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基因操作在 Δku80 功能基因组学分析菌株 弓形虫（Toxoplasma gondii）

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DOI：

10.3791/50598

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2013年7月12日

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1Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

本文内容

摘要

本文报道了一种利用Toxoplasma gondii的I型和II型Δku80菌株高效构建靶向基因敲除和基因替换的方法，用于功能基因组学分析。

摘要

利用同源重组进行靶向遗传操作是功能基因组学分析的首选方法，可深入解析基因功能及表型。构建带有靶向基因缺失、靶向突变、基因功能互补和/或基因标记的突变菌株，为研究基因功能提供了强有力的策略，特别是当这些遗传操作能够通过双交换同源重组介导的整合，高效地靶向至目标基因位点时。

由于非同源重组频率极高，功能基因组学分析 弓形虫（Toxoplasma gondii） 由于缺乏将基因缺失和基因替换高效靶向特定遗传位点的方法，此前的研究受到限制。最近，我们消除了I型和II型菌株中非同源重组的主要途径 T. gondii 通过删除编码KU80蛋白的基因1,2。该 Δku80 毒力株在速殖子（急性）和缓殖子（慢性）阶段表现正常 体外 和 体内 且表现出近乎100%的同源重组频率。Δku80 菌株使得在单基因水平以及基因组水平上进行功能基因组学研究成为可能1-4.

本文报道了利用I型和II型Δku80Δhxgprt菌株在T. gondii中改进基因靶向技术的方法。我们概述了通过靶向插入或删除次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）可筛选标记，高效实现基因敲除、基因替换和基因标记的方法。所述基因靶向方案可在Δku80菌株中以多种方式应用，以促进寄生虫基因组的功能分析，并构建携带多个靶向遗传操作的单一菌株。该遗传学方法及其后续表型分析将揭示T. gondii以及相关重要人类病原体（如引起疟疾的Plasmodium sp.和引起隐孢子虫病的Cryptosporidium）生物学的基本且独特的特征。

引言

弓形虫（Toxoplasma gondii） 是一种常见的专性细胞内原虫寄生虫，可频繁且慢性地感染多种动物和人类5据估计，目前全球有超过10亿人长期慢性感染该病原体。除了该病原体所致疾病的重要性外 T. gondii 感染，实验工具的日益普及，强大的基因组学资源6，简便性 体外 生长和优秀的小鼠模型使得 T. gondii 研究真核细胞内病原体及其他重要顶复门寄生虫的领先模式系统，这些寄生虫可引起疟疾等严重疾病（疟原虫 sp.) 和隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）隐孢子虫)5,7一个显著的局限性是 弓形虫（Toxoplasma gondii） 作为一种模式生物，其面临的主要问题是携带特定基因操作的后代回收效率低下。这一基因靶向难题源于同源重组的频率较低，而相对于野生型菌株中极高的非同源重组频率而言尤为突出。 T. gondii 即使在遗传学研究中使用的DNA靶标分子提供了广泛的DNA同源性时2.

我们最近在I型和II型毒株中通过基因手段阻断了非同源重组的主要通路 刚地弓形虫 通过删除编码KU80蛋白的基因1,2. 所得的I型和II型Δku80 菌株在生长速率、大小和行为方面均表现正常 在 体外 和 体内 速殖子和缓殖子阶段期间 体外 和 体内然而，这些菌株几乎表现出100%的同源重组频率，该表型使获得目标基因操作所需后代的几率提高数百至数千倍1,2,4近期在群体范围内对I型和II型Δ的使用ku80 菌株显著加快了靶向遗传学方法的研究速度、拓展了研究种类，并提高了成功率 T. gondii1-4,8-13. 本文中，我们描述了一种在Δ菌株中进行靶向基因敲除、基因替换和基因标记的综合性实验方案。ku80 菌株 T. gondii. 我们展示了如何在 Δ 中针对特定基因或遗传位点设计并可靠地实施基因操作ku80 菌株的 弓形虫（Toxoplasma gondii）

方案

1. 基因靶向敲除目标基因

本方案旨在高效构建一种突变株，该突变株在特定基因位点上实现目标基因的敲除。本方案采用此前报道的T. gondii次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HXGPRT）可筛选标记，在使用霉酚酸和黄嘌呤（MPA + X）筛选后，实现安全且可靠的标记插入14-16。本方案使用一种经过验证且成本效益高的方法，基于酵母同源重组克隆技术构建DNA靶向分子17,18。目前已有多种商业化的替代方案可用于构建重组靶向分子，包括利用细菌同源重组克隆方法、体外同源重组克隆方法或融合PCR技术。下述方案在Δku80型T. gondii株中获得具有目标基因敲除的克隆寄生虫方面，提供了最高的整体效率与可靠性。

1.1 靶向DNA的制备

  1. 访问 ToxoDB6（http://www.toxodb.org）以获取目的基因（GOI）的基因组序列。

注意：基因组序列应从ToxoDB数据库中与所操作毒株最接近的I型、II型或III型基因组序列获取。例如：RH株使用GT1，Pru株使用ME49。

  1. 设计特异性重叠引物，用于扩增目的基因（GOI）的5'和3'基因组靶向侧翼区域，该引物需包含与酵母穿梭载体pRS416（或pRS426）具有33 bp重叠序列，并包含与筛选标记（HXGPRT）具有33 bp重叠序列（图1A-B）。在每对引物的5'和3'基因组靶向侧翼两端各添加一个独特的限制性酶切位点，该酶切位点应位于33 bp重叠序列与T. gondii特异性引物序列之间（图1A-B）。

注意： 酵母同源重组克隆需要超过 30 bp 的重叠序列才能高效进行。5' 和 3' 基因组靶向侧翼序列的设计目的是扩增长度在 800 至 1,400 bp 之间的特定 DNA 片段，以实现靶向缺失。需注意，在 Δku80Δhxgprt 背景下，较短的侧翼序列会显著降低靶向效率2。

  1. 使用引物 F1 和 R1 从基因组 DNA 中 PCR 扩增 5' 目标侧翼序列，使用引物 F2 和 R2 PCR 扩增 3' 目标侧翼序列（图 1A-C）3。同时，使用引物 HXF 和 HXR 从 HXGPRT cDNA pminiHXGPRT 载体14 中单独 PCR 扩增包含相应 5' 和 3' dhfr 侧翼区域的约 2 Kbp 的 HXPGRT 基因（图 1B-C）。

注意：使用待转染亲本菌株的基因组 DNA 扩增目标侧翼序列。

注意：将 HXGPRT 标记置于相对于 5' 和 3' DNA 靶向侧翼序列的正向位置，以便后续高效进行遗传操作，例如从被破坏的位点靶向移除 HXGPRT。

  1. 通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物大小的正确性，并使用琼脂糖凝胶标准品或其他DNA浓度测定方法估算DNA片段浓度。
  2. 按照Gietz和Schiestly17所述方法制备感受态酵母分装液。
  3. 将50 ng的5'基因组靶向侧翼序列、50 ng的3'基因组靶向侧翼序列、100 ng的HXGPRT筛选标记以及50 ng线性化的穿梭载体与无菌H2O混合，使终体积为10 - 20 μl。按照Gietz和Schiestly17所述方法，将上述三种PCR产物与酵母-E. coli穿梭载体共同转化至感受态酵母中，进行同源重组克隆。将转化后的酵母涂布于缺乏尿嘧啶的最低限度培养基琼脂平板上，在30 °C培养2 - 3天。

注意：质粒、5' 目标侧翼、HXGPRT 标记基因和 3' 目标侧翼的有序组装由 DNA 片段之间设计的 33 bp 重叠序列促进（图 1A-B），并通过酵母中的同源重组实现。

  1. 通过向缺乏尿嘧啶的平板中加入 2 ml 2x YPAD 并轻轻刮取，使菌落脱离但不破坏琼脂，收集酵母。将酵母溶液在 5,000 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
  2. 将酵母沉淀重悬于 250 μl 含有 RNaseA 的重悬缓冲液中，并向溶液中加入 50 - 100 μl 酸洗玻璃珠。在最高速度下涡旋振荡 5 分钟以破碎酵母细胞。
  3. 静置使玻璃珠沉降至管底，将上清液转移至 2 ml Eppendorf 管中。
  4. 使用质粒小提 DNA 提取试剂盒分离酵母 DNA，并将其重悬于约 100 μl 的最终体积中。
  5. 取 2 μl 酵母 DNA（约 50 ng）与 40 μl 冰上保存的 DH10B 电转化感受态 E. coli 混合。
  6. 将混合液转移至预冷的 2 mm 间隙电穿孔比色皿中，在 2.4 kV 和 129 Ω 条件下对细菌细胞进行电穿孔。
  7. 每支比色皿中加入 0.8 ml SOC 培养基以复苏细胞，并将溶液转移至 14 ml 带盖 Falcon 管中。在 37 °C 摇床培养 40 - 60 分钟。
  8. 将 E. coli 涂布于 2XYT + 氨苄青霉素（AMP）平板上，于 37 °C 过夜培养。
  9. 挑选约 6 - 8 个单菌落，在 3 ml 2XYT + AMP 培养基中于 37 °C 培养约 16 小时。
  10. 为每个 E. coli 克隆制备 30% 甘油冷冻保存液。
  11. 使用质粒小提试剂盒从 E. coli 克隆中提取质粒 pΔGOI，并将其重悬于约 100 μl 的最终体积中。
  12. 通过限制性内切酶酶切分析验证 pΔGOI，检测质粒 DNA 大小并确认预期的 pΔGOI DNA 条带模式。
  13. 通过 DNA 测序对 pΔGOI 的 5' 和 3' 基因组靶向侧翼序列进行最终验证，确保其 DNA 序列与 http://www.ToxoDB.org 中的基因组序列数据完全一致。

注意： 高度一致的序列同源性对于最大化基因靶向效率至关重要3，因为每一个碱基对的差异都会相应地缩短完全同源序列的长度。

注意：目前尚无基于Pru亲本株的II型Δku80菌株的基因组序列。本研究使用II型ME49菌株的基因组序列作为II型Δku80菌株的替代基因组。根据多个遗传位点的序列数据估计，ME49基因组与Pru基因组之间的单核苷酸多态性频率约为每10,000个核苷酸出现1个，或更低。

  1. 生成 >200 μg pΔGOI 原液，通过将经验证的甘油菌种接种至约 250 ml 2XYT + AMP 培养基中过夜培养获得 大肠杆菌 质粒小提克隆
  2. 使用质粒大提试剂盒从大量培养物中分离 pΔGOI 质粒 DNA，最终悬浮于约 1,000 μl 体积中。
  3. 重复限制性内切酶消化，或对pΔGOI质粒大提DNA进行DNA测序，以在转染前验证正确的靶向DNA分子。
  4. 使用位于5'靶标侧翼区内的特异性限制性内切酶X（RE.X）识别位点，将约15 μg的pΔGOI质粒在5'端进行线性化消化图1B).

注意：在T. gondii中进行基因靶向操作时，为在目标基因位点获得高效的靶向事件频率，至少需要约10 μg的靶向DNA2。

  1. 通过琼脂糖凝胶电泳或其它替代方法验证 pΔGOI 的线性化，并测定 DNA 浓度。

注意：如果在5'侧翼的限制性内切酶消化无法实现完全线性化，可使用设计的3'端唯一RE.Y消化位点作为pΔGOI线性化的替代位点。

注意：在 Δku80 菌株中，通过同源重组实现基因靶向时，一条完全线性化的靶向DNA分子至关重要。

  1. 通过在 68 °C 下孵育 15 - 20 分钟使限制性内切酶失活。
  2. 准备至少 15 μg 的线性化质粒，溶于 100 μl 无菌 H2O 中。将线性化的 pΔGOI 储存于 -20 °C，直至转染时使用。

1.2 T. gondii 寄生虫的制备、转染、筛选、亚克隆、验证、基因改造菌株的保存与维持

描述了在人包皮成纤维细胞（HFF）中培养和操作T. gondii的通用方法19-21。Δku80Δhxgprt菌株在寄生虫感染培养基（添加1%胎牛血清（FBS）和1%抗真菌-抗生素（来自100倍浓缩液）的Eagles最低必需培养基（EMEM））中能够正常复制1,2。所有涉及Toxoplasma gondii的操作必须采用生物安全二级（BSL-2）规程进行。T. gondii RHΔku802亲本菌株由Roos实验室提供的RHΔhxgprt菌株构建而成14。PruΔku801亲本菌株则由PruΔhxgprt（Prugniaud菌株BSG-422）构建，该菌株稳定整合了CAT可筛选标记，并携带一个在缓殖子阶段特异性启动子LDH2调控下的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。

  1. 将1 × 106个具有活力的I型RH Δku80Δhxgprt弓形虫接种至一个含有汇合人胎儿成纤维（HFF）细胞的25 cm2培养瓶中，或分别将2 × 106个具有活力的II型Prugniaud（Pru）Δku80Δhxgprt弓形虫接种至两个25 cm2培养瓶中。

注意： 活性寄生虫定义为刚从宿主细胞裂解释放到胞外的寄生虫。

注意：该比例可提供足够数量的活性寄生虫，用于三次转染实验。

  1. 在感染后约 68 - 72 小时检查 Δku80Δhxgprt 感染的培养物。确认存在活的寄生虫以及约 90 - 95% 的 HFF 细胞发生裂解，以确定转染的精确时间。

注意： 分离新逸出的寄生虫对于本实验方案的成功至关重要，因为寄生虫活力低下会完全消除基因靶向效率。

  1. 通过盖紧25 cm2培养瓶的塞盖，用力前后摇晃培养瓶，使有活力的寄生虫悬浮于溶液中，注意避免液体溅到瓶盖内侧或瓶口处，同时将寄生虫从生长表面充分振落。

注意：对于 I 型或 II 型 Δku80 虫株，寄生虫收获无需使用注射器-针头释放方案。

  1. 将寄生虫溶液转移至连接滤器装置的10 ml注射器中，该装置内含一个3 μm的膜，并将滤器单元置于一个开口的15 ml螺口离心管上方。通过注射器过滤将寄生虫滤入15 ml螺口离心管中。

注意：通过膜过滤寄生虫可去除感染的细胞和细胞碎片。

  1. 使用血细胞计数板测定寄生虫浓度（每毫升速殖子数量）。

注意： 可选：使用寄生虫溶液建立蚀斑形成单位（PFU）检测21，7 - 8 天后读取结果，以确定转染寄生虫具有足够的活力（PFU 与速殖子的比例 ≥0.2）。

  1. 在1400 × g下离心7分钟以沉淀寄生虫，用移液器吸除上清液至剩余约0.4 ml，注意不要扰动寄生虫沉淀。再在1400 × g下离心2分钟，吸除剩余上清液至约0.01 ml，注意不要扰动寄生虫沉淀。
  2. 轻轻弹击离心管底部使寄生虫沉淀重悬，立即加入电穿孔缓冲液（cytomix23，1.33倍浓度），使寄生虫在cytomix中的浓度达到4 - 5 × 107 个/ml。

注意：在细胞混合液中省略添加ATP和谷胱甘肽，因为这些成分的加入并不能提高基因靶向的效率。

  1. 将方案1.1（步骤26）中线性化的pΔGOI质粒100 μl分装样品解冻。
  2. 将0.3 ml寄生虫细胞混合液（约含1.3 - 1.6 × 107个寄生虫）转移至方案1.1（步骤26）中线性化的100 μl pΔGOI质粒中，并立即将全部0.4 ml寄生虫+pΔGOI混合物转移至预冷的2 mm间隙电穿孔比色皿中。
  3. 在1.4 kV和24 Ω条件下对寄生虫进行电穿孔。
  4. 将转染用比色皿在室温下静置约5分钟，然后将其中全部内容物转移至含有汇合人包皮成纤维细胞（HFF）及30 ml感染培养基的150 cm2培养瓶中，于37°C孵育过夜。
  5. 转染后约20小时开始使用霉酚酸联合黄嘌呤（MPA + X）进行筛选（图2A），方法是将感染培养基更换为含霉酚酸（25 μg/ml）和黄嘌呤（50 μg/ml）的选择性培养基。

注意：请勿扰动正在孵育的 MPA + X 筛选瓶。

  1. 转染后约8天，通过肉眼观察单层细胞，估算MPA + X筛选瓶中PFU的总数。通过光学显微镜确认PFU的形成情况以及感染区域的健康状态。

注意：如果第8天仍不可见噬斑，则需继续维持筛选并监测感染迹象，因为突变株的复制速率可能降低。

注意： Δku80Δhxgprt 寄生虫株系的非靶向性意外事件背景极低，因此能够成功分离出具有较严重但非致死性生长缺陷的突变株系。如果某个基因为必需基因而无法被删除，则在筛选过程中，初始转染或后续传代的寄生虫群体可能会表现出表型：随着群体逐渐趋于靶向敲除，寄生虫停止复制。

  1. 按照步骤3的方法振荡锥形瓶，使细胞单层上松脱的胞外寄生虫（在可见蚀斑形成后）释放，以制备寄生虫溶液。从MPA + X筛选锥形瓶中转移约0.5 ml寄生虫溶液至一个含有融合人包皮成纤维细胞（HFF）的25 cm2 MPA + X筛选锥形瓶中（将此培养物记为传代1A）。
  2. 约3天后，从原始的150 cm2 MPA + X筛选锥形瓶中松脱寄生虫，并转移约0.5 ml寄生虫溶液至第二个含有融合HFF细胞的25 cm2 MPA + X筛选锥形瓶中（将此培养物记为传代1B）。
  3. 在传代1A和/或传代1B锥形瓶中培养约5天，使感染区域得以发展。通过光学显微镜观察，确认传代1A和1B锥形瓶中至少含有25个具有健康感染区域的可存活PFU。
  4. 选择传代1A或传代1B锥形瓶之一，继续在25 cm2锥形瓶中使用MPA + X筛选培养基进行传代培养。保持在MPA + X筛选条件下持续传代。

注意：在亚克隆之前，必须将寄生虫培养足够多的世代，以从群体中清除未整合的持续存在的附加体质粒。对于 I 型 RH Δku80Δhxgprt 寄生虫，转染后至少 20 天内不得进行亚克隆；对于 II 型 Pru Δku80Δhxgprt 寄生虫，转染后至少 25 天内不得进行亚克隆，以确保有足够时间稀释未整合的附加体质粒1,2。

  1. 将寄生虫亚克隆至含有汇合HFF细胞的96孔板中，培养基为含MPA和X的选择性培养基。分别制备两块培养板：一块的寄生虫浓度为每孔1个，另一块的浓度为每孔2个寄生虫。

注意：在子代寄生虫最近裂解后（25 cm2 培养瓶中约 90 - 95% 的 HFF 细胞已裂解）进行亚克隆，以确保寄生虫具有较高的活力。

注意： 通过测量在筛选群体中成功靶向的寄生虫以高频率出现的速度，确定了转染后进行亚克隆的最佳时间窗口1。

  1. 使用每周传代方案，将转染寄生虫的原代群体在 MPA + X 筛选培养基中继续传代，每次用 10 μl 寄生虫溶液感染一个 25 cm2 的 HFF 培养瓶。

注意：如果在第18步的首次亚克隆中未能获得携带目标基因缺失（敲除）的克隆，则应从转染后约10至12周持续培养的虫体群体中重新进行亚克隆。

注意：无法获得基因敲除的一个原因是部分 pΔGOI 质粒存在附加体持续现象。附加体持续性由 5' 和 3' 基因组靶向侧翼序列所决定，似乎并非由 HXGPRT 遗传元件引起。约有 5 - 10% 的靶向质粒表现出显著的附加体持续性，因此需要延迟亚克隆时间，使寄生虫群体经历足够多的世代，以稀释持续存在的附加体，并使群体主要转变为稳定整合子。

  1. 亚克隆后6-7天（I型弓形虫）或7-8天（II型弓形虫），在显微镜下（40倍或60倍物镜）观察96孔板，筛选出仅含有单个空斑形成单位（PFU）的孔，表现为单一感染区域。在96孔板盖上对应位置标记一个小点，以标示该孔中PFU的位置。
  2. 使用设定为50 μl（配200 μl吸头）的移液器，将含有单个PFU的各孔中的液体反复吹打，使液流经过PFU区域，从而将虫体分散至整个孔中。

注意： 混匀会加速裂殖体对HFF单层细胞的裂解。I型RH株在混匀后约4天裂解整个孔，II型Pru株在混匀后约5天裂解整个孔。

  1. 选择十几个已裂解的孔（克隆），使用0.5 - 10 μl枪头在这些裂解孔底部轻轻刮擦，同时吸取6 μl寄生虫溶液。将6 μl寄生虫溶液转移至24孔板中的一个孔，该孔内含有在1 ml MPA + X选择培养基中已达到汇合状态的HFF细胞。

注意：必须刮擦孔板底部，以确保移液器吸头的开口始终与位于孔板底部的寄生虫保持接触。

  1. 观察 24 孔板中 HFF 细胞的裂解情况。

注意： I 型 RH 寄生虫通常在 24 孔板中约 4 天裂解孔内细胞。II 型 Pru 寄生虫通常在约 5 天内裂解孔内细胞。

  1. 从24孔板每个孔的底部刮取2 μl可存活的寄生虫溶液，转移至新的24孔板中相应的孔内，新孔中已含有汇合的HFF细胞和每孔1 ml的MPA+X筛选培养基。

注意： 所有寄生虫克隆和品系均可通过在此24孔板中每7天传代2 μl活性寄生虫溶液的方式进行持续培养。

  1. 在传代后约 18 小时，通过光学显微镜目视检查，确认寄生虫是否已成功转移至新的 24 孔板。
  2. 使用 1 ml 或 10 ml 移液器，从第 23–24 步的裂解孔中收集寄生虫，并将寄生虫溶液转移至离心管中。
  3. 在 1,400 × g 条件下离心 7 分钟以沉淀寄生虫，用 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，再在 1,400 × g 条件下离心 3 分钟。
  4. 吸除 PBS，向沉淀中加入 200 μl PBS 重悬寄生虫。将寄生虫溶液在 -80 °C 冻存，直至进行 DNA 提取。
  5. 使用组织 DNA 提取微量试剂盒，从每个克隆中提取寄生虫 DNA。
  6. 使用验证引物通过 PCR 验证靶基因的删除（敲除）（图 2A-C）。检测目的基因功能编码区的缺失，并使用上游 CxF 和下游 CxR 基因组 DNA 引物（图 2A-B）检测跨越基因组靶向侧翼区域及 HXGPRT 的 PCR 产物，以证实 HXGPRT 基因已正确整合至靶基因位点的 5' 和 3' 端。

注意：用于验证的引物必须针对目标基因具有特异性，否则可能得到假阳性结果。可通过在 http://www.toxodb.org 上将引物序列与基因组进行比对（blast），以验证引物的特异性。

  1. 按照第24步所述，每周定期传代寄生虫克隆。一旦确认目标基因缺失已成功验证，可选择性地继续在MPA+X培养基中进行筛选。
  2. 通过制备冻存液来保存寄生虫克隆。从25 cm2培养瓶中裂解的HFF细胞释放的胞外寄生虫中收集虫体，离心成团后弃去培养基，用细胞冻存液轻轻重悬寄生虫沉淀，使寄生虫浓度达到>4 × 107 个寄生虫/mL。分装至冻存管中，可长期保存于液氮或-80 °C条件下。

2. 删除HXGPRT

本方案旨在从基因改造的Δku80菌株基因组中已整合位点处移除HXGPRT标记基因。移除HXGPRT可实现标记基因的回收，并仅通过基于HXGPRT1-3的筛选即可构建携带多个遗传修饰的菌株。尽管下文详述的方案描述了重新靶向某一基因座以删除HXGPRT的方法，但需注意，在目标基因座处移除HXGPRT的同时，也可实现野生型基因的重新整合（互补）、突变基因的重新整合，以及带标签基因的重新整合（如N端或C端GFP、HA标签等），从而支持多种遗传操作。利用6-硫代黄嘌呤筛选进行作用机制24及靶向操作的方案此前已有报道1-3,15。

2.1 删除 HXGPRT

  1. 切除 HXGPRT 通过使用限制性内切酶Z（RE.Z）在pΔGOI两侧独特的限制性酶切位点进行酶切，切除选择性标记 HXGPRT (图1B).
  2. 通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA的完全消化。从琼脂糖凝胶中分离出两条条带中较大的一条。

注意： 两条条带中较大的一条包含质粒以及5'和3'端DNA靶向侧翼序列，但不包含HXGPRT基因。

  1. 将含有较大DNA条带的琼脂糖凝胶片段置于离心柱中，使凝胶平放在膜上。在室温下以13,000 × g 离心4分钟。向流出液中加入无菌H2O，使总体积达到100 μl。

注意： 还有其他商业方法可用于从琼脂糖中分离DNA。

  1. 通过乙醇沉淀浓缩DNA，并将DNA重悬于18 μl无菌H2O中。
  2. 取1 μl浓缩DNA与7 ml H2O、1 μl 10×连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶（5单位）混合，于4 °C过夜孵育，以构建pΔGOIc（pΔGOIclean）（图3A）。

注意：在此步骤中，可设计并加入含有RE.Z DNA末端的DNA片段，以构建适用于野生型基因靶向重新整合（互补）、突变基因靶向重新整合以及带标签基因靶向重新整合（N端或C端GFP、HA标签等）的质粒。

  1. 电穿孔前，用无菌 H2O 将反应体系稀释 2 倍。
  2. 按照方案 1.1 中的方法将 pΔGOIc 转化至 E. coli，用于亚克隆、分离并验证靶向质粒。随后线性化 pΔGOIc，为转染做准备（见步骤 1.1.11 至 1.1.26）。
  3. 重复方案 1.2（步骤 1 至 11）中所述的寄生虫转染流程。

注意：在执行步骤1至8之前，需验证在突变株中靶向去除HXGPRT的可行性。使用6-硫代黄嘌呤（6TX）筛选培养基（含200 μg/ml 6TX的感染培养基），将1×106个速殖子感染接种于一个150 cm2的汇合HFF细胞培养瓶中，并将该培养瓶用于PFU测定。8天后观察培养瓶，确认无（或极少；<10）PFU可见，此结果至关重要，用以证明潜在的基因靶向效率将超过突变株自发回复为HXGPRT表达降低表型（即6TX抗性表型）的可能性。

注意： 大约 5 - 10% 的 HXGPRT 整合位点表现出显著且自发的 6TX 抗性频率，尽管 HXGPRT 标记仍整合在靶向位点（参见代表性结果部分以了解解释）。

  1. 转染后约 20 小时开始 6TX 筛选，将 150 cm2 培养瓶中的培养基更换为 6TX 筛选培养基。

注意： 转染后约 10 天内不要扰动锥形瓶。

  1. 转染后第10至12天（I型寄生虫）或转染后第10至16天（II型寄生虫）观察培养瓶中蚀斑形成单位（PFU）的形成情况。

注意：针对删除HXGPRT基因的寄生虫，在HXGPRT基因和mRNA被删除且残余的HXGPRT蛋白失活之前，不会在6TX筛选条件下开始生长。

  1. 轻轻摇动筛选培养瓶以制成寄生虫溶液，取 0.5 - 1.0 ml 该溶液转移至含有融合 HFF 细胞和 5 ml 6TX 筛选培养基的新 25 cm2 培养瓶中。在接下来的两天内，每天从最初的 150 cm2 培养瓶重复此转移操作至新的 25 cm2 培养瓶一次。

注意： 多次取样可提高捕获已丢失HXGPRT基因的可存活靶向寄生虫的几率。

  1. 感染后约5天检查25 cm2 培养瓶，确认是否存在正在发育的蚀斑形成单位（PFUs）以及健康增殖寄生虫区域。挑选一个或两个含有感染区域的培养瓶。

注意：缺失HXGPRT基因的寄生虫在6TX筛选条件下能够以正常的生长速率进行复制。

  1. 继续在6TX选择培养基中传代寄生虫。
  2. 在筛选25至30天后对寄生虫群体进行亚克隆。设置一个96孔板，每孔约含1个寄生虫，另设一个每孔约含2个寄生虫的96孔板。
  3. 从分离的克隆中提取寄生虫DNA，并按照方案1.2（步骤19至29）将克隆维持在24孔板培养体系中。
  4. 采用图3A-B中所述的策略，通过PCR验证HXGPRT基因的缺失。

3. 蛋白质的C端标记

本方案旨在通过同源重组双交换机制，将标签靶向整合至基因组基因位点，从而实现对蛋白质的C端标记，并采用MPA + X筛选2,4。该方案效率较高，原因是HXGPRT标记基因的5' dhfr序列已被充分验证，可作为其他基因功能完整的3'非翻译区2,4。

3.1 在内源性基因位点对蛋白质进行C端直接标记

  1. 使用酵母同源重组克隆方法（图4）及方案1.1中所述方法，构建靶向pΔGOItag质粒。5'基因组靶向侧翼包含目的基因（GOI）编码区（或基因组DNA）的最后800至1,200 bp序列，但终止密码子需移至所选标签（如HA标签、Myc标签、His标签等）的3'端位置。
  2. 根据图示策略（图4），按照方案1.1和1.2的步骤，在蛋白编码基因的内源位点实现C端标签的靶向插入。
  3. 采用PCR策略，验证C端标签在内源基因位点的正确插入。
  4. 利用方案1和方案2中所述方法，对基因位点进行再次靶向，以删除HXGPRT筛选标记，从而获得精确调控的内源基因位点，该位点表达带标签的蛋白。本方案还可回收HXGPRT筛选标记，用于在已标记菌株中靶向其他位点（见方案1）。

结果

提供了一个详细的模板，用于构建靶向质粒以删除基因，包括限制性内切酶位点的设置、用于促进基因靶向及验证基因靶向的引物设计，以及用于后续单步删除HXGPRT的质粒构建（图1A-C、图2A、图3A）。展示了靶向基因敲除的通用示意图（图2A），用于验证基因敲除的引物对（例如I型rop18）（图2B），以及PCR验证的代表性结果（图2C）。展示该代表性结果旨在说明在相对难以靶向的基因位点可能获得的结果范围。成功的靶向基因敲除将表现为：目的基因PCR产物缺失（PCR1），3'基因组靶向侧翼序列存在（PCR2），以及在定义基因缺失区域的5'和3'基因组靶向侧翼之间正确整合的HXGPRT筛选标记存在（PCR3和PCR4）。克隆3、4、5、6、8、9和11为经验证的靶向基因敲除（knockouts），其中HXGPRT已取代目标基因（GOI）（图2C）。

不含基因缺失的克隆可能表现出多种条带模式。通常，无基因缺失的克隆会呈现与亲本菌株相同的条带模式（即“亲本模式”），在PCR1和PCR2中可观察到条带，但在PCR3和PCR4中无条带，如克隆1和2所示（图2C）。这种“亲本模式”可能由几种潜在机制导致。偶尔，MPA抗性筛选出的寄生虫携带未整合的持续性附加体质粒（pΔGOI靶向质粒），值得注意的是，持续筛选通常会促使这些附加体质粒发生整合。我们还在I型Δku80菌株中观察到一些罕见的背景信号，这是由于pΔGOI靶向质粒意外整合所致；该质粒含有通过DHFR 5'和3'启动子元件表达的HXGPRT cDNA，可能整合至DHFR位点或部分缺失的HXGPRT位点14。尽管这种罕见事件属于靶向整合，但并非预期的整合方式，因此在设计任何基因替换策略时需特别注意。若pΔGOI靶向质粒携带超过120 bp的DNA同源序列，则在Δku80菌株中可能提供其他重组位点2，从而导致非预期的背景信号。在II型Pru Δku80菌株中，由于HXGPRT筛选标记基于I型序列，而该序列与II型DNA之间存在核苷酸多态性，因此该背景信号相较于I型显著减少甚至不存在，这极大降低了使用II型Pru Δku80菌株实验中的罕见背景干扰1。如果目标基因位点为必需基因（无法被删除），或该位点的基因靶向频率极低，或持续存在的[未整合]附加体质粒难以通过培养和筛选清除，则MPA抗性克隆中将主要表现为亲本模式。另一种情况是，靶向DNA分子有时仅在基因组5'或3'靶向侧翼发生整合，此时PCR3或PCR4中仅有一个出现条带，同时PCR1和PCR2也出现条带，如克隆10（5'端整合）和克隆7（3'端整合）所示（图2C）。这些模式提示靶向质粒在该位点发生了罕见的单交换整合，导致HXGPRT被整合，但目标基因并未被删除。该模式（图2C中第7和10泳道）强调了报告PCR数据的重要性，以确认发生了预期的靶向整合，而非仅发生一次同源单交换以及靶向分子的第二次非同源整合。极少数情况下，我们观察到由克隆12所示的遗传混合模式（图2C），其同时表现出亲本模式和靶向缺失模式。这种模式很可能源于克隆孔中同一位置共存的两种不同基因型的寄生虫。

去除的通用示意图 HXGPRT 从 Δku80Δgoi::HXGPRT 删除 HXGPRT 来自该菌株的结果如图所示（图 3A）。用于验证移除效果的引物对 HXGPRT 来自 Δku80Δgra2::HXGPRT (图3B） 在PCR5中扩增出一条独特的约1.2 Kbp条带，如克隆4、7、9、11和12所示（图3C）。如果 HXGPRT 未从位点移除时，可观察到一条约 3.4 Kbp 的条带（克隆 1、2、3、6、8、10 及亲本对照）。多种机制共同作用以实现移除 HXGPRT （6TX筛选）比整合更加困难且效率更低 HXGPRT （MPA + X 筛选）。MPA 筛选比 6TX 筛选更高效14,16此外，较高水平的 HXGPRT 6TX 筛选所需的表达量比 MPA 筛选更高16,24因此，可能降低 HXGPRT 酶活性、突变或表观遗传改变导致表达水平降低 HXGPRT 在基因位点处的突变可能会完全消除6TX筛选的有效性。尽管存在这些6TX筛选的挑战，6TX筛选在Δ中的成功率仍然ku80 首次尝试时，菌株的成功率超过90%1-3.

一种用于对蛋白质编码基因进行C端直接标记的通用方案如图4所示（图4）。该方案通过同源重组在标记基因的3'端发生双交换，直接整合HXGPRT，并采用与上述类似的验证策略。当怀疑某一基因为必需基因时，可通过使用独立分离的靶向DNA质粒进行第二次转染来验证。此外，也可采用其他方法（如基因表达调控方案）进一步验证某基因是否为必需基因25。

带有pRS416质粒、HxGPRT基因、引物和PCR分析序列表格的基因编辑示意图。
图1. 靶向DNA质粒设计概览。A. 设计重叠引物的示意图，用于通过PCR扩增5'和3'靶向侧翼序列，其两端分别含有33 bp的重叠序列，可与pRS416穿梭载体和HXGPRT微型基因盒连接。图中所示引物用于生成pΔROP1810. 的5'和3'靶向侧翼序列。B. 靶向DNA分子设计的整体策略。pΔGOI的骨架为pRS416穿梭载体，含有尿嘧啶（URA）和氨苄青霉素（AMP）筛选标记。插入pRS416中的包括：一段约1 Kbp的5' DNA靶向侧翼序列，通过F1和R1引物从基因组DNA中扩增而来，其两端含有与HXGPRT微型基因盒和pRS416匹配的重叠序列；一段约1 Kbp的3' DNA靶向侧翼序列，通过F2和R2引物从基因组DNA中扩增而来，其两端也含有与HXGPRT微型基因盒和pRS416匹配的重叠序列；以及HXGPRT微型基因盒。以下独特的限制性内切酶识别位点被添加至引物中：F1引物中加入RE.X（限制性内切酶X识别位点），用于在5' DNA靶向侧翼序列的5'端切割质粒；R2引物中加入RE.Y，用于在3' DNA靶向侧翼序列的3'端切割质粒；R1和F2引物中加入RE.Z，用于切除HXGPRT微型基因盒。C. 用于构建敲除rop18靶向载体的引物序列。加粗区域对应T. gondii基因组序列，非加粗区域对应限制性内切酶位点以及与pRS416和HXGPRT微型基因盒重叠的序列。HX_F和HX_R引物对用于扩增HXGPRT微型基因盒14。所有引物序列按5'至3'方向书写。表格改编自Fentress et al10。 点击此处查看大图。

使用 PCR 过程、引物和凝胶电泳结果进行 DNA 分析的基因编辑示意图。
图 2. 使用 HXGPRT 删除基因的实验流程概览。A. 在 Δku80Δhxgprt 菌株中，通过同源双交换重组事件，利用质粒 pΔGOI 上约 1 Kbp 的 5' DNA 目标侧翼区和约 1 Kbp 的 3' DNA 目标侧翼区实现目的基因（GOI）的破坏。图中展示了 PCR 验证策略（未按比例），使用 PCR1、PCR2、PCR3 和 PCR4 引物组合，用于基因型验证，以确认 HXGPRT 的靶向整合及 GOI 位点的缺失。 B. 用于验证 rop18 基因缺失的代表性引物对。ROP18_DF 和 ROP18_DR 扩增 PCR1，ROP18_ExF 和 ROP18_CxR 扩增 PCR2，ROP18_CxF 和 DHFR_CxR 扩增 PCR3，DHFR_CxF 和 ROP18_CxR 扩增 PCR4（参见 图 2A）。所有引物序列方向均为 5' 至 3'。表格改编自 Fentress et al10。 C. 使用 HXGPRT 验证靶向基因缺失（rop18）的代表性结果。将质粒 pΔROP18 转染至 Δku80Δhxgprt 菌株，并在 MPA+X 培养基中筛选获得抗性克隆后，对其进行 rop18 缺失检测。亲本菌株对照显示 PCR1（约 400 bp）和 PCR2（约 650 bp）扩增产物为阳性，而 PCR3（约 1,200 bp）和 PCR4（约 1,300 bp）扩增产物为阴性。靶向基因敲除成功的克隆表现为 PCR2、PCR3 和 PCR4 产物阳性，而 PCR1 产物为阴性（参见 图 2A）。图中显示了 PCR1 和 PCR2（上图）、PCR3（中图）和 PCR4（下图）的代表性电泳结果。克隆 3、4、5、6、8、9 和 11 显示出正确的 PCR1、PCR2、PCR3 和 PCR4 条带模式，表明该克隆中发生了靶向基因缺失事件。克隆 1、2、7、10 和 12 并非基因缺失，代表其他可能的非特异性结果。（C = 亲本对照菌株 Δku80Δhxgprt，M = 分子量标记）。 点击此处查看高清图像。

PCR、侧翼序列和凝胶电泳结果的基因修饰过程示意图。
图3. 将目标基因重新靶向以删除HXGPRT的实验方案概览。A. 利用约1 Kbp的5' DNA靶向侧翼序列和约1 Kbp的3' DNA靶向侧翼序列，在菌株Δku80Δgoi::HXGPRT中通过双交换同源重组事件移除HXGPRT可筛选标记的策略，该侧翼序列位于质粒pΔGOIc上。图中展示了用于基因型验证的PCR策略，使用一对引物扩增跨越缺失区域的PCR产物（PCR5）（未按比例绘制）。B. 设计用于验证从菌株Δku80Δgra2::HXGPRT的gra2位点移除HXGPRT可筛选标记的一对代表性引物。引物GRA2_CLF和GRA2_CxR用于扩增PCR5。引物序列方向为5'至3'。C. 将质粒pΔGOIc转染至Δku80Δgoi::HXGPRT菌株并在6TX中筛选后，可能获得的6TX抗性克隆的代表性电泳图。克隆4、7、9、11和12显示出正确的PCR5条带模式，对应于HXGPRT标记的靶向缺失（约1.2 Kbp的扩增产物，跨越3'侧翼并轻微重叠5'侧翼，且位于3'侧翼外侧）。克隆1、2、3、6、8和10（该条带较弱）显示出约3.4 Kbp的预期条带模式，对应于亲本克隆的基因型，尽管这些克隆表现出一定程度的6TX抗性从而被筛选出来（这种表型偶尔会自发出现，原因是HXGPRT表达被关闭（参见 实验方案2.1（步骤8）及代表性结果部分的注释）。（C = 亲本对照菌株Δku80Δgoi::HXGPRT，M = 分子量标记）。 点击此处查看高清大图。

使用 HXGPRT 和 MPA 筛选策略进行 GOI 整合的基因编辑过程示意图。
图 4. 用于标记蛋白C末端的靶向DNA分子设计。 该策略基于 HXGPRT 标记物同时可作为3'下游调控区的功能。pΔGOItag的骨架为pRS416穿梭载体，含有尿嘧啶（URA）和氨苄青霉素（AMP）筛选标记。插入pRS416的是一个约1 Kbp的5' DNA靶向侧翼片段，该片段通过Fgoi和Rtag引物从基因组DNA中扩增而来，并具有与HXGPRT微型基因盒和pRS416重叠的序列；另一个约1 Kbp的3' DNA靶向侧翼片段通过F2和R2引物从基因组DNA中扩增而来，同样具有与HXGPRT微型基因盒和pRS416重叠的序列，以及HXGPRT微型基因盒。5' DNA靶向侧翼片段将终止密码子替换为标签（HA、Myc、His等），随后接一个新的终止密码子。MPA + X筛选可实现C末端标签和下游HXGPRT的整合，并将3'非翻译区（UTR）移至HXGPRT标记物之后的位置。以下独特的限制性内切酶切割位点被添加至引物中：在Fgoi引物中加入RE.X（限制性内切酶X切割位点），用于在5' DNA靶向侧翼片段的5'端切割质粒；在R2引物中加入RE.Y，用于在3' DNA靶向侧翼片段的3'端切割质粒；在Rtag和F2引物中加入RE.Z，用于切除HXGPRT微型基因盒，以便在质粒构建中重新靶向已标记的基因位点，从而删除HXGPRT标记物，恢复3' UTR的原有位置。

讨论

本文提供了一种在Δku80寄生虫株中进行高效基因靶向操作的实验方案，可用于高效获得经过遗传修饰的子代虫株，实现基因的靶向敲除、基因替换和/或基因标记。依次实施这些方法可为分离含有单个或多个靶向遗传修饰的寄生虫突变体提供一种可靠途径1-3。尽管靶向基因敲除的效率受多种因素影响，但结合Δku80菌株与本方案所描述的策略和操作流程，可显著提高构建精确突变型T. gondii菌株的效率和便捷性，从而促进功能基因组学研究。

T. gondii 在无性阶段的基因组为单倍体。因此，在计划敲除某个基因时需要考虑的是，该基因在体外（in vitro）不能是必需的。尽管如此，在 Δku80 菌株中进行基因敲除的靶向效率极高，这使得能够分离出复制能力显著受损的突变菌株。如果靶向基因是必需的，寄生虫通常会在筛选过程中停止复制。靶向遗传操作的另一个关键因素是，必须具有至少 620 bp 的基因组靶向侧翼序列的完全同源性，才能获得可检测的靶向整合2。更长的同源区域可提高靶向效率，使用约 1,000 bp 的靶向DNA侧翼序列是一种可靠且高效的方法1-4。因此，非常重要的一点是，基因组靶向侧翼序列应来源于与待进行遗传操作的菌株（RH、Pru）相同的 T. gondii 菌株。同源性不足常常会导致一个基因组靶向侧翼序列发生靶向整合，而另一个则不能。不完全整合或未能获得基因敲除也可能源于附加体的持续存在。转染后立即出现的所有靶向分子均为非整合型附加体，有时这些靶向分子可作为附加体持续存在多代。使用约 1 Kbp 的靶向DNA侧翼序列，并在重新亚克隆前持续在筛选压力下传代寄生虫，通常可解决与附加体持续存在相关的问题。

一旦敲除得到验证且HXGPRT标记被移除后，可对第二个目的基因（GOI）重复使用基因靶向策略，从而在单个寄生虫株系中实现多个基因的连续敲除1-3。通过使用不同的可筛选标记（如bleomycin、CAT、对乙胺嘧啶耐药的DHFR等），也可实现基因的删除、替换或标记。尽管目前CAT可筛选标记仍存在于II型Δku80 Pru基因组中1，但该标记可通过本文所述的HXGPRT筛选方案予以移除。在我们的实验经验中，HXGPRT筛选是最安全且最高效的标记系统，具有最高的靶向效率，仅需单拷贝的靶向插入即可在MPA + X培养基中实现稳定的筛选效果。HXGPRT还提供了目前唯一有效的靶向删除可筛选标记的方法（图3），即利用6-巯基黄嘌呤（6TX）进行筛选2,3。因此，本实验方案是目前唯一可用于构建携带多个靶向遗传修饰的明确突变株系的方法。

该方案为Δ中的靶向遗传操作提供了一种有价值且高效的方法ku80 菌株的 弓形虫（Toxoplasma gondii） 适用于单个基因、基因家族或全基因组功能基因组学研究。在Δ可获取之前ku80 菌株1,2，这些方法由于效率低下而未能广泛应用。因此，本方案可广泛适用于靶向基因操作 弓形虫（Toxoplasma gondii） 并且向所有对寄生虫生物学、宿主反应及功能基因组学等领域研究问题感兴趣的科研人员开放使用。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）向 DJB 提供的资助（项目编号：AI041930、AI073142、AI075931 和 AI091461）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
重叠引物Integrated DNA Technologies4 nmole Ultramer DNA 寡核苷酸
验证引物Integrated DNA Technologies100 nmole DNA 寡核苷酸
酵母菌株 #90845ATCC编号 FY834
穿梭载体 pRS416ATCC87521
DH10B E. coliInvitrogen12033-015试剂盒中的 SOC 肉汤，含 E. coli
重悬缓冲液QiagenQIAprep Spin Miniprep 试剂盒中的 Buffer P1
质粒小提试剂盒Qiagen27104QIAprep Spin Miniprep 试剂盒
玻璃珠Scientific IndustriesSI-BG050.5 mm 酸洗处理
Qiacube 自动化机器人工作站Qiagen
电穿孔比色皿USA Scientific9104-50502 mm 间隙
BTX600 电穿孔仪BTX
质粒大提试剂盒Qiagen12662QIAprep Spin Maxiprep 试剂盒
25 cm2 倾斜颈插口密封烧瓶Corning430168
150 cm2 倾斜颈插口密封烧瓶Corning430823
人包皮成纤维细胞（HFF 细胞）ATCCSCRC1041
Swin-lok 滤器支架Whatman420200直径 25 mm
滤膜Whatman110612Nucleopore 轨迹蚀刻膜，孔径 3 mm，直径 25 mm
霉酚酸（MPA）Sigma
黄嘌呤（X）Sigma
96 孔组织培养板Corning Costar
24 孔组织培养板Corning Costar
MEM Eagle 培养基Lonza Biowhittaker12-611F
胎牛血清Gibco26140-111
抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）Gibco15240-062
离心柱Primm LabsPAE-100Easy Clean DNA 提取离心柱试剂盒
T4 DNA 连接酶New England Biolabs
6-硫代黄嘌呤Acros Organics
组织 DNA 小提试剂盒Qiagen51104QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒
细胞培养冻存/复苏培养基Gibco126-48-010
磷酸盐缓冲液HycloneSH30028.02不含钙，不含镁

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ku80 HXGPRT PCR

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