利用小分子CLT1肽靶向对比剂进行前列腺癌的MR分子成像

摘要

在小鼠前列腺癌模型中，利用靶向肿瘤间质中凝结的血浆蛋白的小肽类磁共振成像（MRI）对比剂，展示磁共振癌症分子成像技术。

摘要

肿瘤细胞外基质富含与癌症相关的蛋白质，这些蛋白质可作为癌症分子成像的生物标志物。在本研究中，我们展示了一种有效的磁共振（MR）癌症分子成像方法，采用一种小分子肽靶向的钆-DO3A单酰胺复合物作为靶向性MRI对比剂，特异性识别肿瘤间质中凝结的血浆蛋白。我们在小鼠原位PC-3前列腺癌模型中，开展了利用MRI无创检测前列腺肿瘤的实验，评估该对比剂的有效性。该靶向对比剂在低剂量（0.03 mmol Gd/kg）下即可产生显著的肿瘤对比增强效果。这种肽靶向的MRI对比剂在前列腺肿瘤的MR分子成像中具有良好的应用前景。

引言

有效成像癌症相关分子靶点对于提高癌症早期检测和诊断的准确性具有重要意义。磁共振成像（MRI）是一种强大的临床成像手段，具有高空间分辨率且无电离辐射¹。然而，目前尚无可用于临床的靶向MRI对比剂。创新设计和开发靶向MRI对比剂将极大推动磁共振癌症分子成像的应用。研究人员已投入大量努力，致力于开发用于成像癌细胞表面表达的生物标志物的靶向对比剂。由于MRI的灵敏度相对较低，且这些生物标志物的浓度较低，使用小分子靶向对比剂实现有效磁共振分子成像所需的足够对比增强仍具挑战性^2,3。为了获得足够的增强效果，已制备了多种递送系统，例如脂质体、纳米颗粒和高负载顺磁性Gd(III)螯合物的聚合物偶联物，以提高对比剂在靶部位的局部浓度^4,5。尽管这些递送系统在动物模型中能够产生显著的肿瘤增强效果，但其较大的尺寸导致体内清除缓慢且不完全，从而引起有毒Gd(III)离子的长期蓄积，可能带来严重的安全性问题⁶。最近一些研究表明，通过选择在病灶局部高表达的合适分子生物标志物，并使用可快速排泄的小分子试剂，有望克服MRI在分子成像方面的局限性^7,8。这类试剂的关键特征是靶向在病变组织中大量存在而在正常组织中极少表达的分子标志物。对比剂可高浓度结合于这些靶点，从而实现有效磁共振分子成像所需的足够对比增强。由于其分子尺寸小于肾滤过阈值，未结合的对比剂可迅速从体内排出，降低背景噪声。我们选择了一种普遍存在的癌症相关生物标志物——凝结的血浆蛋白，其在肿瘤间质中....

方案

方案改编自先前的研究¹¹。

1. CLT1 肽与 Gd-DOTA 的偶联

1. 采用标准固相肽合成法，以Fmoc保护的氨基酸在2-氯三苯甲基氯树脂（1.0 mmol）上合成CLT1肽（CGLIIQKNEC）。
2. 添加最后一个氨基酸后，在0 °C下用三氟乙酸铊(III)（1.09 g，2.0 mmol，2当量）的DMF溶液（20 ml）处理树脂上的线性肽，反应2小时，实现环化。
3. 随后，在树脂上依次将PEG和赖氨酸偶联至CLT1肽（1.0 mmol）的N端，依次与Fmoc-NH-PEG-COOH（3.0 mmol）、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH（3.0 mmol）以及第二批Fmoc-Lys(Fmoc)-OH（6 mmol）反应。
4. 用哌啶去除Fmoc保护基。加入DOTA-三(叔丁基酯)（4.58 g，8.0 mmol，每个氨基2当量），与树脂上赖氨酸树状结构产生的四个游离氨基反应，持续2小时。
5. 最后，用三氟乙酸、水和三异丁基硅烷（TIS）的混合液（20 ml，95/2.5/2.5）在室温下处理8小时，将产物从树脂上裂解并脱保护。过滤除去树脂，并用三氟乙酸（TFA）洗涤。将合并的滤液逐滴加入冰冷的乙醚（200 ml）中，离心后用乙醚洗涤4次。真空干燥得到无色固体（1.99 g，61%产率）。
6. 采用制备型高效液相色谱（HPLC）纯化粗产物，流动....

结果

图1展示了靶向对比剂CLT1-dL-(Gd-DOTA)₄的合成过程及实验的整体方案。CLT1-dL-(Gd-DOTA)₄的弛豫率显著高于临床使用的Gd-DOTA（见表1）。在1.5 T磁场下，CLT1-dL-(Gd-DOTA)₄在PBS（pH 7.4）中的每钆离子T₁弛豫率约为Gd-DOTA的3倍¹⁰。Maestro成像证实了Texas Red标记的CLT1（CLT1-TR）在肿瘤组织中有强烈的特异性结合，而在正常器官和组织中结合极少；而非特异性的随机肽（sCLT1-TR）几乎不与肿瘤结合（图2）。图3显示了典型的注射前后T₁加权对比增强（CE）图像。与非靶向的随机对照试剂相比，靶向试剂在肿瘤组织中产生更强且持续时间更长的增强效果。随时间推移，膀胱内的对比增强逐渐增加，表明对比剂主要通过肾小球滤过途径排泄。定量信号分析显示，靶向试剂在注射后30分钟内对肿瘤组织的信号增强显著优于对照试剂（p.......

讨论

关键步骤

选择合适的生物标志物和靶向小肽

要成功开发具有小尺寸的靶向对比剂，需要考虑两个关键点。首先，重要的是选择在病变组织中大量存在而在正常组织中极少存在的合适分子生物标志物。我们选定的与癌症相关的生物标志物——凝结的血浆蛋白，符合这一要求。其次，所选的靶向小分子试剂应对这些生物标志物具有高结合亲和力，以便足够数量的对比剂能够结合到靶点上，从而产生足够的对比增强效果。在本研究中，我们选择了CLT1凝块结合肽，该肽对肿瘤中凝结的血浆蛋白表现出强特异性结合¹¹。

对比剂合成

多肽合成涉及将线性多肽分子中的两个巯基氧化，以形成最终的环状CLT1多肽。尽管多肽环化通常在低浓度溶液中进行，以尽量减少可能的聚集、二聚化和寡聚化，但树脂上环化可利用假稀释效应，并通过简单的洗涤和过滤去除试剂¹³。在我们的合成过程中，我们发现使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
Fmoc 保护的氨基酸	EMD Chemicals 公司
DOTA-tris(t-丁基	TCI America
PyBOP，HOBt，HBTU	Nova Biochem
DIPEA，三氟乙酸铊(III)，TIS	Sigma-Aldrich 公司
德克萨斯红琥珀酰亚胺酯，单一异构体	Invitrogen	T20175
<强>设备
安捷伦 1100 高效液相色谱系统	安捷伦
ZORBAX 300SB-C18 PrepHT 色谱柱	安捷伦
ICP-–S Optima 3100XL	Perkin-Elmer
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪	Bruker	AutoflexTM Speed
Maestro FLEX 活体成像系统	剑桥研究仪器公司
Biospec 7T MRI 扫描仪	Bruker