移植嗅鞘细胞以评估外周神经损伤后的功能恢复

摘要

嗅鞘细胞（OECs）是神经嵴细胞，能够支持初级嗅觉神经元的生长。这一特殊特性可用于细胞移植。本文介绍了一种基于在喉神经损伤模型中使用OECs的细胞移植模型。

摘要

嗅鞘细胞（OECs）是一类神经嵴细胞，能够促进初级嗅觉神经元的生长和再生。事实上，初级嗅觉系统具有生成新神经元的能力，即使在成年动物中也是如此。这种特殊能力部分归功于嗅鞘细胞的存在，它们为神经发生创造了有利的微环境。基于OECs的这一特性，人们已将其应用于细胞移植研究，例如在脊髓损伤模型中的应用。尽管周围神经系统在神经损伤后比中枢神经系统具有更强的再生能力，但完全切断神经会导致轴突再生过程中的错误连接，尤其是在面神经或喉上神经横断后。具体而言，喉返神经（RLN）的完全切断会引起异常的轴突再生，从而导致声带联带运动。在该特定模型中，我们证实了移植嗅鞘细胞可有效促进轴突的再生。

嗅鞘细胞（OECs）由存在于嗅黏膜（OM-OECs）和嗅球（OB-OECs）中的多个亚群组成。本文介绍了一种基于在喉返神经（RLN）损伤模型中使用这些不同OEC亚群的细胞移植模型。在此范式中，将OB-OECs和OM-OECs的原代培养物移植至Matrigel中，随后进行RLN的切断与吻合。术后两个月，我们通过视频喉镜检查、肌电图（EMG）和组织学研究等互补性分析对移植动物进行了评估。首先，视频喉镜检查使我们能够评估喉部功能，特别是肌肉共收缩现象。随后，肌电图分析揭示了肌肉活动的丰富性与同步性。最后，基于甲苯胺蓝染色的组织学研究实现了对有髓神经纤维数量和形态特征的定量分析。

综上所述，本文描述了在喉返神经横断-吻合术后，如何从嗅黏膜和嗅球中分离、培养、鉴定和移植嗅鞘细胞，并如何评估和分析这些移植细胞对轴突再生和喉部功能的促进效果。

引言

初级嗅觉系统由两个不同的部分组成：周围神经系统中的嗅黏膜（OM）和中枢神经系统中的嗅球（OB）。初级嗅觉系统的特点在于，哺乳动物物种的初级嗅觉神经元（PON）在其一生中具有自我更新的能力。这种能力得益于嗅黏膜中存在神经干细胞。从嗅黏膜到嗅球的初级嗅觉神经元的生长与再生由一类特殊的胶质细胞——嗅鞘细胞（OECs）所介导。OECs起源于神经嵴细胞，能够为初级嗅觉神经元从嗅黏膜至嗅球的神经发生过程创造有利的微环境¹。因此，OECs可在嗅黏膜和嗅球中均被发现，并构成不同的细胞亚群^2,3。由于OECs具有多种特性，科学家已将其用于多种神经系统损伤模型中的细胞移植研究⁴。事实上，OECs能够分泌生长因子，减少胶质瘢痕形成，促进轴突再生，并可自由地与星形胶质细胞混合^5,6。然而，绝大多数相关研究集中于脊髓损伤（SCI）；仅有少数研究在周围神经损伤（PNI）后使用了OECs^7,8。

尽管周围神经系统在神经损伤后具有很强的再生能力，但完全性断裂会导致轴突异常再生。事实上，在面神经或喉返神经（RLN）完全横断后，错位再生的轴突会引起肌肉共收缩现象，称为联带运动（synkinesis）。因此，建立一种周围神经损伤（PNI）模型至关重要，不仅可用于量化轴突再生情况，还可评估肌肉收缩的功能恢复效果。文献中描述最广泛的模型基于面神经损伤^9,10。在此类模型中，功能评估主要依....

方案

1. 嗅黏膜和嗅球的原代培养

1. 解剖前
   1. 配制50 ml培养基：加入44 ml无钙杜尔贝科改良伊格尔/汉姆F12培养基（DMEM/F12），添加5 ml胎牛血清（FBS）和1 ml青霉素/链霉素。
   2. 包被 75 cm² 含多聚-L-赖氨酸（50 μg/ml，1.5 μg/cm²）的培养瓶²），室温下1小时。
   3. 用1× PBS冲洗培养瓶。
   4. 将包被的培养瓶置于冰箱中，可保存长达1周。
2. 解剖
   1. 安乐死的任何方法都必须事先获得机构动物护理与使用委员会的批准，并由合格人员实施。
   2. 选择近交系大鼠，例如Fischer大鼠。
   3. 在确认大鼠已通过戊巴比妥钠或其他注射类麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪）进入深度麻醉状态后，将其断头并去除皮肤。
   4. 从前往后打开颅骨。
   5. 去除嗅球时需小心避免损伤脑膜。
   6. 在同一只大鼠中，矢状切开鼻腔。
   7. 去除鼓膜时需注意避免损伤呼吸黏膜。注意鼓膜上皮因其黄褐色可被轻易识别。
   8. 关于OM解剖的更详细方案可参见先前的研究

结果

选择对照动物和再神经支配（切开/吻合）动物的图示，因为结果可能因进行的细胞移植类型（OM、OB 或 OM+OB）而异。

细胞培养
细胞迅速黏附于塑料表面，并分化为平行条带状分布的细胞，其形态呈细长形、锥形、三角形、多极形或 spindle-shaped（梭形）图1A 和 1B。8天后 体外 流式细胞术分析显示，p75阳性细胞的比例在原代OB培养中为71%，在原代OM培养中为13%图1C 和 1D).

细胞移植与手术
将细胞悬浮于基质胶-培养基混合物中，移植至吻合后的喉返神经（RLN）。喉返神经的吻合通过单点11.0缝线完成（图2）。

评估
喉部视频检查 移植术后两个月，通过喉部视频检查和肌电图分析喉部.......

讨论

本文介绍的技术使嗅鞘细胞（OECs）成为研究周围神经损伤模型中细胞移植的有用模型。细胞培养方案相对简单，易于操作。然而，手术操作，特别是喉返神经（RLN）的切断与吻合，需要丰富的经验，必须由具备资质的专业人员进行。

本方案中描述的操作步骤强调了为获得最佳结果而需重点关注的若干重要因素。首先，在分离嗅黏膜（OM）时，我们建议进行精细解剖，以仅获取嗅上皮组织，避免混入呼吸上皮。其次，在进行喉返神经（RLN）吻合时，我们建议仅使用11.0缝线进行单点缝合。第三，在评估过程中，确保所有实验动物的麻醉深度一致至关重要。特别是，过深的麻醉会降低喉镜视频检查期间声带运动的幅度。我们建议在完成检查后尽快移除喉镜，以避免动物发生窒息。在进行肌电图（EMG）记录时，由于后环杓肌（PCA）体积较小，我们建议谨慎放置单极针电极。最后，对于组织学研究，应仔细定向喉返神经样本，以获得冠状切面。同时，必须切除并分析喉返神经 发生华勒变性（Wallerian degeneration）的远端部分，这一点极为重要。

本文所述方案可轻松修改，以从嗅球（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Invitrogen	E3521T
FBS	Invitrogen	E3387M
青霉素/链霉素	Invitrogen	1152-8876
HBSS	Invitrogen	M3467Y
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	M3513P
二甲胂酸钠	Merck	1.03256.0100
DDSA	Biovalley	00563-450
MNA	Biovalley	00886-450
BDMA	Biovalley	00141-100
Polybed 812	Biovalley	08791-500
PE 抗小鼠	BD Bioscience	550589
Matrigel GFR	BD Bioscience	356231
胶原酶 A	Roche	10103586001
小鼠抗 P75	Chemicon	MAB 365
11.0 规格缝合线	Ethicon	FG 2881
甲苯胺蓝	Ral Diagnostics	361590-0025
离心机	Sigma	Sigma 2-16PK
培养箱	Thermo Scientific
超净工作台	Faster	BH-EN 2003 S
流式细胞仪	BD Bioscience	FACSCalibur
显微镜	Zeiss
视频喉镜	Karl Storz Endoskope	Telecam SL NLSC 20212120
数据采集系统	AD Instruments	Powerlab 系统
Pyramitome 超薄切片系统	Leica	Ultracut S
图像分析系统	Explora Nova	Mercator