试验样品为优化风暴超高分辨率显微镜

Summary

我们描述了制备3个试样，以及如何可以被用来优化和评估STORM显微镜的性能。使用这些例子中，我们展示了如何获取原始数据，然后进行处理，以获得超分辨率图像约30​​-50 nm分辨率的细胞。

Abstract

暴风影音是比标准的荧光显微镜技术更好的分辨率高达10倍最近开发的超分辨率显微镜技术。然而，由于图像被获取以非常不同的方式比正常的，通过建立一个图像分子通过分子中，有在试图优化其图像采集的用户一些显著挑战。为了帮助这一进程，并获得更多的深入了解，暴风影音的工作，我们提出了3编制试验样品和采集和处理风暴30-50纳米之间的典型分辨率超分辨率图像的方法。通过将试验样品与使用免费提供的暴雨处理软件也能够获得大量的关于图像质量和分辨率的信息。使用这些度量它然后就可以从光学优化成像过程中，样品制备，染料的选择，缓冲液条件，以及图像获取设置。我们一那会导致图像质量差一些共同的问题，如横向漂移，其中图像获取和密度在样品移动有关，导致了"错误定位"现象的问题LSO显示的例子。

Introduction

最近已经开发出了一系列光学显微技术，通常被称为超高分辨率显微镜或纳米显微，这可绕过衍射极限，并具有100nm或更^1,2分辨率生成图像。由于超分辨率显微镜公布，因为这是一年中自然 - 方法学方法在2008年，出现了大量的本土化为基础的显微镜发展。例如，有多种颜色的应用程序^3-6，3D实现^7-12，甚至活细胞的应用^5,13-17。此外，由于这些系统都被商业化，现在使他们的出路光学实验室进入细胞生物学家手中有可能是生物医学问题进一步增加他们的使用和应用。

该家族中的一个分支是通过建立一个图像分子通过分子工作的定位为基础的方法。我n阶做到这一点，大部分样品中的荧光分子必须被关闭，因此，只有少数的空间上分离的分子是活性在任何一个时间。这些分子然后被迅速接通和断开与许多图像的拍摄，使人口的显著部分成象，以反映下层结构与子衍射精度。许多方法已经公布，包括GSDIM ^{18，PALM 19，FPALM 20，STORM 21}和RESOLFT ^22。用于测量一个单分子检测的位置的算法可以被用于定位该分子的实际位置与精度比使用高斯拟合²³ 20毫微米较好，例如rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ²⁶ palm3d ¹²和暴雨^27。当成像细胞或其它生物样品，其具有高的分子密度，因此，有必要采取几千帧的这个闪烁，在空间上分离，信号以图像的标记的分子的显著比例。

随机光学重构显微术（STORM）和高度相关dSTORM和GSDIM方法是定位为基础的超分辨率的方法，这已被证明与市售的有机染料²¹的工作。此后，他们被证明是适用于许多不同的染料^28-30，这使得由于特异性和完善的免疫标记的方法来进行荧光显微镜相对方便的方法特别有吸引力。因此，人们很容易获得各种染料抗体和染料生物分子结合物，它在本地化为基础的超分辨率成像中使用的潜力。虽然暴风影音和类似方法的一般原理也比较简单，和一见钟情的硬件和样品制备看起来比较STRAightforward，有许多的过程步骤，这是实现高品质，无瑕疵的，超分辨率图像的关键。

如同所有的显微镜技术的方法可以在3个主要步骤被认为是:首先，样品制备，第二，图像采集和第三，图像处理和/或图像分析和解释。额外的解析力和产生超分辨率图像使用本地化为基础的方法的方法，引入了一些新的问题和注意事项^31-33。与样品制备开始，进行免疫标记，尤其是间接免疫荧光法，其中初级和次级抗体组合使用时，应该指出的是，荧光染料可高达20nm的远离感兴趣的分子。在微管的情况下，这将导致在直径为35-50纳米，具有25纳米^28,30的预期的微管的直径相比较。此外，该标记密度应该米EET奈奎斯特准则，以便产生高质量的图象^14。例如为20纳米沿丝状结构的预期的图像分辨率应该有一个染料分子至少每10纳米^27。虽然许多染料已发表的工作进行本地化的基于接近染料的整体性能是至少四个重要的准则，每个开关事件，即检测到的光子（各眨眼的亮度 - 亮越好）的混合，对平衡 - 断电占空比（染料在关闭与打开状态的对比度 - 更多关一般是越多越好），存活分数（低白化率越好）和开关周期数（每荧光闪烁的数字 - 更多对于高解析度好，虽然每荧光闪烁1次可以为分子计算目的的优势）。这种情况是由一个事实，即这些属性对于任何给定的染料可以以不同的缓冲条件而变化，并进一步复杂与激光功率^28,29。此外，还有这些独特STORM考虑，图像质量可以通过在通过最小化由自发荧光修饰的固定条件和使用的猝灭试剂相同的方式更为传统的荧光显微镜技术，例如优化的样品制备改善。此外，最小化非特异性结合的荧光基团是很重要的，这可以通过调整标签的浓度，孵育时间和阻断和洗涤步骤来完成。

图像采集的第二个步骤也很关键。在显微镜上的最佳设置将取决于染料，缓冲液条件，标签密度和样品类型， 例如单分子膜在玻璃上，将细胞或组织样品。主要的考虑因素是相机的曝光时间，帧号，照射角度（TIRF，希洛，EPI）和激光功率。其目的是尽可能快地收集尽可能多的明亮空间上分离闪烁。如果我的背景的甚高或闪烁不很明亮，换句话说，信号与噪声的比率差，重建算法将无法向的位置作为精确定位。以及最大限度地提高定位的精度， 即与每个分子位置的准确性可以被测量，图像质量也依赖于大量的本地化的。如果感兴趣的分子的数量不足进行成像，无论是由于不良的标记效率，过度漂白或不足的帧数，然后将所得的超分辨率图像将点状和不连续的奈奎斯特准则将不会得到满足^14,27 。

最后，用标准荧光显微技术相比，在第三步骤中，图像处理，就显得尤为重要。有一个广泛的自由和市售的算法，这既是优点，在选择方面，也是缺点，因为它可以混淆知道瓦特HICH是最适合使用。例如，如果原始数据有良好的间距空间上不同的闪烁然后单分子拟合算法可以非常准确，高效，例如通过在暴雨²⁷可疏拟合算法，rapidSTORM ^{24,25，palm3d 12}和QuickPALM ²⁶软件。如果原始数据中含有大量的重叠信号，然后其可以是更合适的算法包括DAOSTORM ³⁴ 3B ³⁵和deconSTORM ^36。此外，这些算法包含的阈值不同的标准，如信号计数，或者每闪烁光子，以及各种不同的图像显示选项，例如具有平滑的高斯函数的可视化或作为直方图与像素网格，其中所述超分辨率像素大小可以是由用户选择。所有这些选项更改最终图像的外观和对图像判读和分析的影响。

因此，我们提出了3个试验样品，将提供新的用户提供了一个起点，基于染料的定位为基础的超分辨率的实验，其中，为了清楚起见，我们将称之为STORM，有经验的用户有机会进一步优化他们的实验。首先，有可能以涂覆玻璃带的葡聚糖 - 染料结合物的荧光层的表面上。这提供了一个快速和简单的方法来建立的显微镜，染料和缓冲正努力产生闪烁的荧光信号。该方法可以再通过比较由暴雨产生的平均定位精度和数量指标来优化缓冲条件下，图像采集的设置和测试不同的染料进行扩展。其次，我们提出了一个简单的协议，用于在玻璃上，可以使用毒伞素染料结合物很容易准备标记肌动蛋白丝。这些提供了理想的结构，采取分辨率²⁷和通常的半峰全宽（FWHM）的测量的灯丝是作为第³⁷的经验估计。但应注意的是，分辨率样品之间和同一样品内的图像之间变化，因为在定位基于超分辨率显微镜的分辨率是荧光的亮度，背景噪声和本地化密度²⁷的功能，并且这些不一定恒定整个样品。肌动蛋白丝，是要证明潜在的文物，如mislocalizations和漂移，以及他们如何可以在暴雨的软件功能来识别。此外，我们描述了使用的荧光基准标记到两个测量和正确的漂移。第三，细胞与表皮生长因子（EGF） - 染料偶联物的染色进行说明。 EGF提供的超分辨率图像的性能的有效指标，因为该受体在细胞表面的比例通过囊泡，它们是约50〜150 n个子衍射尺寸的结构经历胞吞作用米直径^27,38,39。

Protocol

注:在本协议中，提示和建议被发现以下一些步骤。符号"* 1"表示音符1是相关的这一特定步骤，依此类推。

1。玻璃的荧光葡聚糖涂层

1. 加入200微升的0.01％聚-L-赖氨酸溶液至8室盖玻片的各孔中并孵育10分钟。用移液管除去，以确保没有液体是剩下的。
2. 根据制造商的说明来创建一个2毫克/毫升的储备溶液重组葡聚糖的Alexa 647 ^{* 1。}从此，稀0.25微升到25微升的去离子水以创建20μg/ ml的溶液。
3. 创建的葡聚糖的Alexa 647溶液的高密度涂层稀释20微升的20微克/毫升的溶液加入到总共200微升去离子水中。对于一个中等密度稀溶液2微升在200微升去离子水（从原来的储备溶液1:10,000稀释）。对于低密度溶液稀释0.2微升在200微升去离子水（从原始原液1:100稀释）。
4. 加入200μl稀释的葡聚糖的Alexa 647的解决方案到每个孔中并孵育10分钟。较长的孵育时间可用于这可能导致更致密的葡聚糖涂层。捞出洗净与H _{2 O} 3倍^{* 2}

注1:其他葡聚糖-染料结合物都可以使用。未缀合的葡聚糖也可以缀合的染料如果需要，组合是无市售。

注2:相同的右旋糖酐室可以重新镜像在一个星期内，虽然荧光的均匀性可能会降低。建议贮存于4℃在没有任何缓冲。

2。荧光肌丝玻璃

1. 加入200微升的0.01％聚-L-赖氨酸溶液到室的各孔中并孵育10分钟^{* 3。}回复用移液管移动，以确保没有液体的剩余量。
2. 加90微升一般肌动蛋白缓冲液（根据制造商的说明配制）的各腔室中。加10微升的10μM预制肌动蛋白丝溶液和1μl的鬼笔环肽-的Alexa 647（0.2单位，溶于1.5毫升甲醇中，当按照制造商的说明），并轻轻地吹吸以混合。温育30分钟^{* 4。}

注3:增加腔导致更少的纤丝结合到聚-L-赖氨酸包被的玻璃内的灯丝溶液的体积。

注4:孵化多达48个小时的时间，在4℃下进行了测试，效果良好。肌动蛋白丝的图像质量劣化后的腔室已经暴露于切换缓冲器所以不推荐使用相同的样品为一天以上。

3。微球荧光珠作为基准标记

1. 稀释1微升的TetraSpeck珠到200微升PBS混匀。
2. 加入稀释珠到成像室，并等待15分钟^{* 5。}除去溶液，并用PBS成像之前洗涤3次。

注5 -稀释和培养时间可以调整，以得到的珠粒密度不同。该协议通常会导致在3 - 10珠每20.5微米视场的X 20.5微米。

4。表皮生长因子细胞染色

1. 培养HeLa细胞在成像腔室，以在Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）约80％汇合的补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素溶液。
2. 除去培养基，洗涤用PBS。然后10分钟，加入500μl的4％多聚甲醛溶液（4mL 10％甲醛溶液，将1ml 10X PBS中，加入5ml水）。除去甲醛和洗3次，用PBS洗涤。不要让细胞保持ÐRY和总是用PBS缓冲解决方案，以避免低渗应激。

注意 - 甲醛是剧毒。确保适当的手套，护目镜和实验室外套的磨损。检查处理甲醛本地的指引。

3. 根据制造商的说明来创建50微克/毫升原液重组表皮生长因子的Alexa 647。加入2μl此储备溶液以200微升的0.1％BSA溶液（在PBS中）。从细胞中除去PBS，加入EGF溶液并孵育30分钟。
4. 去除溶液，并加入0.1％BSA（在PBS中）的15分钟时，封闭液之前，用PBS洗3次。除去这一点，并用PBS之前，成像洗再进行3次。

5。交换缓冲液制备

1. 使酶原液（A）与10微升过氧化氢酶（20微克/毫升），20微升的1M Tris（2 - carboxyelthyl）膦盐酸盐（4毫摩尔）2.5毫升甘油（50％），125微升含1M KCl（25毫摩尔），加入100μl的1M pH为7.5的Tris-HCl（20毫摩尔），5毫克葡萄糖氧化酶（1毫克/毫升），并补足至5ml体积与diH20。这足以使100×50微升等分试样，它可以储存在-20℃，并使用长达1年。
2. ）使葡萄糖储备液（B）与4克葡萄糖（100毫克/毫升），加入4ml甘油（10％）和36毫升diH20。这足以使100×400微升等分试样，它可以储存在 - 20℃，并使用长达1年。
3. 使还原剂原液（C）和113.6毫克MEA-盐酸（1M）和1毫升DIH ₂ 0。使用新鲜的或使10×100μl的等分试样，它可以储存在-20℃，并用长达1个月（不要重新冷冻等分试样）。
4. 只是之前成像，混合酶（A），葡萄糖（B）和还原剂（三）储备液一起在比50微升，400微升，100微升和弥补到1毫升的PBS ^{* 6。}这个缓冲器现在将清除氧并具有还原性的环境（100mM的MEA-HCl中^{）* 7。}最终的pH值应在范围6.0 - 8.5（调整通常不是必需的^{）* 8。}

注6 -此缓冲区是适于与羰花青类染料等的Cy5和Alexa 647的使用。

注7 -最终的酶浓度的葡萄糖氧化酶的50微克/毫升（5单位/ ml）和过氧化氢 ​​酶的1微克/毫升（40-60单位/ ml）。酶活性（单位）是由供应商所提供和可以变化。在计算过氧化氢 ​​酶假设1微克/毫升终浓度为5.4的步骤后，将含有50单位的酶。各种缓冲组合物，包括类似的氧清除组件，可以发现^21,30,40。对于缓冲液和染料组合的摘要见参考文献^28,29。甘油和TCEP需长期贮存于-20℃。

注8 -如果成像微丝加2毫米MgCl ₂和0.2毫摩尔ATP，以帮助稳定吨他细丝。

6。显微镜收购暴风影音资料（使用Alexa的647染料）

1. 接通STORM / PALM显微镜，成像之前优选至少3小时，以允许热平衡达到。在此之前成像具有漂移的机会增加。
2. 插入成像室到显微镜载物台样品架。确保样品是牢牢的持有人，是平的。
3. 从成像室中取出PBS中，然后填充到与开关缓冲器的顶部。小心地将盖玻片在室的顶部，确保没有气泡在所有和整个腔室被覆盖。补足额外的缓冲液或PBS如有气泡，否则视为缓冲性能可能会降低。

注意 - 以减少相对于所述物镜的样品的侧向和轴向漂移的可能性，建议在样品和缓冲液都留给平衡至室温至少15分钟前成像。

4. 找到感兴趣的荧光结构进行成像。选择照明的期望的角度，在这种情况下，全内反射荧光或高度倾斜的角度被推荐为这种改善了信号 - 噪声比通过减少失焦的光，这是特别有利于对细胞样品。采取结构之前，暴风影音成像参考衍射极限的形象。
5. 增加激发激光（具有约640纳米的合适的激发波长下）到一个高功率，对应于约2千瓦/厘米^2，而成像用的10毫秒曝光相机设定和大约50赫兹的周期时间（帧每秒） 。一旦荧光团已过渡到稀疏闪烁模式（大概在10秒内对大多数样品）采集10,000帧^{* 9。}

注9 - 10,000帧适合于这里描述的样本但它可能有必要增加帧编号，以50,000或更多的其他样品。

7。从原始数据中重建超分辨率图像（使用暴雨）

1. 在MATLAB中打开rainSTORM.m文件并运行（ 图1A）。
2. 在暴雨窗口（ 图1B）选择要使用的浏览按钮进行分析的图像文件。这应该是一个。tif文件（ImageJ的，可用于转换其它文件类型转换为TIF格式）。改变像素的宽度相匹配用于采集数据^{* 10}显微镜系统的原始数据。保留其他值设置为默认。

注10 -典型的EMCCD相机具有16微米的像素尺寸，以便用100X物镜系统上的图像上的像素的大小将是160纳米。对商业系统的像素大小是在软件中通常显示。像素大小100纳米和160纳米之间各有不同，最本土化的显微镜。

3. 按"图像处理"按钮，并等待一个初步的形象出现。该处理的持续时间将取决于文件大小，计算机说明书和原始数据^{* 11}内的候选眨眼的次数。

注11 -肌动蛋白和EGF数据10,000帧序列，花了23秒和25秒使用电脑与英特尔®至强®E5420 CPU分别处理。使用相同的计算机，而无需在MATLAB并行处理工具箱，或与电脑没有多核心处理，时间分别为66秒和81秒分别。

4. 要生成一个更新的超分辨率图像按"打开审阅"按钮，会出现第二个窗口（ 图1C）。按以随意（ 图1D）来改变图像显示的"调整对比度"按钮。在某些情况下，当图像很暗的最大值应被减小。
5. 使用转iewer窗口（ 图1C），以产生有用的图像质量度量和改进的超分辨率图像进一步。将前三个质量控制参数4000，0.1和0.8〜2.0的值分别为^{* 12。}更新每个光子的价值，它要么是基于光子校准测量，或使用由相机制造商特定的EM增益设置指定光子曲线校准曲线值的计数。这是为获得准确的精度和分辨率的测量^{* 13}的关键。

注12 -信号计数拒绝基于亮度的标准闪烁。该值越高越亮闪烁必须成为接受为最终图像本地化。这可能需要取决于染料和曝光时间和照相机的感光度的光子输出被改变。公差拒绝闪烁是否存在的信号，并拟合高斯例如，d之间显著方误差OUBLE峰。 PSF西格玛范围拒绝闪烁如果PSF的配合宽度超出此范围，即范围较窄，可用于拒绝了焦信号和不断荧光大汇总斑点。使用范围更广泛，可能会导致出现在最终图像错误定位工件。在实际应用中，建议使用定位精度的截止参数进行初步的质量控制。

注13 -更多的分辨率指标见参考文献^23,27。在简要通过了解由每个所产生的光子数闪烁，可以计算出每个定位的定位精度，从而导出经整体的意思是精确估算整个图像。使用安道尔IXON DU-897E与200元价值的光子计数的增益设置为9.04。

6. 改变定位精度截断（ 图1C）平均优化本地化PRECIS之间折衷离子对最终图像的定位号码。 30-50 nm的值取决于数据的质量和样品推荐。无论是直方图和info.txt文件的文件可以被用来告知决定（ 图1F和1G）
7. 重构的比例因子（ 图1C）缺省值是5，这将产生32纳米的超分辨率像素假设在原始图像中的像素的宽度为160nm。如果原始图像具有100nm的像素尺寸，这将产生具有20nm的像素的超分辨率图像。增加比例因子在最终图像^{* 14，}产生更小的超分辨率像素。

注14 -定位显微镜的分辨率取决于所需的可视化（即一个简单的柱状图重建的像素大小），以及定位精度的平滑。在实践中，重建的像素尺寸一般应比定位小精度（见平均精确度估计度量中的信息文本文件 - 步骤6.11和6.12）。在这种情况下解决因重建像素大小的损失会很小^23,27。例如，行和图4E的列方向的平均精度估计是16.1 nm和16.2 nm的。为16nm的像素大小已经被用于可视化这个数据（共10个重建的比例因子为160纳米的原始像素的宽度）。

8. 修改限制帧的范围（ 图1C），以重建限制到的原始数据的子集，例如[2001-INF]将排除原始数据的初始2000帧。
9. 按'运行评论家"按钮（ 图1C），以生成更新的超分辨率图像（ 图1E）。
10. 按"查看直方图"按钮（ 图1C），为了显示图像质量指标（ 图^{1F）* 15。}

注15 -在右上角描绘了对摄像头的帧数，并在右下角（ 图1F）汤普森本地化精密工业直方图接受本地化的数量的曲线图可以用来告知定位精度截止审查选项。例如，使用50纳米的截止将排除所有与被包括在最终的超分辨率图像恶化精度的本地化。

11. 按"保存图片"按钮，在评审（ 图1C），以保存所有这些数据^{* 16。}

注16 - 3至5个文件可以根据选定的（总和形象，STORMdataImage，STORMprocessed，信息及hists）的选项被保存， 见图1G。风暴处理后的图像会显示修改对比度和色彩映射。该STORMdataImage是灰度图像，其中每个像素的灰度级等于麻木呃这是在它确定本地化的。

12. 检查数据后（ 如 info.txt文件和柱状图）返回到步骤7.6，如果需要用不同的审稿参数重复后续步骤。按"保存图像"在步骤7.11将覆盖以前保存的数据。

8。箱跟踪和漂移校正（使用暴雨）

1. 按照步骤7.1 - 7.9以生成图像以正常的方式。
2. 按在审查员（ 图1C）的"框跟踪"按钮，然后单击并拖动一个框的审查图像上感兴趣的基准标记或结构。
3. 等到一个新的形象出现，这将显示"盒装位置"（ 见图6B，6C和6F的例子）。如果需要保存该图像。
4. 如果感兴趣的对象是一个基准标记，然后漂移校正，可以通过点击"设置锚"键，接着按'子进行道漂移"按钮。最后单击"运行检阅者再次产生一个新的暴风影音图像，现在将所有本地化根据基准标记位置的校正。珠位置从最后的审阅图像删除。
5. 如果有最终的漂移校正后的图像中的其他基准标记，这些都可以通过按'盒跟踪"被删除，"删除盒装'然后根据需要"运行检阅者多次。

Results

葡聚糖

右旋糖酐一个成功的涂料应产生荧光单层。在高浓度的本应出现比较均匀。在较低浓度下它会出现稀疏（ 图2A）。许多STORM / PALM显微镜必须从萤光改变照射角度，以TIRF的能力。当在一个典型的EMCCD相机512×512象素使用全帧相机视图，例如，一个均匀的照明应观察。如果有任何条纹或外的焦点区域这可以表明样品应当被重新插入到用新鲜的油样品支架上的物镜。另外，它可以指示与显微镜的一个问题。

当获取的超分辨率的原始数据的成像激光应在功率增加至约2千瓦/厘米^2。会有一个初始突发荧光依次闪烁的荧光团被驱动暂时的黑暗状态。在高密度葡聚糖的闪烁可能会重叠，尤其是靠近图像采集开始（ 视频1）。在中等和低的密度这些闪烁应该稀疏， 即在空间上分离，并在焦点没有明显的背景（参照帧2000，5000和8000， 图2A，视频2和3）。在此图像采集阶段，在恒定的激光照射，眨眼的次数会随时间减少（带框架8,000高密度采样， 图2A的比较框架2,000）。不同葡聚糖浓度（高，中，低）的各种超分辨率图像之间的主要区别是数目减少的本地化的（ 图2A和2B）。换句话说，荧光分子的浓度，闪烁在原始数据数和本地化的数量成比例关系。这种关系，然而，这并不是一个简单的线性酮，在非常高的分子密度的软件是无法成功定位的分子（比较红和蓝线， 图2C）。这样做的原因是，在高浓度它是不可能的处理软件，利用高斯拟合算法，其中闪烁是非稀疏的适合的位置。通过采集阶段，由于光漂白的软件可以适应越来越多的闪烁，因为它们变得稀疏（ 图2A和2C）的闪烁减少。此外，个别染料分子可能会闪烁，因此被本地化更^28,41,42不止一次。

成像任何这些样品，但特别是高密度葡聚糖之一，当一个常见的​​问题，可以是出现在暴风影音图像采集阶段迅速扩散明亮但不聚焦荧光阴霾的存在。这是对高对比度鲜明的荧光在玻璃的表面上，由此可以看出闪烁（ 图3A，视频5）。这些分离的荧光分子可以通过增加之前添加的开关缓冲器的洗涤步骤，以PBS的数量或通过添加新鲜的缓冲液交换到所述腔室（ 图3B，视频6）来防止或除去。处理和比较从每个图像序列的结果，其中有在本地化的数量和与它们可安装软件到闪烁本地化（ 图3C，3D，3E的精度的降低非常不同的超分辨率图像数据和3F）。

肌动蛋白丝

预制的肌动蛋白丝可以看出粘在玻璃由衍射限制成像（ 图4A-4C）的表面上。如果长丝数出现很低，那么较长的孵育时间可用于或在肌动蛋白的量的减少长丝的解决方案也有帮助。在选择质量更好的图像单相对明亮的细丝（ 图4D），而不是纠结领域的成果。在采集阶段，明亮的闪烁的重点应沿丝（ 视频7）的长度可以看出。稀疏闪烁，应在采集阶段被看作并随后在经处理的数据应该有一个薄的连续长丝（ 图4E）和每帧的本地化应该逐渐下降（ 图4F），不同于在图3E中 。

如果闪烁是不稀疏的，或者如果该软件不能够将分子定位，更细微的伪影，称为错误定位^32，可能的结果。出现这种情况时，该软件的平均值两个重叠的分子的位置和定位的是它们之间的位置的中间位置。一个迹象表明，再也没有出现过一个显著一些重叠劳保局NKS，因此mislocalizations，是平均精度估计应该是在该行和列的方向， 即水平方向和垂直方向上是相同的;那里有mislocalizations这些会沿长丝的长度发生，产生了比常规的闪烁（大即分布在更多的像素），这将因此被本地化在其中一个方向的精度更低。这是最容易看到的地方有一个在成像区域的单个肌动蛋白丝，它是躺在水平或垂直。在这种情况下，STORM显微镜，在两个方向上实现了16 nm的平均精确度。这导致了精度的限制，约34 nm的有效图像分辨率的测量。这些指标是由暴雨²⁷提供的，但是，正如我们有统一口径，7纳米的丝状结构，非常小的鬼笔环肽-Alexa的647标签我们可以采取半高宽的测量来估计图像的分辨率。通过DRA翼的直线穿过的ImageJ（ 图4G）的超分辨率图像的灯丝，使用积轮廓特征（ 图4H），并且随后进行高斯拟合（ 图4I）的半峰全宽计算为43.2纳米。当试图测量结果，我们建议在像素尺寸应该符合或高于平均精度估计的图像略小（见info.txt文件图1G）。在这种情况下，16纳米的像素被用来重建一个图象。

可发生风暴，其中闪烁的荧光团成为非稀疏， 即单个分子内的约250纳米的闪烁在同一时间，因此，信号重叠，两个相关的问题。首先是依赖于算法和它使用的质量控制标准，闪烁可能不会在所有本地化。这将导致在具有很少或没有本地化的超分辨率图像。的第二个问题mislocalizations发生在两个闪烁发生足够接近对方，以显示为一个单一的闪烁。在这种情况下，在最终的图像中的位置表示一个平均的两个。对于这方面的更多细节见参考文献^32。在这两种情况下，这可能会发生非常高密度的样品，激光功率不足或带有开关缓冲区的问题。这个问题是明显的，其中一些微丝是分支和/或彼此交叉（ 图5A-D，视频9）。通过处理帧的子集，以及比较所述第一和最后帧5000我们可以看到不同的结果图像。在使用第一帧5000（ 图5C）的超分辨率图像可以看出，还有许多的本地化在图像的中间，但是使用最后帧5000时，只有极少数的这些明显的和我们剩下的只是细丝，尽管所拖欠本地化在成像的低数量有所间断E（ 图5D）。如果太高闪烁密度怀疑，每帧数据的本地化图像的比较可以有力地表明，这个问题发生，第一组框架中有一个平均数本地化的每帧超过10的最后一组相比，帧的地方是大约4（ 图5E）的。为了尽量减少出现理想的是具有每帧尽可能少的本地化，但如果有大量的分子将被成像的， 即用于高密度样品中，这需要mislocalizations的可能性，大量采集框架应采取导致另一个问题，暴风影音显微镜是漂移。

横向漂移 - 肌动蛋白丝和基准标记

漂移发生在样品的移动相对于所述物镜通过数据采集阶段。这是困难的或不可能看到超级碗克图像采集阶段，特别是如果它是横向而不是轴向，或者除非它被具体地测量，因为它通常在几分钟内为相对稳定的显微镜系统的过程中小于50纳米。然而，在已知的结构，例如肌动蛋白丝具有良好定义的结构的重构图像，可以在超分辨率图像中检测到。第一迹象，表明横向漂移可能发生的是，该结构是大于预期（ 图6A中 ， 视频8）例如具有相对较大的半峰全宽与从暴雨的精度限制的数据进行比较，在此情况下90纳米与67纳米相比较。然而，更好的方法来检测漂移是通过比较本地化作为时间的函数， 也就是说 ，如果在以后的帧的本地化与那些在早期的帧相比流离失所看到。这可以清楚地看到在肌动蛋白丝，这是非常小的均匀的结构和的情况下，当使用在暴雨框跟踪功能（ 图6B和6C）颜色代码显示。

漂移是一个公认的问题，并有大量的策略可用于最小化¹⁹或纠正采集后或者使用基准标记^21,43或交叉相关^44。为了测量漂移和校正它，直径100纳米的荧光珠可以用作基准标记（ 图6D）。因为他们是小而明亮的位置可以精确地测量采用高斯拟合算法，如暴雨。在一个例子，其中有一个约100纳米以上的3分10秒的过程中相对严重的漂移，在采集阶段（ 图6E），在同一个盒子跟踪功能可以用于彩色代码和确认发生漂移（ 图6F ）。由于所有四个小珠在这个例子展示近乎相同的漂移它是Possible来选择其中的一个，在这种情况下，胎圈2，作为参考使用，并且从其他珠（ 图6G）中减去所述漂移。通过将基准标记与感兴趣的生物样品，然后它能够​​测量并校正任何漂移，其中的底层结构是未知的或远小于一个肌动蛋白丝或荧光珠更可变。

表皮生长因子

最后，EGF染HeLa细胞，可用于给细胞（ 图7A，电子10）的图像分辨率的一个实际的例子。这些细胞是相对简单的图像，因为它们应该具有多数EGF-荧光平面的焦上靠近玻璃罩细胞表面。不太明亮的区域在中心对应于细胞核的位置。 TIRF照明可以通过消除失焦的荧光从小区米部件来提高图像质量embrane不靠近玻璃（约150纳米渗透入细胞）。缩放中，在衍射限制图像的感兴趣区域通常是模糊的（ 图7B和7C），但是，在超分辨率图像应该有一个混合物集群和偶尔的孤立单一像素（ 图7D-7F）的。这些将代表在细胞表面或可能有少量的非特异性结合或分离的表皮生长因子受体。簇会在直径约为100nm，并有可能对应于形成凹坑和囊泡，该途径通过该EGF是主要下调和内吞。典型的平均精度估计约20纳米的这种类型的样品约为45纳米的精度限制。应当指出的是，有效地解决这个精度限制措施并不顾及标签大小，或任何漂移，其可以与基准标记进行测量，但仍然是诺蒂奇使能控制通过在群集或使用， 如图6所示 ，并在协议的第8条中所述的盒子追踪功能"彗尾"。

元件	终浓度
过氧化氢酶	1微克/毫升（50单位）
葡萄糖	40毫克/毫升
葡萄糖氧化酶	50微克/毫升
甘油	12.50％
氯化钾	1.25毫米
MEA-盐酸	100毫米
TCEP	200微米
三	1毫米

表3。切换缓冲

典型的采集设置	值
像素大小（纳米）
曝光时间（msec）	10
收益	200
画面尺寸（像素）	128×128
周期时间（FPS）	52.5
帧数	10,000
640 nm激光功率密度（千瓦/厘米2）	2

160

表4。采集设置

图1。暴风影音图像重建使用暴雨（A）在MATLAB打开暴雨。 （B）暴雨的图形用户界面（GUI）。 （三）暴雨审稿的GUI。 （四）调整对比度窗口。 （五）审查和对比度调整后STORM图像。 （六）他的图像质量度量tograms。在评审的GUI按下保存图像按钮之后生成（G）的文件。 点击这里查看大图 。

图2（A）衍射极限（DL）的图像显示不同浓度的右旋糖酐前STORM成像。超分辨率（SR）的图象再现具有25nm的像素大小。 10,000图像采集了128×128像素帧大小和各个帧显示从该序列（2,000，5,000，8,000）。以每秒52.5帧收购了10毫秒的曝光时间。图像具有160nm的像素大小。为清楚起见，观看0.1％的像素饱和度对比度增强的使用ImageJ施加。平均精度估计是28纳米（高），24纳米（中等）和16纳米（低）对于不同的右旋糖酐图像。本地化密度为每724微米^2（高），526每^平方微米（中）和13％庵^2（低）。 （B）示出图形的平均葡聚糖的各浓度的3万帧序列。误差棒表示标准偏差（C）绘制图形使用滚动100架平均每帧接受本地化的数量。 点击这里查看大图 。

图3。质量差葡聚糖数据。从15,000帧序列暴风影音（A）衍射有限框架。注意在图像漫荧光阴霾。这是因fluoropho水库扩散通过介质。 128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧获取。 （b）缓冲器后同为（A）已经改变。注意:为未绑定的荧光基团都被冲走了改进的对比度。 （三）相应的收集（一）数据的超分辨率图像重建。相同的图像大小，但随着25纳米像素。平均精度估计为35纳米。 （四）相应的收集在（B）中的数据的超分辨率图像重建。相同的图像大小，但随着25纳米像素。平均估计的精度为30纳米。 （E）的图形绘制每帧被接受本地化的数目，使用的是轧100帧平均。红线对应风暴序列（A和C），其中有一个高的背景。蓝线表示对应于（B＆D），其中所述背景是低的数据。 （F）的图形表示对应于高的图像中的接受了本地化数（C）和低（D）的背景数据。HREF ="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg"目标="_blank">点击这里查看大图。

图4。典型的肌动蛋白的数据。（AC）衍射极限之前，除了开关缓冲器和风暴成像肌动蛋白丝的图像。长丝的可变长度可以看出。非常明亮的细丝往往纠结在一起的几个细丝。像素大小为160nm。 （D）一个单一的肌动蛋白丝的衍射限制图像。 （五）暴风影音图像（ImageJ的应用0.1％对比度增强）。从具有128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧获得了10,000帧序列。在像素大小为16纳米。平均估计的精度为16纳米。 （F）的图表绘制接受本土化的数量每帧秒，使用滚动100帧的平均水平。 （G），以增强对比与跨绘制一个黄色的轮廓线从之前（E）中的肌动蛋白丝的区域缩放。 （H）来自全国各地的肌动蛋白丝画的黄线A地块轮廓视图。在生成ImageJ的。 （一）在使用ImageJ的曲线拟合工具的情节轮廓的高斯拟合。标准偏差，D，乘以2.35得到43.2纳米的FWHM测量。 点击这里查看大图 。

图5。错误定位的肌丝（A）衍射限制的肌动蛋白丝。 160 nm处的像素。在（A）中所示的肌动蛋白丝（B）暴风影音图像。从具有128×128像素FRAM 20,000帧序列E大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧获取。风暴像素大小为16纳米。所有20,000帧进行处理。平均估计的精度为17纳米。 （三）由于（B），但与20,000帧序列的处理只有第5000帧。平均估计的精度为18纳米。（四）由于（B），但与20,000帧序列的处理，只有最后5,000帧。平均估计的精度为17纳米。每帧数据的本地化从完整的128×128像素帧视图（E）图。

图6。横向漂移（A）风暴的肌动蛋白丝从10,000帧序列重建了一个64×64像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒64.6帧拍摄的图像。风暴像素大小为32纳米。平均精度估计32纳米。 （B）显示使用"跟踪框"在暴雨特征风暴形象。本地化显示对应于被收购时，他们的帧号的颜色，例如，从采集序列早期本地化是蓝色的，从后期的采集序列本地化是红色的。流离失所的颜色表明已发生漂移。 （C）在（A）区域放大显示使用暴雨箱跟踪功能。流离失所的颜色表明已经发生漂移。 （D）的4 100nm的荧光珠的衍射限制图像，其可以被用作基准标记。像素大小160纳米。数字1-4显示裁剪和缩放珠分别。 （E）在暴雨重建从10,000帧序列具有128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧获取的对应于（D）的每个荧光珠。风暴像素尺寸为5nm。平均精度估计为7纳米。对应于（D）（F）的磁珠和（E）使用"盒跟踪"功能显示。流离失所的颜色表明已经发生漂移。 （G）使用胎圈数2作为基准，磁珠1，3和4所显示的'中减去漂移"功能之后用于暴雨。与（E）比较表明，横向漂移已得到纠正。风暴像素尺寸为5nm。 点击这里查看大图 。

图7。典型的表皮生长因子数据（A）衍射有限的HeLa细胞集中在基底细胞表面的一部分图像。黄色框表示放大的（B）所示地区的利益和（C）。 （B）放大后从细胞（箱B）的边缘附近的区域衍射受限图像。 （三）放大衍射极限细胞核（箱C）根据从区域图像。 （四）相应的暴风影音图像（A）。从具有128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧获得了10,000帧序列。风暴像素大小为25纳米。平均估计的精度为21纳米。 （五）相应的对话框E（D）暴风影音图像。 （F）对应箱F（D）暴风影音图像。每次从（D）的帧数据（G）版。 点击这里查看大图 。

。视频1-4视频对应于图2a具有不同葡聚糖浓度:1 =高，2 =中，3 =低，4 =无）。 10,000帧序列具有128×128像素的帧大小，以每秒52.5帧获得具有10毫秒的曝光时间。 点击此处查看视频1 ，load/50579/50579video2.mov"目标="_blank">视频2， 视频3 ， 视频4

视频5-6。视频对应于图3 A和B视频5是预洗和视频6是后洗游离荧光团已被删除后。使用一个128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，以每秒52.5帧收购15,000帧序列。 点击此处查看视频5 ， 视频6 。

视频7。视频显示，被处理以产生在图4E的STORM图像的原始帧序列。 10,000架sequeNCE一个128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧获得的。 点击这里查看视频7 。

视频8。视频显示，被处理以产生在图5B中的STORM图像的原始帧序列。具有128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧购入20,000帧序列。 点击此处查看视频8 。

视频9。视频显示，被处理以产生图6A中的STORM图像的原始帧序列。具有64×64像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间和以每秒64.6帧拍摄。万帧序列Cli的CK此处查看视频9。

视频10。视频显示，被处理以产生在图7D的STORM图像的原始帧序列。具有128×128像素的帧大小，一个10毫秒的曝光时间，并以每秒52.5帧购入10,000帧序列。 点击此处查看视频10 。

Discussion

我们显示了一些简单的测试样品和可自由可用的处理软件暴雨能够优化STORM超分辨率成像。这些工具和方法将提供有用的起点为新用户和途径有经验的用户，以增加信心，他们的显微镜及其使用它们来研究生物学和细胞结构以前所未有的细节。通过使用具有已知的或容易理解的结构和算法，可以产生许多有用的图像质量度量，例如平均的估计精度，定位数和直方图表示有可能提高图像质量，并有更大的​​信心样本的组合在风暴成像过程。有没有一个放之四海而皆准的方法来采集数据，因为有许多不同的商业和自建显微镜配置，都可以使用。此外，有许多样品制备和图像采集步骤，它可以十字形ENCE因此最终图像有软件工具和测试样本是理解和优化暴风影音图像质量的关键。

另外，这些协议可以提供故障排除任何可能出现的问题，有用的和更加明确的方式。例如葡聚糖样品，以确定是否有任何的激光束对准或样品的照度不均匀一个非常有用的方法。如果有顾虑，开关缓冲区可能无法正常工作非常简单直观的测试，看看是否有任何'闪烁'会有所帮助。肌动蛋白丝是采用半高宽比较，以及突出的漂移和错误定位工件测量分辨率的有效途径。然而，应该指出的是，作为定位基础的超分辨率的方法可以是荧光团密度敏感，尽管其他因素，如曝光时间，帧速率，激光功率和图像处理方式，它是不可能分配一个分辨率为特别是显微镜和假设所有的图像都会有该决议。这是可能的，但是，是测量分辨率的各个方面，例如平均定位精度，定位数和漂移^27。即使基准标记不能被纳入每一个实验，他们可以，至少，可以用来表征显微镜系统，它的环境和更好地了解运作方面的考虑，如多少时间才能达到热平衡启动后。以及校正横向漂移，基准标记可用于表征和正确的轴向漂移，虽然这要求使用一个象散透镜和反馈机制来纠正样本位置而被获取的图像^43。商业超分辨率系统通常包括某种形式的稳定控制或聚焦锁定机构，其可以是用于校正焦点偏移的更实际的解决方案。

有再替代非特异性镀膜玻璃用葡聚糖，如直接使用染料或其它共轭分子，如第二抗体。这些方法的局限在于不知道分子结合于玻璃的数量。已经使用的另一种纤维结构，包括微管²⁸和²¹的DNA。然而，非常小的尺寸和方便的市售试剂的结合，使肌动蛋白的有吸引力的替代，特别是发散或支长丝的间隔距离也可以是系统性能²⁷的有用的测量。

有余地测试样品的进一步发展，尽管在这一领域^28,29,46,47最近进展。特别是，多彩色成像提出了许多挑战在成像的全部3个主要方面，样品标记，图像采集（硬件）和软件（图像处理和对准）。有一个被一些出版物寻址这些方面^4-6，因此很清楚，合适的测试样品和方法是对生成并可靠地解释这些类型的图像的关键。事实上，最近它表明，dSTORM可以用来采取两种彩色图像，并解决，核孔复合体的高度对称的性质，作者认为，这将是评估的色差校正⁴⁵性能的理想方法。另一个有趣的方法是利用DNA折纸的创建nanoruler，这在特定的子衍射的距离相隔⁴⁶创建定位的荧光团的可能性。这提供了评估分辨率，使测量距离的一种方式。然而，最终的目的是将这些超分辨率技术适用于非理想化的样品，如细胞，这是复杂的三维结构。在这种情况下，更透彻的了解吨的组合他技术结合软件工具，帮助用户在获取数据，以适当的方式处理它，并提供图像指标很可能是最终的答案^{。28,29,47,48}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek 成像室 玻璃	Fisher	CBR-166-390E	样品制备
倒置显微镜	奥林巴斯	IX71	* 见下文
100 X TIRF 物镜	奥林巴斯	UAPON 100XOTIRF	* 见下文
EMCCD 相机	Andor	iXon 897	* 见下文
640 nm 激光器	Toptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - 用于成像 Alexa 647 或 Cy5 染料
LabVIEW	National Instruments		*采集软件（控制硬件）
PC	Dell		Windows XP（64 位），Intel Xeon E5420 CPU，16 GB RAM *仪器控制和图像处理
ImageJ			图像分析与处理 http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM	激光分析集团（剑桥）软件		http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	运行 rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
>*自制 STORM/PALM 显微镜示例另请参阅			参考文献 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*商用 STORM/PALM 超分辨率显微镜			Leica SR GSD、Nikon N-STORM、Vutara SR-200、Zeiss Elyra P.1、DeltaVision OMX Blaze（莫奈定位） 自制显微镜的替代品
表 1. 材料和设备
[header]
PBS （10X）	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707	1.1; 2.1
葡聚糖-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
通用肌动蛋白缓冲液	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
预制肌动蛋白丝	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
鬼笔素-Alexa 荧光 647	Invitrogen	A22287	2.2
TetraSpeck 微球（0.1 微米）	Invitrogen	T-7279	3.1
HeLa 细胞	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Pen/Step	Invitrogen	15070063	4.1
塑料培养皿	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3， 4.4
甲醛 - 10 % 溶液 EM 级	Polysciences	04018-1	4.2
过氧化氢酶	Sigma	C100	5.1
葡萄糖氧化酶	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
葡萄糖	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
甘油	Sigma	G2289	5.1;5.2
表 2. 试剂