我们介绍了压缩激素颗粒的制备方法以及将其通过皮下手术植入小鼠体内的操作。该策略可与将细胞和组织异种移植物在无胸腺裸鼠肾包膜下进行移植相结合，用于评估激素诱导的致癌作用及良性前列腺增生的调控机制。
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本文内容
摘要
摘要
两种常见前列腺疾病——前列腺癌（PrCa）和良性前列腺增生（BPH）的新疗法，在很大程度上依赖于评估其激素调控机制的实验。性类固醇激素（特别是雄激素和雌激素）在PrCa和BPH中具有重要作用；我们通过在小鼠体内植入压缩激素颗粒的实验，探究这些激素在诱导前列腺生长和癌变过程中的各自作用。激素或药物颗粒可使用压片机轻松制备，并通过手术植入雄性小鼠的皮下组织。我们还描述了一种评估激素诱导癌变的方案，即将皮下植入激素颗粒与前列腺细胞重组物移植至免疫缺陷小鼠肾包膜下相结合。此外，将皮下激素颗粒植入与BPH组织肾包膜下异种移植相结合，有助于更深入理解良性前列腺增生的激素调控机制，并可用于测试靶向性类固醇激素通路的新疗法。
引言
前列腺癌（PrCa）和良性前列腺增生（BPH）是重要的健康负担。PrCa是男性中第二常见的实体器官肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一1。BPH在老年男性中同样高度普遍，据估计，BPH的临床表现——下尿路症状（LUTS）——将影响50%至90%的男性2。尽管已知雄激素和雌激素在PrCa和BPH中具有重要作用，但我们对致癌和生长过程中潜在激素机制的理解仍不完善3,4。简单且遗传上易于操作的动物模型构成了前列腺研究中解决这些重点问题的基础。在PrCa和BPH等激素响应性疾病研究中，采用皮下植入缓释激素丸的方法，单独或联合将细胞、组织或器官通过肾包膜异种移植（即从一个物种移植到另一物种）至免疫缺陷小鼠宿主体内，为研究激素对生长和致癌过程的调控提供了一种简单且可重复的实验方法。
皮下激素颗粒植入是一种简单且可重复的技术，用于研究激素对前列腺癌变及良性增生的调控作用5。在成年雄性小鼠皮下植入含25 mg睾酮（T）和2.5 mg 17β-雌二醇（E2）的颗粒，可导致血清E2水平升高，T水平逐渐下降，从而模拟老年男性的动态激素环境5,6。此外，该模型还能重现良性前列腺增生相关下尿路症状（BPH-LUTS）的多种临床特征5,7。其他激素给药方法包括口服/灌胃给药或腹腔注射，这些方法会对啮齿类动物造成应激，且在给药剂量的....
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方案
1. 压缩激素/药物小丸的制备
- 此操作应在穿戴实验服、手套、口罩、护目镜和头罩的情况下，在化学安全通风橱中进行。为防止交叉污染，必须在每种类型 pellet 制备前后，使用 70% 乙醇对 pellet 制备设备进行彻底清洁。
- 使用分析天平和称量纸，称取所需量的激素/药物粉末。建议多准备约 5% 的材料，以补偿压片过程中的损耗。
- 某些激素/药物需要添加粘合剂或填充剂，应在 pellet 制备前将其混合。例如，制备 2.5 mg 的 17β-雌二醇 pellet 时，需将该激素与 22.5 mg 胆固醇混合，最终形成 25 mg 的 pellet。
- 小心将混合物转移至模具组件中，置于压片机下，用力下压手柄以压缩成 pellet。应使用一致的压力，以保持恒定的表面积与体积比。
- 随后翻转模具夹持器，再次下压手柄以释放 pellet。
- 检查 pellet 的完整性，并确认最终质量是否在目标范围内。可接受的范围为最终质量的 ±5%（例如，25 mg pellet 的可接受范围为 23.8–26.3 mg）。
- pellet 可在手术前预先制备并储存（储存条件和时长取决于所用激素或药物的稳定性）。也可选择直接购买激素 pellet 以替代自行制备。购买 commercial 制剂可避免使用非药用级药物，因其已由专业机构进行配方和配制。
2....
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结果
根据待验证的假设，可单独进行组织或细胞复合物的肾包膜异种移植，也可将其与皮下激素缓释丸植入相结合。图1展示了一项假设实验的设计示意图，该实验结合了肾包膜异种移植与皮下激素缓释丸植入。在使用压片机制备压缩丸剂时，可采用多种粉末状和/或结晶状物质。图2显示了25 mg、12 mg和6 mg的压缩激素缓释丸。
图3展示了手术过程中所用火焰抛光玻璃移液管的一个示例。将玻璃巴斯德移液管多次通过本生灯火焰，可使尖端熔融变圆，形成火焰抛光的圆润尖端，用于在肾包膜下创建移植物植入腔隙，并在肾包膜下操作移植物。
如图4所示，在模拟男性人体激素环境的条件下（通过外源性睾酮补充，25 mg皮下缓释丸剂），来自良性前列腺增生（BPH）患者的原代组织异种移植存活良好，且组织结构得以保留（图4A）。同样如图4所示，肾包膜下移植可用于评估激素诱导的致癌过程.......
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讨论
本文及其中所述方案描述了压缩激素和/或药物颗粒的制备方法，以及小鼠皮下颗粒植入的手术操作。根据所要解决的研究问题，该技术可单独使用，也可与肾包膜下异种移植前列腺细胞重组移植物或前列腺组织异种移植物的技术联合使用，后者在前列腺研究中已被广泛应用17-19。综合来看，这些技术为研究激素诱导的致癌过程以及人和小鼠前列腺中良性生长的调控机制提供了强有力的手段。
颗粒制备操作简便，易于重复，且所需设备有限。该方法可应用于多种激素和药物制剂。此操作必须在化学安全通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备。在评估前列腺癌发生及诱导小鼠膀胱出口梗阻的实验中，我们使用25 mg T和2.5 mg E2 5,7,15这些剂量的选择是因为它们能够产生所需的 体内 反应，并且因为它们能产生与患有目标疾病过程的人类男性生理相关的血清激素水平 6. 压片模具可用于制备多种不同规格的药丸；我们通常使用25 mg的药丸来评估致癌作用及良性生长。药丸规格的选择取决于拟验证的假设、所需效应的产生、目标循环浓度的达到以.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨向Ricke实验室所有过去和现在的成员致以感谢。我们感谢Calvin Patten, Jr., DVM和Brigitte Raabe, DVM对本实验方案提出的宝贵意见。我们感谢美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）、国家癌症研究所（NCI）和国家环境卫生科学研究所（NIEHS）对本研究提供的经费支持：R01DK093690、R01CA123199、RC2ESO18764。TMN是罗切斯特大学由NIH T32 GM07356资助的医学科学家培训项目学员；本项目还获得NIH下设的Ruth L. Kirschstein国家研究服务奖F30DK093173的支持。CDV由威斯康星大学麦迪逊分校的T32CA157322项目支持，ABT由T32ES007015项目支持。本内容的解释和表述完全由作者负责，不代表美国普通医学科学研究所或NIH的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 压片机 | PARR Industries | 2815 | 3毫米打孔器 &冲压模具组 |
| 分析天平 | Ohaus | 1918302 | Voyager 或其他 |
| 本生灯 | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| 解剖显微镜 | 徕卡 | L2 | |
| Deltaphase 保温垫套装（可重复加热蜡垫） | 布雷因特里科学公司 | 39DP | 电热垫的替代品 |
| 热珠灭菌器 | F.S.T. | 18000-45 | |
| 异氟烷蒸发器 | Supera 麻醉创新 | VAP3000 | |
| 诱导室 | Supera麻醉创新 | RES644 | |
| F/AIR 罐体 | Supera麻醉创新 | 80120 | |
| 4 通阀多通管 | Supera 麻醉创新 | RES536 | |
| 重复呼吸回路 | Supera麻醉创新 | CIR529 | |
| 入口/出口接头 | Supera 麻醉创新 | VAP203/4 | |
| 压力调节器/压力表 | Supera 麻醉创新 | OXY508 | |
| 氧气流量计 | Supera麻醉创新 | OXY660 | |
| 21毫米透明管 | Supera 麻醉创新 | 301-150 | |
| 小型小鼠鼻罩 | Supera 麻醉创新 | ACC526 | |
| 无菌手术衣 | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| 外科口罩 | 中西部兽医供应公司 | 350.50111.2 | 双层带耳挂 |
| 无菌纱布 | 中西部兽医供应公司 | 001.14100.2 | 2 英寸 × 2 英寸 |
| 无菌手套 | Kimberly Clark | 55092 | |
| 圆顶帽 | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| 棉签 | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| 外科洗手液 | 中西部兽医供应公司 | 733.80010.3 | |
| 无菌敷料（带孔） | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| <强>试剂 | |||
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| 丙酸睾酮 | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| 异氟烷 | 中西部兽医供应公司 | 193.33161.3 | |
| 卡洛芬 | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | 注射用（Rimadyl） |
| 聚维酮碘 | 韦伯斯特兽医 | 07-836-3379 | |
| 无菌生理盐水 | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | 0.9% 氯化钠注射液 |
| <强>外科手术器械 | |||
| 直型锐/钝剪刀 | 精细科学工具（F.S.T.） | 14054-13 | |
| 格劳费镊子（带齿、带锯齿、弯型） | F.S.T. | 11055-10 | |
| 精细虹膜剪 | F.S.T. | 14090-09 | |
| 格劳费手术刀 | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 镊子 | F.S.T. | 11251-20 | |
| 巴斯德玻璃吸管 | Fisher Scientific | S67050 | 5" 长度 |
| 格劳费镊子（带齿、弯型） | F.S.T. | 11052-10 | |
| 格拉夫镊子（带齿，直型） | F.S.T. | 11050-10 | |
| 薇乔缝线 | 中西部兽医供应公司 | 295-92100.2 | 4-0，FS-2，可吸收 |
| 带剪刀式功能的持针器 | F.S.T. | 12002012 | |
| 伤口夹 | Braintree Scientific | 美国化学会化学科学 | 可使用7 mm或9 mm的夹子 |
| 反射式伤口剪钳 | F.S.T. | 12031-09 | 与伤口夹尺寸匹配 |
| Would 去除夹 | F.S.T. | 12033-00 | 通用的 |
| 灭菌容器 | F.S.T. | 20810-01 | 任何可高压灭菌的容器均可使用 |
| 带针头的注射器 | BD | 148292C | 1毫升，25G×1 |
| 耳标钳 | 国家带标公司 | 1005s1 | 替代耳缘打孔法 |
| 小型动物耳标 | 国家带和标签公司 | 1005-1 |
参考文献
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A.
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重印与许可
