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方法文章

移植嗅鞘细胞以评估外周神经损伤后的功能恢复

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DOI：

10.3791/50590

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2014年2月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

本文内容

摘要

嗅鞘细胞（OECs）是神经嵴细胞，能够支持初级嗅觉神经元的生长。这一特殊特性可用于细胞移植。本文介绍了一种基于在喉神经损伤模型中使用OECs的细胞移植模型。

摘要

嗅鞘细胞（OECs）是一类神经嵴细胞，能够促进初级嗅觉神经元的生长和再生。事实上，初级嗅觉系统具有生成新神经元的能力，即使在成年动物中也是如此。这种特殊能力部分归功于嗅鞘细胞的存在，它们为神经发生创造了有利的微环境。基于OECs的这一特性，人们已将其应用于细胞移植研究，例如在脊髓损伤模型中的应用。尽管周围神经系统在神经损伤后比中枢神经系统具有更强的再生能力，但完全切断神经会导致轴突再生过程中的错误连接，尤其是在面神经或喉上神经横断后。具体而言，喉返神经（RLN）的完全切断会引起异常的轴突再生，从而导致声带联带运动。在该特定模型中，我们证实了移植嗅鞘细胞可有效促进轴突的再生。

嗅鞘细胞（OECs）由存在于嗅黏膜（OM-OECs）和嗅球（OB-OECs）中的多个亚群组成。本文介绍了一种基于在喉返神经（RLN）损伤模型中使用这些不同OEC亚群的细胞移植模型。在此范式中，将OB-OECs和OM-OECs的原代培养物移植至Matrigel中，随后进行RLN的切断与吻合。术后两个月，我们通过视频喉镜检查、肌电图（EMG）和组织学研究等互补性分析对移植动物进行了评估。首先，视频喉镜检查使我们能够评估喉部功能，特别是肌肉共收缩现象。随后，肌电图分析揭示了肌肉活动的丰富性与同步性。最后，基于甲苯胺蓝染色的组织学研究实现了对有髓神经纤维数量和形态特征的定量分析。

综上所述，本文描述了在喉返神经横断-吻合术后，如何从嗅黏膜和嗅球中分离、培养、鉴定和移植嗅鞘细胞，并如何评估和分析这些移植细胞对轴突再生和喉部功能的促进效果。

引言

初级嗅觉系统由两个不同的部分组成：周围神经系统中的嗅黏膜（OM）和中枢神经系统中的嗅球（OB）。初级嗅觉系统的特点在于，哺乳动物物种的初级嗅觉神经元（PON）在其一生中具有自我更新的能力。这种能力得益于嗅黏膜中存在神经干细胞。从嗅黏膜到嗅球的初级嗅觉神经元的生长与再生由一类特殊的胶质细胞——嗅鞘细胞（OECs）所介导。OECs起源于神经嵴细胞，能够为初级嗅觉神经元从嗅黏膜至嗅球的神经发生过程创造有利的微环境1。因此，OECs可在嗅黏膜和嗅球中均被发现，并构成不同的细胞亚群2,3。由于OECs具有多种特性，科学家已将其用于多种神经系统损伤模型中的细胞移植研究4。事实上，OECs能够分泌生长因子，减少胶质瘢痕形成，促进轴突再生，并可自由地与星形胶质细胞混合5,6。然而，绝大多数相关研究集中于脊髓损伤（SCI）；仅有少数研究在周围神经损伤（PNI）后使用了OECs7,8。

尽管周围神经系统在神经损伤后具有很强的再生能力，但完全性断裂会导致轴突异常再生。事实上，在面神经或喉返神经（RLN）完全横断后，错位再生的轴突会引起肌肉共收缩现象，称为联带运动（synkinesis）。因此，建立一种周围神经损伤（PNI）模型至关重要，不仅可用于量化轴突再生情况，还可评估肌肉收缩的功能恢复效果。文献中描述最广泛的模型基于面神经损伤9,10。在此类模型中，功能评估主要依赖于触须运动的恢复情况10。然而，该方法难以准确评估运动的有效性，也难以区分肌肉共收缩现象。本文提出一种基于喉返神经（RLN）损伤的模型。该模型不仅可评估轴突再生和声带运动情况，还可评估细胞移植后这些运动的有效性和功能性11,12。本实验方案详细提供了从嗅黏膜（OM）和嗅球（OB）中分离培养嗅鞘细胞（OECs），并在喉返神经横断-吻合模型中进行移植的操作步骤，以及术后动物的评估方法。

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方案

1. 嗅黏膜和嗅球的原代培养

  1. 解剖前
    1. 配制50 ml培养基：加入44 ml无钙杜尔贝科改良伊格尔/汉姆F12培养基（DMEM/F12），添加5 ml胎牛血清（FBS）和1 ml青霉素/链霉素。
    2. 包被 75 cm2 含多聚-L-赖氨酸（50 μg/ml，1.5 μg/cm²）的培养瓶2），室温下1小时。
    3. 用1× PBS冲洗培养瓶。
    4. 将包被的培养瓶置于冰箱中，可保存长达1周。
  2. 解剖
    1. 安乐死的任何方法都必须事先获得机构动物护理与使用委员会的批准，并由合格人员实施。
    2. 选择近交系大鼠，例如Fischer大鼠。
    3. 在确认大鼠已通过戊巴比妥钠或其他注射类麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪）进入深度麻醉状态后，将其断头并去除皮肤。
    4. 从前往后打开颅骨。
    5. 去除嗅球时需小心避免损伤脑膜。
    6. 在同一只大鼠中，矢状切开鼻腔。
    7. 去除鼓膜时需注意避免损伤呼吸黏膜。注意鼓膜上皮因其黄褐色可被轻易识别。
    8. 关于OM解剖的更详细方案可参见先前的研究 视频实验杂志出版13.
  3. 培养
    1. 将OB置于含有0.1%胰蛋白酶的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，37 °C孵育45分钟。
    2. 将OM置于含有0.05%胶原酶A的HBSS中，37 °C孵育45分钟。
    3. 通过加入2 ml温热的培养基终止酶消化反应。
    4. 用培养基洗涤细胞，在300 × g下离心3分钟。
    5. 使用 P1000 移液器将 2 ml 培养基中的样品反复吹打，直至获得均一的细胞悬液。
    6. 将细胞接种于预先包被的培养瓶中（5-10 × 106 细胞/培养瓶）中加入 25 ml 温热的培养基。
    7. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育并培养细胞2.
    8. 每2天更换一半培养基。
    9. 6-8 天后 体外 通过流式细胞术或免疫细胞化学法检测小细胞样本中p75阳性细胞的比例，这些细胞在啮齿类动物中被认为是嗅鞘细胞（OECs）。在这些分析中，还可研究其他标志物，如GFAP和S100β。
  4. 流式细胞术分析
    1. 按照下文“细胞移植”（第2.2节）所述方法收集细胞。
    2. 在4 °C下用p75一抗（1:100）孵育15分钟。
    3. 用 2 ml PBS-EDTA 洗涤细胞，然后在 300 × g 下离心 3 分钟。
    4. 在4 °C避光孵育15分钟，加入PE标记的山羊抗小鼠二抗（1:200）。
    5. 用 2 ml PBS-EDTA 洗涤细胞，300 × g 离心 3 分钟。
    6. 用500 μl PBS-EDTA重悬细胞。
    7. 分析 10-30 x 103 使用流式细胞仪检测细胞。
  5. 免疫细胞化学分析
    1. 将细胞接种于6孔板中，该板需按照“培养”部分（下文1.1.2节）所述预先包被48小时。
    2. 用 PBS 洗涤细胞。
    3. 用4% PFA在室温下固定细胞15分钟。
    4. 用 PBS 洗涤细胞。
    5. 在室温下用 PBS/Triton X-100（0.1%）孵育细胞 15 分钟。
    6. 用 PBS 洗涤细胞。
    7. 将细胞与一抗（1:200）p75、S100β 和 GFAP 在 4 °C 下孵育过夜。
    8. 用 PBS 洗涤细胞。
    9. 在室温避光条件下，用二抗（1:500）孵育细胞1小时。
    10. 用 PBS 洗涤细胞。
    11. 在室温避光条件下，用 Hoechst 孵育细胞 10 分钟。
    12. 用 PBS 洗涤细胞。
    13. 使用荧光显微镜分析细胞。
  6. GFP标记细胞
    1. 移植前五天，用携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的慢病毒载体感染OB和OM培养物，感染复数为20，过夜感染。
    2. 移植前，取少量样品，按照前文“培养”部分（1.1 节）所述方法，通过流式细胞术检测 GFP 阳性细胞的比例。

2. 手术与移植

  1. 喉返神经吻合术
    1. 所有涉及动物的实验必须事先获得机构动物护理与使用委员会的批准，并由合格人员操作。
    2. 手术前将所有器械进行高压灭菌，并在整个手术过程中保持无菌状态。
    3. 通过腹腔注射盐酸氯胺酮（12.5 mg/kg）和盐酸氯丙嗪（0.625 mg/kg）对大鼠实施麻醉。术前通过夹捏足趾评估麻醉效果。
    4. 将大鼠置于仰卧位。
    5. 使用手术刀沿颈部正中线做一条长约2 cm的垂直皮肤切口。
    6. 沿正中白色筋膜线纵向切开甲状舌骨下肌群。
    7. 使用自动牵开器分离甲状舌骨下肌群，暴露喉部。
    8. 暴露喉返神经（RLN）。
    9. 在显微镜控制下，使用显微剪刀于第七气管环水平完全切断神经。
    10. 在显微镜下使用11.0缝线进行单点吻合。 该手术可导致喉部特异性运动神经去神经支配。
  2. 细胞移植
    1. 移植前，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C条件下消化5分钟，从培养皿中收集细胞。
    2. 加入2 ml预热的培养基以终止酶消化反应。
    3. 以300 × g离心3分钟。
    4. 在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数，并根据具体实验方案调整细胞浓度。本模型中，目标细胞浓度为在30 μl DMEM/F12培养基中含有1.2–6 × 106个细胞。
    5. 移植前，在1.5 ml离心管中配制DMEM/F12与Matrigel的1:2混合液（本实验中分别为30和60 μl），并置于冰上。 为避免非特异性效应，应使用不含生长因子的Matrigel。
    6. 移植前将离心管握于手中数秒，使Matrigel-培养基混合物升温至接近体温。
    7. 使用移液器将混合液滴加至神经吻合部位，静置直至混合物在损伤神经处自组装完成。
    8. 使用4.0缝线缝合肌肉和皮肤。
    9. 术后将大鼠单独饲养，并在加热灯下保温24小时。

3. 评估

  1. 喉镜检查
    1. 通过腹腔注射盐酸氯胺酮（12.5 mg/kg）和盐酸氯丙嗪（0.625 mg/kg）对大鼠进行麻醉。在继续实验方案前，通过夹捏足趾确认大鼠已处于麻醉状态。
    2. 将大鼠置于仰卧位。
    3. 插入已调整至能提供喉部最佳视野的30°视频喉镜。确定解剖标志，以便每次录音时重现相同的视野。
    4. 使用视频喉镜记录声带运动（每只动物5-10个序列）。为每只动物选取三个连续的最大内收和最大外展序列。
    5. 使用图像分析软件分析喉部功能。通过测量声带最大外展与最大内收运动之间的差值，确定绝对角度运动量。通过测量运动幅度确定动态评分。通过测量协同运动和矛盾运动确定功能评分。
  2. 肌电图（EMG）
    1. 将电极放置在大鼠的腘绳肌上以进行电隔离。
    2. 按照“喉返神经吻合”（第2.1节）中所述方法切开皮肤和肌肉，暴露喉部和气管。
    3. 暴露环甲软骨。
    4. 用显微剪刀切开环甲关节以暴露环后杓状肌（PCA 肌）。
    5. 将单极针电极（38 x 0.45 mm）插入PCA肌肉。
    6. 使用采集系统在自主呼吸期间记录PCA肌肉的电生理活动。
    7. 分析肌肉活动的丰富性及其与呼吸的同步性。分析肌电图（EMG）时，采用以下0-3分的定性评分标准：0分：节律紊乱的描记，吸气时无增强；1分：有节律的描记，吸气时活动增强，但信号稀疏（神经源性）；2分：有节律的描记，活动较丰富；3分：有节律的描记，活动非常丰富，形成干扰相，类似于最大自主收缩时的活动。
    8. 暴露迷走神经以测量潜伏期和动作电位持续时间。选择迷走神经作为刺激部位，是因为喉返神经因体积较小，在刺激过程中容易受损。
    9. 使用电极刺激迷走神经。
    10. 在PCA肌肉中记录电生理信号，测量潜伏期和动作电位持续时间。如有可能，使用数据采集模块（如Powerlab系统）记录肌肉活动、潜伏期及动作电位持续时间。
  3. 组织学
    1. 使用戊巴比妥钠过量实施安乐死。
    2. 在显微镜控制下切除喉返神经远端残端。喉返神经的远端部分定义为吻合口与喉之间的部分。注意，由于使用的是11.0号不可吸收缝线，术后数周仍可能找到吻合部位。
    3. 将喉返神经远端部分置于含0.1 M磷酸盐缓冲液（pH=7.3）的2%戊二醛溶液中，4 °C固定2小时。
    4. 仔细调整样本方向，以获得冠状切面。
    5. 用磷酸盐缓冲液洗涤样品。
    6. 切成较小片段（3-4 mm 长度），在 1% 卡可基酸盐缓冲的 OsO₄ 中室温后固定 60 分钟4 用乙醇脱水。
    7. 将样品置于硅胶模具中，用由POLYBED 812、DDSA和MNA组成的树脂包埋，并加入2%的加速剂BDMA。
    8. 使用 Pyramitome 超薄切片系统制备半薄横切面（1 μm 厚）。
    9. 在70 °C下，用含1%硼砂的0.1%甲苯胺蓝溶液染色75秒。
    10. 使用计数分析系统分析喉返神经（RLN）样本。计数神经纤维数量，并通过确定髓鞘的外边界和内边界来测量有髓神经纤维的轮廓。
  4. 移植
    1. 按“细胞移植”（第2.2节）中所述方法，准备细胞并进行移植。
    2. 分析
    3. 使用戊巴比妥过量实施安乐死。注意，动物固定可通过心脏内注射4%多聚甲醛（PFA）进行。
    4. 切除约2 cm的喉返神经（RLN），使用其近端和远端部分。
    5. 将RLN样本在液氮中固定。
    6. 将样品在 -80 °C 下保存。
    7. 使用冷冻切片机将样品纵向切片（厚度为10–20 μm）。
    8. 在荧光显微镜下分析样品以检测GFP阳性细胞。注意可使用抗GFP抗体以增强荧光信号，并用于共染色实验。

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结果

选择对照动物和再神经支配（切开/吻合）动物的图示，因为结果可能因进行的细胞移植类型（OM、OB 或 OM+OB）而异。

细胞培养
细胞迅速黏附于塑料表面，并分化为平行条带状分布的细胞，其形态呈细长形、锥形、三角形、多极形或 spindle-shaped（梭形）图1A 和 1B。8天后 体外 流式细胞术分析显示，p75阳性细胞的比例在原代OB培养中为71%，在原代OM培养中为13%图1C 和 1D).

细胞移植与手术
将细胞悬浮于基质胶-培养基混合物中，移植至吻合后的喉返神经（RLN）。喉返神经的吻合通过单点11.0缝线完成（图2）。

评估
喉部视频检查 移植术后两个月，通过喉部视频检查和肌电图分析喉部...

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讨论

本文介绍的技术使嗅鞘细胞（OECs）成为研究周围神经损伤模型中细胞移植的有用模型。细胞培养方案相对简单，易于操作。然而，手术操作，特别是喉返神经（RLN）的切断与吻合，需要丰富的经验，必须由具备资质的专业人员进行。

本方案中描述的操作步骤强调了为获得最佳结果而需重点关注的若干重要因素。首先，在分离嗅黏膜（OM）时，我们建议进行精细解剖，以仅获取嗅上皮组织，避免混入呼吸上皮。其次，在进行喉返神经（RLN）吻合时，我们建议仅使用11.0缝线进行单点缝合。第三，在评估过程中，确保所有实验动物的麻醉深度一致至关重要。特别是，过深的麻醉会降低喉镜视频检查期间声带运动的幅度。我们建议在完成检查后尽快移除喉镜，以避免动物发生窒息。在进行肌电图（EMG）记录时，由于后环杓肌（PCA）体积较小，我们建议谨慎放置单极针电极。最后，对于组织学研究，应仔细定向喉返神经样本，以获得冠状切面。同时，必须切除并分析喉返神经 发生华勒变性（Wallerian degeneration）的远端部分，这一点极为重要。

本文所述方案可轻松修改，以从嗅球（...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢ADIR（Aide à Domicile aux Insuffisants Respiratoires）和Fondation de l’Avenir提供的资金支持，并感谢Fanie Barnabé-Heider博士对稿件的编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/F12InvitrogenE3521T
FBSInvitrogenE3387M
青霉素/链霉素Invitrogen1152-8876
HBSSInvitrogenM3467Y
胰蛋白酶-EDTAInvitrogenM3513P
二甲胂酸钠Merck1.03256.0100
DDSABiovalley00563-450
MNABiovalley00886-450
BDMABiovalley00141-100
Polybed 812Biovalley08791-500
PE 抗小鼠 BD Bioscience550589
Matrigel GFRBD Bioscience356231
胶原酶 ARoche10103586001
小鼠抗 P75ChemiconMAB 365
11.0 规格缝合线EthiconFG 2881
甲苯胺蓝 Ral Diagnostics361590-0025
离心机SigmaSigma 2-16PK
培养箱 Thermo Scientific
超净工作台FasterBH-EN 2003 S
流式细胞仪BD BioscienceFACSCalibur
显微镜Zeiss
视频喉镜Karl Storz EndoskopeTelecam SL NLSC 20212120
数据采集系统AD InstrumentsPowerlab 系统
Pyramitome 超薄切片系统 LeicaUltracut S
图像分析系统Explora NovaMercator

参考文献

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