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从完整的蟑螂神经系统中记录神经回路活动

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DOI：

10.3791/50584

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2013年11月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Kentucky , 2Department of Biology, University of Salahaddin, 3Oregon Institute of Marine Biology, University of Oregon

本文内容

摘要

本文介绍了蟑螂腹神经索的解剖方法，以及从尾须神经和神经索连接处进行的细胞外记录。通过电刺激尾须神经或直接机械刺激尾须，可引发诱发电位反应。

摘要

蟑螂腹神经索制备是一种适用于神经行为学实验、神经网络建模以及检测杀虫剂生理效应的可操作体系。本文描述了可用于检测昆虫神经系统如何响应环境扰动的蟑螂感觉模态范围。重点在于由尾须介导的逃避行为以及其在美洲大蠊（Periplaneta americana）中向巨大纤维的信号传递。这种原位制备仅需中等水平的解剖技巧和电生理学专业知识，即可重复记录神经元活动。随后可将肽类或其他化学试剂溶于生理盐水中直接施加于神经系统。杀虫剂也可在解剖前给予，而逃避回路可作为中枢神经系统兴奋状态的替代指标。在此背景下，本文所述的检测方法对于研究附肢再生以及神经系统发育演化的研究人员也具有参考价值，因为美洲大蠊（P. americana）已是这些研究领域的成熟模式生物。

引言

目前已发现超过4000种蟑螂，但其中仅约30种为常见的家居害虫。或许最广为人知的是名称有误的美洲大蠊Periplaneta americana，该物种原产于非洲，如今几乎遍布全球各地。除了具有快速奔跑的能力1 和逃避天敌的行为特征外，在热带地区，P. americana还具备飞行能力2,3。

蟑螂中枢神经系统（CNS）的主要特征是其分节性以及控制过程的去中心化4,5。脑、胸部神经节和腹部神经节通过成对的节间连索连接，形成腹神经索（VNC）。

每个体节的神经节是整合中心。它们由外层的皮层区域组成，其下方含有负责血脑屏障通透性的细胞，以及起源于该神经节的神经元胞体。这些胞体可能属于中间神经元、调制神经元或运动神经元。它们发出的轴突可停留在起源神经节内（局部中间神经元），或投射至中枢神经系统内的其他神经节（节间中间神经元），或终止于外周肌细胞（运动神经元）。大多数胞体位于神经节皮层的腹侧或腹外侧5。成对的节间连索仅含有轴突，不含神经元胞体。

神经节的神经毡含有胶质细胞（神经胶质）、轴突束、轴突集合以及神经元的树突（神经突）。神经毡中没有神经元的胞体。该区域是神经节内神经细胞之间直接发生突触通讯和输入信号整合的部位。

美洲大蠊的能力 P. americana 以探测并迅速应对逼近的捕食者（脚、手） 等等已被归因于由尾须和巨大纤维系统组成的反射回路6,7。尾须是一对位于腹部末端的角状、对风敏感的结构（图1）。在 P. americana 每根尾须的腹面约有200根丝状（线状）刚毛，排列成14列。其中9列在不同个体中可根据其相关感受细胞和轴突的反应特性稳定识别。每根刚毛均位于一个窝槽内，使其最易沿特定于该列的平面发生弯曲。刚毛沿其敏感平面朝一个方向运动时，会引发感受细胞去极化及感觉神经元产生一连串动作电位（APs）；而反方向运动则抑制任何持续的自发性动作电位。8每个柱状结构的偏转优先平面和反应方向性均不相同。因此，丝状毛感受器复合体不仅能够检测空气流动，还能以动作电位（APs）的形式对气流来源方向进行“编码”。中枢神经系统对这些信息的处理可引发相应的逃逸反应6,7这种感觉毛的功能性和柱状特异性在不同动物之间是保守的。

每个丝状毛的感受细胞负责将毛的机械偏转转化为神经事件（导致感受细胞轴突中动作电位的爆发或抑制9。这些动作电位通过尾须神经XI传至末端腹神经节（A6），并在该处与腹神经索（VNC）中的巨轴突形成突触连接。巨轴突被认为负责传递信号并进一步激活运动神经元，从而引发逃避行为6,10,11。

P. americana 的逃避反应行为潜伏期是所有动物中最短之一7。行为潜伏期是指刺激到达机械感受器与逃避反应启动之间的时间间隔。在利用高速电影摄影记录蟑螂试图从蟾蜍攻击中逃脱的实验中，观察到蟑螂在蟾蜍舌头开始伸出后约 40 毫秒内即开始转向逃离7,12。通过施加可控的气流刺激，行为潜伏期可缩短至 11 毫秒。其他实验表明，最小风速为 12 mm/msec （加速度为 600 mm/msec2）的气流即可引发逃避反应，而更低的风速（3 mm/sec）则可使缓慢行走的蟑螂停止移动12。

巨型纤维系统与逃跑行为之间通常存在的强相关性已有充分记载13,14。当某个特定细胞对于引发某种特定行为既必要又充分时，该细胞被称为指令神经元15,16。在美洲大蠊（P. americana）风刺激逃跑回路中的巨型中间神经元（GIs）对于该反射并非必要。实验性切除GIs的动物仍能表现出逃跑行为，因此这些GIs不被视为指令神经元17,18。切断位于感觉运动回路前方的颈连接也会影响该行为，表明来自脑部的下行输入对逃跑方向具有调控作用19。这种精细控制和冗余机制对该生物体的生存至关重要，并由生物源性胺类介导的神经化学调制加以补充20。

P. americana 的神经索制备在过去数十年中一直是神经行为学家研究的优雅模型系统，其研究始于Roeder的开创性工作21。该模型使学生能够记录、显示并分析初级感觉活动以及巨神经元对其输入所产生的反应22,23,24。除了传达“可识别的神经回路介导了生物对环境的行为反应”这一理念外，这些实验还应使学生认识到这种常见的家居害虫在生物学研究中所做出的重要贡献。

方案

1. 解剖

本方案中使用的蜚蠊生理盐水 溶液成分为：

蜚蠊生理盐水溶液36：（配制100 ml所需克数）
210 mM NaCl（1.227 g）
2.9 mM KCl（0.0216 g）
1.8 mM CaCl2（0.0265 g）
0.2 mM NaH2PO4•2H2O（0.0032 g）
1.8 mM Na2HPO4•7H2O（0.0483 g）
（pH 7.2，用1 M NaOH或1 M HCl调节pH）。

  1. 从饲养箱中选取一个尾须健壮的雄性蟑螂（图1）。雄性的末端节段较雌性狭窄，且不含卵巢和卵块，因此更易于解剖。雄性个体的 P. americana 在尾须之间具有一对短小的刺突，雌性个体中未见此类刺突。
  2. 剪除翅膀、足和头部，将虫体腹面朝上固定在铺有硅胶弹性体的培养皿中。
  3. 用镊子夹起腹板，从后端开始，用精细剪刀向前依次剪除。始终用生理盐水保持内部器官湿润 在操作过程中尽量保持尾须干燥。可使用石蜡或橡胶块将腹部向上固定，以防止任氏液润湿尾须。若尾须不慎被润湿，可用一小片纸巾将其擦干。将内部器官和白色物质（脂肪体）轻轻推向一侧。腹神经索位于视野中央，沿腹部纵轴延伸，应可见于闪亮的气管之间。神经索呈半透明状，起初可能不易观察，需适当调整光照后方可清晰辨识。图2）。切勿使用镊子或昆虫针处理腹神经索，而应使用玻璃探针进行操作。
  4. 尽可能用镊子清除动物气管系统与神经索之间的组织，并用一对精细的玻璃针小心地在第6腹节（A6）与第5腹节（A5）或第5腹节（A5）与第4腹节（A4）神经节之间的腹神经索连合处进行纵向分离图3）。用截短的昆虫针配合石蜡或硅胶弹性体楔形物（可切割成适合制备样品的形状）将尾须和腹部从生理盐水中向上托起图4A 和 B）。在最后一段腹节中需格外小心，避免损伤伸入神经节的尾须神经（图2D 和 5).

2. 细胞外记录

  1. 解剖好的标本、显微镜和记录装置应置于法拉第笼内，以屏蔽可能掩盖神经元信号的外部电场，尤其是交流电场（图6).
  2. 将显微镜放置在能够俯视显微镜载物台的位置。将样品置于载物台上后，调节高亮度照明光源的光束位置，以获得最佳观察效果。
  3. 将交流/直流差分放大器连接至集成数据记录单元（有关特定硬件和软件设置的详细信息此前已有描述） 25）。用于固定吸液管的头部装置 电极应连接至放大器。一根已涂覆氯化银的银质接地导线- 插入腹部可获得更稳定的记录。原因是，如果体腔内的溶液未与培养皿中的灌流液接触，则与记录电极相关的液体仍保持接地状态。
  4. 将记录频率设置为 4 kHz。将电压刻度（y 轴）设为 500 mV（可根据需要调整以优化波形显示效果）。运行记录软件，以连续记录或示波器模式记录神经活动对刺激的响应。
  5. 在靠近A5的位置切断一条腹神经索连合，并将与A6相连的切断端放入吸电极中。务必抽吸生理盐水 将液体吸入吸电极内，以覆盖其中的银丝，然后再吸入神经。
  6. 用干燥的移液器向每个尾须上的刚毛吹气。观察刺激记录所用神经索同侧尾须上的刚毛是否比对侧产生不同的反应。记录刺激期间特定时间间隔内反应的幅度以及放电峰的数量。
  7. 将吸电极移至尾须神经以进行记录。若需更佳贴合，必要时可更换为开口较小的电极尖端。
  8. 在靠近A6处切断尾须神经，然后吸起通向尾须的神经。此时应可观察到动作电位的自发放电。接着，向尾须吹气，并记录其反应。

3. 电刺激感觉神经以确定募集情况

  1. 将记录软件切换至扫描模式，使其在每次刺激触发时记录轨迹（100-500毫秒）。
  2. 将刺激电极连接至刺激器的输出端。
  3. 将刺激器电缆与两个微型钩状导线或夹子连接。
  4. 将刺激器的BNC触发输出端连接至记录装置的触发输入端。
  5. 以下刺激参数应可引发反应：持续时间：0.3秒；延迟：10毫秒；频率：1赫兹；电压：根据需要调节，以在记录中获得信号（略高于阈值，并能获得最大反应）。无需将电压调至远高于最大阈值的水平进行募集，因为高电压可能对神经造成损伤。
  6. 尽可能远端切断尾须神经，以便将较长的神经根拉入刺激用的负压电极中（图7，箭头所示）。可使用第6腹节（A6）与第5腹节（A5）之间或更前方节段的联合神经。
  7. 设置记录用负压电极，使其能够将切断的联合神经拉入电极内。在吸入神经之前，务必向负压电极内吸入一些生理盐水 ，以覆盖内部的银丝。确保刺激电极也在浴槽的生理盐水中接地（理想位置为靠近A3节段的腹部区域）。
  8. 施加一系列电压逐渐增加的单次刺激，直至屏幕上出现动作电位。应记录下引发反应所需的最小刺激电压和持续时间。逐渐增加强度，直至在联合神经中观察到突触反应。首先出现的是来自大轴突的较大尖峰（细胞外动作电位），随后可能还会观察到其他较小的动作电位。

结果

气流吹拂尾须上的刚毛会引发初级感觉神经元的放电，可通过细胞外吸吮电极记录这些放电信号，电极可连接至腹部神经节之间的联合神经索，或直接连接至尾须神经本身（图8）。从这两个区域记录到的动作电位幅度约为几微伏至毫伏量级。由于神经节内存在感觉整合，从尾须神经记录到的复合动作电位或单个动作电位的数量显著多于在联合神经索中记录到的数量。但需注意，由于电极与神经组织之间的密封更紧密，在联合神经索处记录的信号噪声明显更少。

通过向尾须吹气，可在神经索中观察到较大的峰电位（图8A）。采用此种刺激方法，在A3与A4节段之间的神经索记录通常可观察到具有特征性的巨大神经元的大幅峰电位。当使用镊子摩擦尾须的同时记录尾须神经信号时，可记录到强烈的放电活动（图8B1）。在另一次记录中，两次短暂吹气均在尾须神经中引发快速的爆发性反应（图8B2）。当使用吸吮电极对尾须神经进行电刺激，并在A3与A4之间的神经索中记录信号时，可观察到诱发反应的刺激阈值（图8C1）。对尾须神经的电刺激可明确在神经索中引发可记录的反应，该反应可用于药理学试剂或局部环境因素（如温度）等干预性研究的定量分析（图8C2）。

显示尾须及与生物学研究相关的标记节段的蟑螂解剖图。
图 1. Periplaneta americana 具有完整的尾须。

龙虾解剖结构及消化道细节；显微图像突出显示内部构造。
图2. 腹面观蟑螂神经索（去除腹侧角质层后观察） (A). 箭头所标示区段的放大图显示于(B）。在（C）用玻璃探针将结缔组织在A4和A3之间分开。6th 腹部神经节如图所示（D）以及从尾端发出的两条尾须神经。

昆虫神经系统示意图；特征包括胸部神经节、腹部神经节、尾须神经。
图3. 蜚蠊神经索的腹面示意图。

昆虫解剖，用于解剖学研究的固定装置，生物研究，标本分析。
图 4. 将尾须向上置于生理盐水浴液之外。 可向打开的腹部灌注生理盐水（A），同时用一小块楔形硅胶弹性体垫高蜚蠊的尾端，以确保尾须保持在液面之上（B）。

甲壳类鳃部的显微镜图像，显示鳃丝结构；呼吸系统研究。
图5. 6th 腹部神经节与尾须神经（由箭头标出）。

在法拉第笼内的神经科学实验装置；包括显微镜、放大器和电极。
图6. 实验设备的设置。 点击此处查看大图。

电生理实验：昆虫神经纤维示意图上的记录电极和刺激电极。
图7. 刺激电极与记录电极的设置。

电生理波形分析；显示随时间变化的电压信号图，标尺为 1 mV 和 1 秒。
图 8. 采用不同刺激方法对神经连索和尾须神经进行的神经记录。 在尾须施加气流刺激的同时，使用吸吮电极从第三腹节（A3）与第四腹节（A4）之间的连索进行记录（A）。使用吸吮电极从初级尾须神经元记录时，无论是通过物理摩擦（B1）还是施加气流刺激（B2），均可在尾须神经中引发快速的放电活动。对尾须神经进行电刺激可在连索中诱发反应（C1）。注意刺激强度的逐步增加（箭头指示刺激伪迹的幅度）以及随后诱发反应强度的变化。对尾须神经进行电刺激可提供相对更可控的刺激方式，从而在量化反应时保证刺激的一致性（C2）。

讨论

展示这种经典制备技术的原因之一在于，尾须系统过去和现在都是研究神经回路发育以及突触修复与再生问题的活跃研究领域26-31。可通过任一方法在蟑螂腹神经索中诱发活动，以检测药理学试剂或杀虫剂对神经系统功能的影响。这些实验只需将神经活性化学物质溶解于生理盐水中即可进行。将该溶液替换原有的灌流液后，在记录神经索或运动神经的诱发活动或自发活动时，可观察到活动的变化，从而稳定地反映该化学物质对中枢神经系统功能的影响。

与所有神经生理学实验一样，常见的问题是电噪声干扰。对于这些制备而言，影响信号质量的最重要因素可能是吸吮电极与神经组织之间的密封性。理想的密封应紧密，但又不完全将尾须神经或神经连索吸入电极内。也可使用双钩状电极，将其置于腹神经索下方，并用矿物油与凡士林的混合物对腹神经索进行绝缘。该混合物可装入注射器中，然后挤出并环绕在神经索周围32。此外，精细的解剖操作在此类制备中与在任何中枢神经系统制备中同样关键。有些人可能发现通过解剖背侧表皮更易于接触中枢神经系统。虽然这种方法可降低损伤腹神经索的可能性，但采用此途径清除全部内脏组织可能更为困难。

此处未作描述，但该制备方法适用于巨大神经元的细胞内记录32,33。整个腹神经索也可被取出，以便同时放置多个记录和刺激电极。事实上，对触角叶、蘑菇体及其他前部中枢神经系统结构的探索仍在进行中34-35。尽管蟑螂中枢神经系统持续为现代神经生物学研究提供重要见解，但这种特定的制备方法足够简单，可用于本科生教学实验室。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢 Hyewon Cooper 提供插图。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
硅胶（Sylgard）Dow Corning182 硅胶套件182 硅橡胶弹性体套件
NaClSigma-AldrichS7653
KClSigma-AldrichP9333
CaCl2Sigma-AldrichC5670
NaH2PO4•2H2OSigma-Aldrich71505
Na2HPO4•7H2OSigma-AldrichS9390
NaOHSigma-Aldrich221465用于调节 pH
HClSigma-AldrichH1758用于调节 pH
材料名称
解剖工具World Precision Instruments混合装
昆虫针Fine Science Tools, Inc26001-60
解剖显微镜World Precision InstrumentsPZMIII-BS
玻璃电极Sigma-AldrichCLS7095B5X每盒 200 支，用于吸吮电极
显微操作器World Precision InstrumentsMD4-M3-R可固定于底座或金属杆上
银丝（10/1,000 英寸）A-M Systems782500
计算机任意厂商
交流/直流差分放大器A-M SystemsModel 3000
PowerLab 26Tfigure-materials-1 AD Instruments27T
前置放大头段figure-materials-2 AD Instruments随交流/直流放大器提供
LabChart7figure-materials-3 AD Instruments
电极导线任意厂商
玻璃工具自行制备用于神经操作
电缆与连接器任意厂商
带橡胶球的移液管Fisher Scientific13-711-7每盒 500 支
烧杯任意厂商
石蜡或油泥任意厂商或本地商店
刺激器Grass InstrumentsSD9 或 S88
吸吮电极用塑料尖端本地五金店（Watt's 品牌）¼ 英寸外径 × 0.170 英寸内径切成小段，在火焰上拉细，并修剪尖端至合适尺寸

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