无创气管插管法研究小鼠肺部病理与生理

摘要

使用模拟人类肺部疾病状况的模型对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学以及开发治疗干预措施至关重要。本文介绍了一种可将外源性物质直接递送至小鼠肺部的无创经气管插管方法。

摘要

使用模拟人类肺部疾病状况的模型，对于研究特定疾病的病理生理学和/或病因学以及开发治疗干预措施至关重要。随着基因敲除和转基因小鼠品系的日益可及，以及大量遗传信息的积累，小鼠成为研究肺部疾病病理学和生理学分子机制的最佳模型之一。吸入法、鼻内滴注法、气管内滴注法和气管插管法是目前研究者广泛采用的将目标物质递送至小鼠肺部的主要技术。每种技术均有其优缺点，具体选择取决于研究目的。本文介绍一种可直接将外源性物质递送至小鼠肺部的非侵入性气管插管方法。该技术已应用于将博来霉素递送至小鼠肺部，以建立肺纤维化研究模型。

引言

肺是一个常被诊断出多种严重疾病的器官。其中，肺癌在男性和女性中均为第二常见的癌症类型，也是癌症死亡的最常见原因。慢性阻塞性肺疾病，又称肺气肿和慢性支气管炎，是一种非常严重的疾病，是美国第三大死因。据2011年估计，约有2590万美国人患有哮喘，其中包括710万18岁以下儿童。哮喘是15岁以下儿童住院的第三大原因（美国肺脏协会，http://www.lung.org）。为了研究这些严重疾病的病理生理学和/或病因学及其潜在机制，建立精确的模型至关重要，同时需要便捷且无创地向肺部递送各种感兴趣的物质。由于基因敲除小鼠和转基因小鼠的可获得性不断提高，以及大量可用的遗传信息，小鼠成为研究肺部疾病病理学和生理学背后分子机制的最佳模型之一。

已有多种方法被不同研究者在不同实验条件下用于将目标物质递送至小鼠肺部，包括吸入法、经鼻滴注、气管内滴注和气管插管法^1-4。其中，气管插管法尚未被常规使用，因其被认为操作难度较高。本文所述的气管插管技术是一种非侵入性、简便且快速的方法，可用于将目标物质递送至小鼠肺部，以研究递送物质对肺组织基因表达模式、病理学和/或生理学的影响⁵。该技术可确保外源性物质递送至整个肺部，且不涉及任何存活手术 ，因此很可能获得各机构动物护理与使用委员会的批准。

方案

以下方案描述了一种非侵入性、简单且快速向小鼠肺部递送目标物质的方法。该实验程序已获得国家癌症研究所动物护理和使用委员会的批准。

1. 麻醉

1. 首先，使用氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉（剂量分别为100 mg/kg体重和10 mg/kg体重）。此为ACUC推荐的麻醉方案及剂量。在此剂量下，小鼠至少会保持无意识状态约20分钟。
2. 为防止小鼠在麻醉期间眼睛干涩，需在其眼部涂抹眼用软膏。
3. 数分钟后，轻捏小鼠足部以检查其意识状态。确认无意识后，将小鼠置于 将插管支架倾斜约60°，并将其上颌切牙钩挂在支架顶部的小橡胶圈上以固定位置。

2. 气管内插管

1. 使用棉签轻轻将小鼠的舌头向一侧牵拉。
2. 使用 BioLITE 插管照明系统时，小心插入插管装置，借助光纤导光束观察到喉部结构。
3. 一旦观察到会厌和杓状软骨，将光纤经会厌上方插入至杓状软骨之间，并继续推进，直至导管插入至合适长度。

注意：为了确定需要插入的导管合适长度，应预先使用一只体型相似的练习小鼠测量从口腔到支气管分叉点的长度（图1）。该长度在很大程度上取决于小鼠的体型。导管插入应停止在分叉点上方（对于体重约25 g的小鼠，约为1.5 cm）。这可确保灌注物质进入所有肺叶。操作者需至少对50只练习小鼠进行训练，才能熟练掌握插管技术（熟练的定义为插管成功率超过95%）。

4. 插入导管后，迅速将光纤导光束从导管中取出，以使动物能够正常呼吸。当不使用插管照明系统时，按上述方法直接插入导管。
5. 将含有待研究物质的溶液加入导管中。确保加入后溶液立即被吸入肺部。通常情况下，每约25 g小鼠体重使用50 µL。

3. 动物恢复

1. 一旦溶液被吸入肺部，立即将小鼠从支架上取下，并放回原来的笼子中。
2. 观察小鼠，直至其开始活动。
3. 确认小鼠状态良好后，将笼子放回饲养架。

结果

最初，使用绿色染料溶液对小鼠进行插管练习。插管后立即切除肺组织，以观察染料在肺内的分布均匀程度（图2）。该技术被应用于研究博来霉素诱导的肺纤维化，实验采用C57BL/6小鼠。当小鼠经气管插管给予1.2 U/kg博来霉素或等量生理盐水作为对照，并在3周后处死进行尸检时，小鼠全肺均出现由博来霉素诱导的纤维化，组织学检查及羟脯氨酸含量升高均支持这一结果（图3）。通过20倍物镜获取的肺组织图像和一个包含121个点的网格系统评估损伤区域。统计落在纤维化区域上的交点（点数），并以占总点数（121个）的百分比表示。由此计算出的损伤区域百分比与所给予的博来霉素剂量呈正比（图4）。

讨论

本文所述的气管内插管是一种简单且高效的非侵入性方法，可将目标物质均匀递送至小鼠肺部。该方法可用于研究给予物质对肺生理和/或病理过程的影响和/或作用。所给予的物质可以是内源性分子（如细胞因子），也可以是外源性物质（如异生物质化学物/药物、致癌物、污染物、过敏原或病毒），这些物质可导致多种肺部状况，可能作为研究各种人类疾病的模型^6-10。该技术还可与重组腺病毒或慢病毒联合使用，以在气道上皮细胞中实现目的基因的过表达或缺失，从而研究这些基因在肺稳态、生理、病理和/或致癌过程中的作用。通过在上皮细胞中瞬时表达Cre重组酶，可实现对上皮细胞中特定floxed基因的敲除¹¹。

导管容易误插入与气管相邻的食管。本文所述的方法中，插管照明系统可为导管应插入的正确位置提供引导⁵。该系统由一根光纤组成，该光纤稳定连接至光源，并配备一种特殊设计的微型光学透镜系统，可使光线聚焦于光纤上。光纤的输送端可插入一次性静脉导管内，该导管用作经气管插管。该系统可直接照亮口咽部，使插管过程中能够清晰观察喉部结构。一旦操作者熟练掌握使用该照明系统的技术后...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KetaVed	Vedco		氯胺酮
AnaSed 注射液 20 mg	LLOYD		赛拉嗪
BioLite 支架	Braintree Scientific	RIS100	适用于小鼠
BioLite 气管插管照明系统	Braintree Scientific	BIO MI-KIT	适用于小鼠
22 G，1 英寸静脉导管	Terumo	SR-OX2225CA	适用于体重低于30 g 的小鼠。 仅在未使用气管插管照明系统时使用该导管。
20 G，1 英寸静脉导管	Terumo	SR-OX2025CA	适用于体重超过30 g 的小鼠。 仅在未使用气管插管照明系统时使用该导管。