使用图像流式细胞术定量与宿主细胞相关的致病性真菌

摘要

本文展示了如何利用图像细胞计量技术对与培养中宿主细胞相关的致病性真菌进行定量分析。该技术可作为菌落形成单位（CFU）计数的替代方法。

摘要

对致病性酵母细胞致病机制的研究 白色念珠菌, 荚膜组织胞浆菌，以及 新型隐球菌 常采用哺乳动物宿主或宿主细胞感染（即 巨噬细胞），随后通过菌落形成单位分析或流式细胞术对酵母进行定量。尽管菌落形成单位计数法是该领域最常用的方法，但该技术存在一些缺点和局限性，包括某些真菌在固体培养基上生长缓慢以及铺板效率低或不稳定，这在比较野生型与突变株生长情况时尤为值得关注。流式细胞术可快速提供有关酵母活力的定量信息，但由于成本较高及生物安全方面的考虑等实际原因，流式细胞术在致病性酵母检测中的应用受到限制。本文中，我们展示了一种基于成像的细胞计量方法，利用Cellometer Vision（Nexcelom Bioscience, LLC）对与巨噬细胞共培养的活致病性酵母进行定量。我们的研究聚焦于两种人类真菌病原体的检测： Histoplasma capsulatum 和 白色念珠菌. H. capsulatum 在巨噬细胞吞噬体内部复制，从而定植肺泡巨噬细胞，本文中我们对该病原体在巨噬细胞内的生长进行定量评估 H. capsulatum 使用吖啶橙/碘化丙啶染色结合成像细胞术检测RAW 264.7巨噬细胞中的酵母菌。本方法能够真实再现通过传统菌落形成单位计数所测得的生长趋势，且灵敏度显著提高。此外，我们利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的菌株直接评估活体巨噬细胞的感染情况 C. albicans我们的方法为检测和定量与宿主细胞相关的重大人类真菌病原体提供了一种快速、准确且经济的手段。

引言

研究病原真菌与其宿主和/或宿主细胞的相互作用时，通常需要在不同时间点或不同感染条件下对具有活力的真菌细胞进行定量。菌落形成单位（CFU）计数是测定存活真菌细胞数量的标准方法，但该技术存在若干缺点和局限性。首先，许多真菌物种生长缓慢，在固体培养基上形成可见菌落可能需要1至2周，显著延缓了研究进程。其次，CFU平板操作过程繁琐，因为必须进行多个稀释度的涂布，以确保获得可计数的菌落数量。第三，由于平板接种效率远低于100%，所测得的CFU数量通常低于实际接种的活菌数量。例如，双相型病原真菌Histoplasma capsulatum的接种效率最高可达90%，但通常仅为30%左右，而其近缘双相真菌Paracoccidioides brasiliensis的效率甚至更低，仅为10%^{1, 2}。Candida albicans的接种效率也存在较大变异性³。最后，CFU分析仅能检测在固体培养基上能够生长并分裂的活细胞，而在许多情况下，了解死亡细胞和/或代谢失活细胞的存在及其浓度同样具有重要意义。

此前已有文献描述过利用流式细胞术对多种致病性真菌进行定量的方法^4-6。然而，由于在共用的流式细胞仪上操作生物安全二级（BSL2）或三级（BSL3）病原体存在生物安全防护问题，该技术的应用受到限制。与流式细胞术类似，成像细胞术也是一种灵敏且快速的细胞定量方法。但成像细胞术可在成本显著降低的情况下获得可比的结果^7-11。本文中，我们介绍了对与宿主细胞共培养的致病性真菌进行成像细胞术分析的方法。我们以两种人类致病真菌——Histoplasma capsulatum 和 Candida albicans 为例，展示本方法的应用。Histoplasma capsulatum 是一种双相型致病真菌，可引起呼吸系统疾病；在人体内，它以出芽酵母形式生长，并在肺泡巨噬细胞内复制。Candida albicans 是一种人体共生真菌，偶尔可导致念珠菌病。我们证明，成像细胞术可实现对这些酵母菌的快速定量，同时具备可视化能力。

方案

1. 用H. capsulatum, C. albicans感染巨噬细胞

1. 感染前16小时，将巨噬细胞以所需密度接种于24孔板中。本方案中使用的细胞密度为每孔3.0 × 10⁵个细胞。
2. 加入处于对数生长期的真菌细胞，使其感染复数（MOI）达到所需水平。本方案适用于MOI范围为0.2至5.0的条件。在RAW264.7巨噬细胞感染H. capsulatum的实验中，我们采用的MOI为0.2。
3. 给予1.5小时以完成吞噬作用后，用PBS洗涤巨噬细胞三次，以去除细胞外的真菌。
4. 在样品分析前，根据需要孵育相应小时数。在低MOI条件下（本实验中为0.2），被感染的巨噬细胞可维持数天的活力，样品可大约每12–24小时分析一次。

2. 巨噬细胞裂解

1. 为释放巨噬细胞内的真菌，移除培养基，用 PBS 洗涤 3 次，加入 0.5 ml 无菌水。在此条件下，巨噬细胞将发生裂解，而真菌细胞保持完整。
2. 室温孵育 5 分钟。
3. 将裂解液转移至无菌管中，置于冰上保存。
4. 取 20 μl 裂解液转移至另一管中，然后加入 20 μl AO/PI 溶液。立即进入步骤 5：“成像细胞计量分析的样品制备”

3. 菌落形成单位（CFU）涂布

1. 用培养基对裂解物（来自步骤 2.3）进行十倍系列稀释。
2. 取每种稀释液 100 μl，重复两份，接种于 HMM-琼脂糖平板上。将平板置于湿润容器中，在 37 °C、含 5% CO₂ 条件下培养 7–8 天。
3. 人工计数菌落数在 100 至 1,000 个之间的平板上的菌落。

4. 活体巨噬细胞内真菌的可视化

1. 为收集活体巨噬细胞，用 PBS 洗涤细胞 3 次。加入 0.5 ml PBS，4 °C 下孵育 30 分钟。
2. 为从组织培养孔中分离巨噬细胞，轻轻吹打数次。将液体转移至无菌离心管中，并置于冰上保存。
3. 取 20 μl 样品转移至另一离心管，然后加入 20 μl AO/PI 溶液。立即进入第 5 步：“成像细胞分析的样品制备”。

5. 图像流式细胞分析的样本制备

1. 充分吹打混匀待测样品，然后取 20 μl 样品加入一次性细胞计数板中。
2. 静置 30 秒，使细胞在计数板内沉降。
3. 将计数板插入成像细胞计数仪中。

6. 细胞计数仪仪器设置

1. 将荧光光学模块 VB-535-402 和 VB-660-502 插入系统，并确保其已锁定到位。
   1. VB-535-402（激发波长 475 nm，发射波长 535 nm）用于吖啶橙和 GFP 的检测。
   2. VB-660-502（激发波长 540 nm，发射波长 660 nm）用于碘化丙啶的检测。
2. 打开成像细胞仪，并启动配套软件。

7. Cellometer 软件设置

1. 在“检测下拉菜单”中选择预设的“检测类型”和“细胞类型”。
   1. 对于活力检测，该检测已针对吖啶橙和碘化丙啶的检测进行了优化。
   2. 对于白色念珠菌（Candida albicans）感染的检测，该检测已针对GFP检测进行了优化。
2. 点击顶部的“选项”，然后选择“采集背景图像”，并等待操作完成。
3. 点击“预览明场图像”。

8. 图像采集流程

1. 将制备好的样品室插入图像细胞计数仪中。
2. 使用调焦旋钮调节焦距。
3. 待图像清晰后，点击“计数”按钮，等待图像采集操作完成。
4. 取出一次性计数室，并按规定妥善处理。

9. 图像数据分析

1. 浓度与细胞活力测定
   1. 计数完成后，目标细胞的浓度和活力将在结果页面中显示。
   2. 点击“导出”按钮，将数据导出至 FCS Express 4，用于白色念珠菌（Candida albicans）感染实验中 GFP 的细胞群体分析。
2. 白色念珠菌（Candida albicans）感染细胞的 FCS Express 分析
   1. 将“.NXDAT”文件导入 FCS Express 4，并在荧光直方图中绘制结果。
   2. 在直方图上设置细胞群体门控，以确定白色念珠菌（Candida albicans）感染细胞的群体百分比。

结果

我们采用 Cellometer Vision 图像细胞仪监测H. capsulatum在巨噬细胞中的生长情况。将 RAW 264.7 细胞感染H. capsulatum酵母细胞后，在不同时间点取样，进行 AO/PI 染色，随后进行基于图像的细胞计量分析。同时，采用传统的菌落形成单位（CFU）计数法对样品进行分析。在每个时间点，将样品在水中孵育以裂解巨噬细胞，释放出的酵母细胞由 Cellometer Vision 软件识别（图 1a 和 1b）。我们发现，在各个时间点，基于图像的细胞计量分析与 CFU 计数所检测到的活酵母浓度呈现出高度一致的变化趋势（图 1c）。正如预期，AO/PI 染色检测到的活酵母绝对数量始终高于通过 CFU 分析评估的在固体培养基上能够形成菌落的酵母数量，表明存在大量可存活但不可培养的细胞。

利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的酵母菌株，可实现活体巨噬细胞内真菌细胞的可视化观察。骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）被在ADH1启动子调...

讨论

图像细胞术可使用户获取高质量图像，并利用专用软件对细胞进行快速定量分析。图像细胞术在微生物致病性研究领域应用的一个潜在挑战在于，待计数的微生物存在于包含哺乳动物宿主细胞的混合细胞群体中。本文展示了图像细胞术可用于在混合细胞群体中对可存活的致病性酵母进行定量分析 体外 巨噬细胞感染。我们的方法不仅忠实地重现了真菌生长和存活率在感染过程中观察到的变化趋势 体外 巨噬细胞感染实验，且相较于传统的菌落形成单位（CFU）实验具有更高的灵敏度 ¹³.

与菌落形成单位（CFU）计数或流式细胞术相比，图像细胞术在酵母细胞定量方面具有多项实际优势。进行CFU平板计数时，实验人员必须制备多个稀释度的样品，以确保每个平板上的细胞数量可被准确计数，这一过程可能极为耗时费力。图像细胞术则无需进行多重稀释。此前我们已证明，在固体培养基上菌落的形成往往存在较大变异性，在极低浓度下真菌可能完全无法形成可见菌落，而图像细胞术则能够在任意浓度下实现细胞计数¹³。在低剂量感染的早期阶段或病原体清除过程中，当真菌数量稀少且活力处于检测临界水平...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DMEM	Life Technologies	11965-084
胎牛血清	Life Technologies	16000044
AO/PI 溶液	Nexcelom Bioscience	CSK-0102
一次性计数室	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
设备
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision 软件	Nexcelom Bioscience