我们介绍了压缩激素颗粒的制备方法以及将其通过皮下手术植入小鼠体内的操作。该策略可与将细胞和组织异种移植物在无胸腺裸鼠肾包膜下进行移植相结合，用于评估激素诱导的致癌作用及良性前列腺增生的调控机制。
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摘要
摘要
两种常见前列腺疾病——前列腺癌（PrCa）和良性前列腺增生（BPH）的新疗法，在很大程度上依赖于评估其激素调控机制的实验。性类固醇激素（特别是雄激素和雌激素）在PrCa和BPH中具有重要作用；我们通过在小鼠体内植入压缩激素颗粒的实验，探究这些激素在诱导前列腺生长和癌变过程中的各自作用。激素或药物颗粒可使用压片机轻松制备，并通过手术植入雄性小鼠的皮下组织。我们还描述了一种评估激素诱导癌变的方案，即将皮下植入激素颗粒与前列腺细胞重组物移植至免疫缺陷小鼠肾包膜下相结合。此外，将皮下激素颗粒植入与BPH组织肾包膜下异种移植相结合，有助于更深入理解良性前列腺增生的激素调控机制，并可用于测试靶向性类固醇激素通路的新疗法。
引言
前列腺癌（PrCa）和良性前列腺增生（BPH）是重要的健康负担。PrCa是男性中第二常见的实体器官肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一1。BPH在老年男性中同样高度普遍，据估计，BPH的临床表现——下尿路症状（LUTS）——将影响50%至90%的男性2。尽管已知雄激素和雌激素在PrCa和BPH中具有重要作用，但我们对致癌和生长过程中潜在激素机制的理解仍不完善3,4。简单且遗传上易于操作的动物模型构成了前列腺研究中解决这些重点问题的基础。在PrCa和BPH等激素响应性疾病研究中，采用皮下植入缓释激素丸的方法，单独或联合将细胞、组织或器官通过肾包膜异种移植（即从一个物种移植到另一物种）至免疫缺陷小鼠宿主体内，为研究激素对生长和致癌过程的调控提供了一种简单且可重复的实验方法。
皮下激素颗粒植入是一种简单且可重复的技术，用于研究激素对前列腺癌变及良性增生的调控作用5。在成年雄性小鼠皮下植入含25 mg睾酮（T）和2.5 mg 17β-雌二醇（E2）的颗粒，可导致血清E2水平升高，T水平逐渐下降，从而模拟老年男性的动态激素环境5,6。此外，该模型还能重现良性前列腺增生相关下尿路症状（BPH-LUTS）的多种临床特征5,7。其他激素给药方法包括口服/灌胃给药或腹腔注射，这些方法会对啮齿类动物造成应激，且在给药剂量的一致性上较差，同时比一次性手术植入更为耗时耗力。其他皮下激素和/或药物递送方式包括Silastic胶囊8。尽管我们也曾使用Silastic胶囊，但压缩颗粒因其操作简便和可重复性更优而更受青睐。此外，压缩激素颗粒的释放速率更能模拟老年男性体内观察到的动态性类固醇激素比例5,7。
自从基因免疫缺陷小鼠问世以来，已有大量 体内 结合异种移植技术的模型系统已被开发用于研究多种正常及病变组织。异种移植主要分为几类基本类型。组织异种移植包含一小块完整的组织，该组织可以是正常结构、恶性肿瘤或良性增生。Szot 等 (2007) 最近阐明了胰岛的肾包膜异种移植技术 9. Aamdal 等 (1985)报道了将27种人癌细胞系移植至免疫缺陷小鼠肾包膜下的异种移植模型 10移植物也可由单一的永生化细胞系（癌性或非致瘤性）构成，或由永生化细胞系与从间充质中分离的细胞组合而成（细胞重组移植物）。
我们倾向于采用细胞重组异种移植，以探究间质和上皮在前列腺癌（PrCa）和良性前列腺增生（BPH）发育过程中各自的作用。Cunha et al.（1980）首次报道，当将成年小鼠膀胱上皮与胚胎期泌尿生殖窦间质（UGM）结合，并移植至雄性小鼠宿主的肾包膜下时，该组织可发育形成类似前列腺腺泡的结构11。Norman et al.（1986）表明，成年小鼠前列腺导管上皮与UGM在组织重组体中结合后，可发生导管生长和分支形态发生12。Hayward et al.（1988）发现，人类前列腺上皮在诱导性胎儿间质的作用下表现出类似反应13。Wang et al.（2001）首次报道了一种通过将永生化的人类前列腺上皮细胞系BPH-1与UGM结合建立的前列腺致癌激素模型14，该模型已在我们的实验室中被广泛使用15。此模型非常适合用于研究PrCa的进展过程，因为良性前列腺上皮可转化为转移性疾病，从而模拟人类的晚期PrCa5。由于可对特定组分进行遗传操作，细胞重组移植法在评估间质-上皮相互作用方面具有独特优势。
其他适合异种移植的部位包括皮内、皮下和原位位置16。根据所关注的组织和疾病过程，这些部位可能是合适的替代方案。在研究前列腺激素诱导的癌变及良性生长调控时，我们选择肾包膜部位进行异种移植，因其移植物存活率较高、血液供应丰富，并且能够在有限的空间内植入更多数量的移植物16。此外，宿主小鼠的激素干预可能导致前列腺萎缩，从而限制了前列腺原位移植的应用16。
本方案概述了压缩激素/药物颗粒的制备与手术植入技术，以及人前列腺细胞和组织移植物的肾包膜异种移植方法。这些技术相结合，可提供一种灵敏的检测手段，用于确定经基因改造的小鼠是否比对照品系更容易发生前列腺癌（PrCa）和/或良性前列腺增生（BPH）的起始。异种移植是一种强大的技术，用于 体内 评估实验细胞发展为恶性肿瘤组织学和分子特征的潜力，以及针对多种良性和恶性疾病的新型治疗策略的检测方法。
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方案
1. 压缩激素/药物小丸的制备
- 此操作应在穿戴实验服、手套、口罩、护目镜和头罩的情况下，在化学安全通风橱中进行。为防止交叉污染，必须在每种类型 pellet 制备前后，使用 70% 乙醇对 pellet 制备设备进行彻底清洁。
- 使用分析天平和称量纸，称取所需量的激素/药物粉末。建议多准备约 5% 的材料，以补偿压片过程中的损耗。
- 某些激素/药物需要添加粘合剂或填充剂，应在 pellet 制备前将其混合。例如，制备 2.5 mg 的 17β-雌二醇 pellet 时，需将该激素与 22.5 mg 胆固醇混合，最终形成 25 mg 的 pellet。
- 小心将混合物转移至模具组件中，置于压片机下，用力下压手柄以压缩成 pellet。应使用一致的压力，以保持恒定的表面积与体积比。
- 随后翻转模具夹持器，再次下压手柄以释放 pellet。
- 检查 pellet 的完整性，并确认最终质量是否在目标范围内。可接受的范围为最终质量的 ±5%（例如，25 mg pellet 的可接受范围为 23.8–26.3 mg）。
- pellet 可在手术前预先制备并储存（储存条件和时长取决于所用激素或药物的稳定性）。也可选择直接购买激素 pellet 以替代自行制备。购买 commercial 制剂可避免使用非药用级药物，因其已由专业机构进行配方和配制。
2. 细胞重组异种移植物的制备
- 收获并培养原代小鼠泌尿生殖道间充质（UGM）基质细胞，培养时间不超过4周，随后收集用于计数。
- 按照常规方法培养永生化前列腺上皮细胞系，并收集用于计数。本示例中，通过将每份移植物含100,000个BPH-1上皮细胞与每份移植物含250,000个UGM基质细胞在悬浮液中混合，制备细胞重组移植物。
- 将细胞共同离心沉淀后，重悬于足量的中和型Ⅰ型大鼠尾胶原蛋白中，制备所需数量的移植物，每份体积为25 μl至50 μl。
- 将重组移植物置于37 °C环境中15分钟，然后加入生长培养基覆盖，于37 °C下保存，最长可保存48小时，之后进行移植。
3. 组织异种移植物的制备
- 在组织获取和手术过程中，须采取针对血源性病原体的普遍防护措施。在获得机构审查委员会批准并取得知情同意后，从手术切除中获取新鲜前列腺组织。对于良性前列腺增生（BPH）生长的研究，组织可来源于经尿道前列腺切除术或单纯性前列腺切除术。前列腺癌（PrCa）或良性前列腺组织的原代异种移植样本可取自根治性前列腺切除术标本。
- 将获取的组织置于冰上保存于等渗缓冲细胞培养基或生理盐水中。根据组织类型和保存条件，标本可在制备组织移植物前保存最多24小时。常规做法是将标本分为三部分：一部分用福尔马林固定并常规处理用于组织学检查，一部分迅速冷冻用于分子分析，另一部分进一步分割为大小为1–3 mm的组织异种移植物。
4. 火磨玻璃移液管的制备
- 佩戴护目镜、实验服和耐热手套，将玻璃巴斯德吸管尖端以约60°角放入本生灯火焰中开始操作。
- 持续轻微移动吸管，以避免局部过热。
- 将尖端拉细，并进行火焰抛光，目标是形成略微弯曲、末端圆润且封闭的尖端。
5. 器械和手术室的准备
- 对所有器械进行高压灭菌。手术前检查所有器械，注意保持无菌区域。
- 设置无菌手术区域，配备吸水垫、解剖显微镜、麻醉鼻罩、手术器械以及朝向操作区域的加热灯。为在小鼠间消毒工具，需提前预热干热灭菌珠器。
- 组装并测试麻醉装置；称量废气清除装置的重量。
- 使用微波炉以70-80%功率加热蜡垫，每次加热1分钟，共加热不超过5分钟，每次加热后需揉捏蜡垫，使已熔化和未熔化的蜡充分混合，直至蜡完全均匀熔化。用手触摸确认蜡垫温度不过热，然后将其置于空的啮齿类动物恢复笼下方。
- 穿戴啮齿类动物手术所需的个人防护装备，包括外科口罩、头帽、手套和手术服。
6. 手术步骤：肾包膜异种移植
- 涉及实验动物的所有操作均应经机构动物护理与使用委员会批准。在实施麻醉前，应观察小鼠以确保其健康状况良好。
- 将小鼠放入异氟烷麻醉诱导舱中，浓度设为 3-5%。当动物停止活动且呼吸频率降低时，将其转移至鼻罩，并以俯卧位维持 1-3% 的麻醉浓度。
- 如有必要，使用电推剪剃除小鼠背部毛发。使用裸鼠（athymic nude, nu/nu）时无需剃毛。
- 对伸展的后肢脚蹼施加稳固压力，以评估麻醉深度。若小鼠对压力有反应，则需延长麻醉起效时间。必要时可轻微调整麻醉气体流量，以达到充分麻醉状态。
- 当小鼠达到充分麻醉后，用外科碘伏（如 Betadine）溶液对术区进行消毒，随后使用 70% 酒精脱碘。
- 穿戴无菌手套和手术衣；在手术区域覆盖无菌手术单。用有齿镊提起背部皮肤，使用粗剪刀沿背侧中线做 2-3 cm 的切口。
- 使用钝头剪刀或探针，将切口下方的真皮层与体壁分离（双侧移植时在切口两侧均分离，单侧移植时仅分离一侧）。
- 将小鼠重新置于侧卧位，通过肌肉壁观察肾脏轮廓以定位肾脏。用拇指和食指在腹部施加轻柔的手动压力，有助于可视化内部器官。
- 使用精细虹膜剪刀，注意避开主要血管和脊神经，沿脊柱方向在体壁上做 1 cm 长的切口。将剪刀插入初始切口后，轻轻张开至更宽幅度，将切口扩大至 1.5-2.0 cm（略长于肾脏长轴）。
- 用食指和拇指在肾脏两侧的肌壁外施加轻柔压力，使肾脏外置。将皮肤边缘折叠至外置肾脏下方，使其自然置于体壁之上。在肾脏外置期间，应持续滴加无菌生理盐水以保持肾包膜湿润。
- 使用精细 #5 镊子轻轻提起肾包膜，使其与肾实质分离，再用精细手术刀在包膜上做 2-4 mm 的切口。切口大小应根据移植物尺寸确定，但应尽量减小以维持包膜完整性。
- 将已拉细并经火焰抛光、末端圆钝封闭的玻璃巴斯德移液管，在肾包膜下沿肾表面切线方向小心插入。轻柔地撑开形成一个小的包膜下腔隙用于植入移植物，操作中须格外注意避免损伤肾实质。
- 用精细镊子提起肾包膜切缘，利用火焰抛光的玻璃移液管将移植物插入包膜下的腔隙中。可在肾表面的包膜下放置多个移植物，并均匀分布。
- 若在移植过程中包膜出现脱水现象，应通过滴加无菌生理盐水使其保持湿润。
- 移植完成后，轻柔提起肌壁切口两侧，将肾脏复位回体腔内。注意观察移植物是否从包膜下脱出。
- 使用单针缝合（4-0，FS-2 Vicryl 缝线）关闭肌壁。可通过调整小鼠体位，在对侧肾脏重复上述手术操作。
- 移植完成后，可在同一手术过程中进行皮下缓释 pellet 植入（参见方案步骤 7）。
- 使用有齿镊对齐皮肤切口边缘，用 2-3 枚外科伤口夹闭合切口。给予镇痛处理（我们采用皮下注射 5-10 mg/kg 卡洛芬），并将小鼠置于恢复笼中侧卧。使用加热灯或加热垫维持体温。密切观察直至小鼠完全苏醒，通常应在 15 分钟内完成恢复。
- 术后 24 小时内应持续观察小鼠是否出现术后疼痛、出血或其他并发症迹象。定期检查手术切口是否有感染征象。
- 术后 7-14 天使用专用外科伤口夹去除装置拆除伤口夹。
7. 手术步骤：皮下颗粒植入
- 重复肾包膜异种移植手术步骤6.1-6.5。
- 用皮肤镊提起背部皮肤，使用粗剪刀做一条1-2厘米的背侧中线切口。
- 使用钝头剪刀或探针，将下方真皮层从体壁向头侧方向分离。
- 用皮肤镊轻轻提起皮肤切口的头侧部分，用直齿镊轻轻夹住激素丸，将其插入颈背部皮下 pockets（由钝头探针分离形成），然后释放。
- 重复肾包膜异种移植手术步骤6.18-6.20。若仅进行皮下丸剂植入，则使用1枚外科伤口夹闭合手术切口。
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结果
根据待验证的假设，可单独进行组织或细胞复合物的肾包膜异种移植，也可将其与皮下激素缓释丸植入相结合。图1展示了一项假设实验的设计示意图，该实验结合了肾包膜异种移植与皮下激素缓释丸植入。在使用压片机制备压缩丸剂时，可采用多种粉末状和/或结晶状物质。图2显示了25 mg、12 mg和6 mg的压缩激素缓释丸。
图3展示了手术过程中所用火焰抛光玻璃移液管的一个示例。将玻璃巴斯德移液管多次通过本生灯火焰，可使尖端熔融变圆，形成火焰抛光的圆润尖端，用于在肾包膜下创建移植物植入腔隙，并在肾包膜下操作移植物。
如图4所示，在模拟男性人体激素环境的条件下（通过外源性睾酮补充，25 mg皮下缓释丸剂），来自良性前列腺增生（BPH）患者的原代组织异种移植存活良好，且组织结构得以保留（图4A）。同样如图4所示，肾包膜下移植可用于评估激素诱导的致癌过程...
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讨论
本文及其中所述方案描述了压缩激素和/或药物颗粒的制备方法，以及小鼠皮下颗粒植入的手术操作。根据所要解决的研究问题，该技术可单独使用，也可与肾包膜下异种移植前列腺细胞重组移植物或前列腺组织异种移植物的技术联合使用，后者在前列腺研究中已被广泛应用17-19。综合来看，这些技术为研究激素诱导的致癌过程以及人和小鼠前列腺中良性生长的调控机制提供了强有力的手段。
颗粒制备操作简便，易于重复，且所需设备有限。该方法可应用于多种激素和药物制剂。此操作必须在化学安全通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备。在评估前列腺癌发生及诱导小鼠膀胱出口梗阻的实验中，我们使用25 mg T和2.5 mg E2 5,7,15这些剂量的选择是因为它们能够产生所需的 体内 反应，并且因为它们能产生与患有目标疾病过程的人类男性生理相关的血清激素水平 6. 压片模具可用于制备多种不同规格的药丸；我们通常使用25 mg的药丸来评估致癌作用及良性生长。药丸规格的选择取决于拟验证的假设、所需效应的产生、目标循环浓度的达到以...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨向Ricke实验室所有过去和现在的成员致以感谢。我们感谢Calvin Patten, Jr., DVM和Brigitte Raabe, DVM对本实验方案提出的宝贵意见。我们感谢美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）、国家癌症研究所（NCI）和国家环境卫生科学研究所（NIEHS）对本研究提供的经费支持：R01DK093690、R01CA123199、RC2ESO18764。TMN是罗切斯特大学由NIH T32 GM07356资助的医学科学家培训项目学员；本项目还获得NIH下设的Ruth L. Kirschstein国家研究服务奖F30DK093173的支持。CDV由威斯康星大学麦迪逊分校的T32CA157322项目支持，ABT由T32ES007015项目支持。本内容的解释和表述完全由作者负责，不代表美国普通医学科学研究所或NIH的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 压片机 | PARR Industries | 2815 | 3毫米打孔器 &冲压模具组 |
| 分析天平 | Ohaus | 1918302 | Voyager 或其他 |
| 本生灯 | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| 解剖显微镜 | 徕卡 | L2 | |
| Deltaphase 保温垫套装（可重复加热蜡垫） | 布雷因特里科学公司 | 39DP | 电热垫的替代品 |
| 热珠灭菌器 | F.S.T. | 18000-45 | |
| 异氟烷蒸发器 | Supera 麻醉创新 | VAP3000 | |
| 诱导室 | Supera麻醉创新 | RES644 | |
| F/AIR 罐体 | Supera麻醉创新 | 80120 | |
| 4 通阀多通管 | Supera 麻醉创新 | RES536 | |
| 重复呼吸回路 | Supera麻醉创新 | CIR529 | |
| 入口/出口接头 | Supera 麻醉创新 | VAP203/4 | |
| 压力调节器/压力表 | Supera 麻醉创新 | OXY508 | |
| 氧气流量计 | Supera麻醉创新 | OXY660 | |
| 21毫米透明管 | Supera 麻醉创新 | 301-150 | |
| 小型小鼠鼻罩 | Supera 麻醉创新 | ACC526 | |
| 无菌手术衣 | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| 外科口罩 | 中西部兽医供应公司 | 350.50111.2 | 双层带耳挂 |
| 无菌纱布 | 中西部兽医供应公司 | 001.14100.2 | 2 英寸 × 2 英寸 |
| 无菌手套 | Kimberly Clark | 55092 | |
| 圆顶帽 | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| 棉签 | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| 外科洗手液 | 中西部兽医供应公司 | 733.80010.3 | |
| 无菌敷料（带孔） | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| <强>试剂 | |||
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| 丙酸睾酮 | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| 异氟烷 | 中西部兽医供应公司 | 193.33161.3 | |
| 卡洛芬 | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | 注射用（Rimadyl） |
| 聚维酮碘 | 韦伯斯特兽医 | 07-836-3379 | |
| 无菌生理盐水 | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | 0.9% 氯化钠注射液 |
| <强>外科手术器械 | |||
| 直型锐/钝剪刀 | 精细科学工具（F.S.T.） | 14054-13 | |
| 格劳费镊子（带齿、带锯齿、弯型） | F.S.T. | 11055-10 | |
| 精细虹膜剪 | F.S.T. | 14090-09 | |
| 格劳费手术刀 | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 镊子 | F.S.T. | 11251-20 | |
| 巴斯德玻璃吸管 | Fisher Scientific | S67050 | 5" 长度 |
| 格劳费镊子（带齿、弯型） | F.S.T. | 11052-10 | |
| 格拉夫镊子（带齿，直型） | F.S.T. | 11050-10 | |
| 薇乔缝线 | 中西部兽医供应公司 | 295-92100.2 | 4-0，FS-2，可吸收 |
| 带剪刀式功能的持针器 | F.S.T. | 12002012 | |
| 伤口夹 | Braintree Scientific | 美国化学会化学科学 | 可使用7 mm或9 mm的夹子 |
| 反射式伤口剪钳 | F.S.T. | 12031-09 | 与伤口夹尺寸匹配 |
| Would 去除夹 | F.S.T. | 12033-00 | 通用的 |
| 灭菌容器 | F.S.T. | 20810-01 | 任何可高压灭菌的容器均可使用 |
| 带针头的注射器 | BD | 148292C | 1毫升，25G×1 |
| 耳标钳 | 国家带标公司 | 1005s1 | 替代耳缘打孔法 |
| 小型动物耳标 | 国家带和标签公司 | 1005-1 |
参考文献
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