在感染或缝钉导致膀胱梗阻。
- 术后10天，使用拆钉器移除缝钉。每日监测动物，评估肿瘤大小及是否存在疼痛迹象，如体重减轻、行为异常和运动功能障碍。若动物肿瘤尺寸超过伦理允许上限或在肿瘤生长过程中表现出疼痛迹象，应实施安乐死。
4. 使用荧光成像和组织学验证肽段对肿瘤结合的特异性
- 肿瘤细胞接种后，需等待约4周以使肿瘤充分生长，再开始成像。在注射肽探针之前，使用活体小鼠在荧光成像仪上采集GFP荧光图像，以确认肿瘤的存在。
- 以每只小鼠10 nmol的剂量，通过尾静脉注射将Texas Red标记的肽注入荷瘤小鼠体内。
- 注射2小时后通过颈椎脱臼法处死小鼠，取出肿瘤及主要器官，并立即在荧光成像仪上进行成像。GFP使用绿色光滤光片（激发光：444–490 nm；发射光：515 nm长通滤光片；采集设置：500–720 nm，每10 nm一步），Texas Red使用红色光滤光片（激发光：576–621 nm；发射光：635 nm长通滤光片；采集设置：630–800 nm，每10 nm一步）。GFP曝光时间为10毫秒，Texas Red为150毫秒。
- 在完成整体组织荧光检测后，立即收集肿瘤组织，用甲醛固定，并冷冻切片至5-μm厚度。
- 用PBS冲洗后，滴加一滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片，并立即在共聚焦激光扫描显微镜下成像。
5. 磁共振成像（MRI）
- 肿瘤细胞接种后约4周，待肿瘤生长至直径0.3–0.6 cm。使用7 T磁共振成像（MRI）扫描仪配合射频容积线圈进行MRI研究。
- 将小鼠置于异氟烷诱导室中，用2%异氟烷-氧气混合气体进行麻醉。在小鼠眼部涂抹眼用软膏，以维持麻醉期间角膜的充分湿润。
- 将30号针头插入一段长1.0 m、充满肝素化生理盐水的导管中，将自制导管置入小鼠尾静脉。
- 将小鼠放入磁体中，并通过鼻罩持续给予1.5%异氟烷-氧气混合气体以维持吸入麻醉。
- 将连接至监测系统的呼吸传感器放置于小鼠腹部，以监测呼吸频率和深度。通过反馈控制系统向磁体内吹入热空气，维持小鼠体温在37 °C。
- 首先采用定位序列获取矢状面图像，以确定肿瘤位置（TR/TE = 200/3.7 msec，视野FOV = 3.0 cm，层厚 = 2.2 mm，层数 = 16，平均次数 = 2，翻转角 = 45°，矩阵 = 128 × 128）。
- 采用二维T1加权梯度回波脂肪抑制序列获取二维轴向图像用于对比增强MRI（CE-MRI）（TR/TE = 151.2/1.9 msec，FOV = 3.0 cm × 3.0 cm，层厚 = 1.2 mm，层数 = 12，平均次数 = 1，翻转角 = 80°，矩阵 = 128 × 128）。
- 在完成注射前基线MRI图像采集后，开始以0.03 mmol Gd/kg剂量推注靶向造影剂或对照造影剂，并用200 μl生理盐水冲洗。
- 继续在不同时间点采集CE-MRI图像，持续至30分钟。
6. 图像处理与分析
- 使用成像软件进行图像分析。
- 在二维成像平面上绘制整个肿瘤和肾脏的感兴趣区域（ROIs），并测量平均信号强度。
- 为定量分析对比增强磁共振成像（CE-MRI）数据，通过以下公式计算对比剂注射前后信噪比（SNR）的增加量，以获得肿瘤或肾脏的对比增强值（ΔSNR）：ΔSNR = (St/σt) - (S0/σ0)，其中 S0 和 St 分别表示对比剂注射前和注射后肿瘤或肾脏的信号强度，σ0 和 σt 分别表示对比剂注射前和注射后从背景空气中测得的噪声标准差。
- 采用双尾学生t检验计算 p 值，以 p<0.05 作为差异具有统计学意义的标准。
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结果
图1展示了靶向对比剂CLT1-dL-(Gd-DOTA)4的合成过程及实验的整体方案。CLT1-dL-(Gd-DOTA)4的弛豫率显著高于临床使用的Gd-DOTA（见表1）。在1.5 T磁场下，CLT1-dL-(Gd-DOTA)4在PBS（pH 7.4）中的每钆离子T1弛豫率约为Gd-DOTA的3倍10。Maestro成像证实了Texas Red标记的CLT1（CLT1-TR）在肿瘤组织中有强烈的特异性结合，而在正常器官和组织中结合极少；而非特异性的随机肽（sCLT1-TR）几乎不与肿瘤结合（图2）。图3显示了典型的注射前后T1加权对比增强（CE）图像。与非靶向的随机对照试剂相比，靶向试剂在肿瘤组织中产生更强且持续时间更长的增强效果。随时间推移，膀胱内的对比增强逐渐增加，表明对比剂主要通过肾小球滤过途径排泄。定量信号分析显示，靶向试剂在注射后30分钟内对肿瘤组织的信号增强显著优于对照试剂（p...
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讨论
关键步骤
选择合适的生物标志物和靶向小肽
要成功开发具有小尺寸的靶向对比剂，需要考虑两个关键点。首先，重要的是选择在病变组织中大量存在而在正常组织中极少存在的合适分子生物标志物。我们选定的与癌症相关的生物标志物——凝结的血浆蛋白，符合这一要求。其次，所选的靶向小分子试剂应对这些生物标志物具有高结合亲和力，以便足够数量的对比剂能够结合到靶点上，从而产生足够的对比增强效果。在本研究中，我们选择了CLT1凝块结合肽，该肽对肿瘤中凝结的血浆蛋白表现出强特异性结合11。
对比剂合成
多肽合成涉及将线性多肽分子中的两个巯基氧化，以形成最终的环状CLT1多肽。尽管多肽环化通常在低浓度溶液中进行，以尽量减少可能的聚集、二聚化和寡聚化，但树脂上环化可利用假稀释效应，并通过简单的洗涤和过滤去除试剂13。在我们的合成过程中，我们发现使...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分得到美国心脏协会 GRA Spring 09 博士后奖学金（09POST2250268）和美国国立卫生研究院 R01 CA097465 项目的支持。我们非常感谢 Wen Li 博士和 Vikas Gulani 博士在 MRI 方案测试与设置方面的帮助，以及 Yvonne Parker 女士在肿瘤植入实验中的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| Fmoc 保护的氨基酸 | EMD Chemicals 公司 | ||
| DOTA-tris(t-丁基 | TCI America | ||
| PyBOP，HOBt，HBTU | Nova Biochem | ||
| DIPEA，三氟乙酸铊(III)，TIS | Sigma-Aldrich 公司 | ||
| 德克萨斯红琥珀酰亚胺酯，单一异构体 | Invitrogen | T20175 | |
| <强>设备 | |||
| 安捷伦 1100 高效液相色谱系统 | 安捷伦 | ||
| ZORBAX 300SB-C18 PrepHT 色谱柱 | 安捷伦 | ||
| ICP-–S Optima 3100XL | Perkin-Elmer | ||
| 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 | Bruker | AutoflexTM Speed | |
| Maestro FLEX 活体成像系统 | 剑桥研究仪器公司 | ||
| Biospec 7T MRI 扫描仪 | Bruker |
参考文献
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