同时捕获实时图像在两个发射通道采用了双摄像头发射分光系统:应用到细胞粘附

Summary

双摄像头发射分光系统，双色荧光显微镜生成具有出色的光学分辨率和时间分辨率，一定的活细胞检测的要求，包括平行板流动腔粘连检测的实时图像序列。当软件被用来从合并收购的同时发射通道的图像，伪彩色图像序列产生。

Abstract

多色免疫荧光显微镜来检测特定的分子在细胞膜上可以加上平行平板流动腔实验来调查管动态流动条件下的细胞粘附机制。例如，标有多种荧光团的癌细胞可灌注了一个潜在的反应底物来建模癌转移的机制。然而，多通道单相机系统和彩色摄像机表现出的缺点在图像采集的实时活细胞分析。为了克服这些局限性，我们采用了双摄像头发射分光系统同时捕获荧光标记细胞的实时图像序列中的流室。双摄像头发射分光系统过滤器中定义的波长范围分为两个黑白CCD摄像机，从而同时捕获两个空间相同，但荧光的特定图像。随后，psuedocolored 1通道的图像被组合成一个单一的实时合并序列，可以揭示多个目标分子对细胞运动迅速在一个地区的利益。

Introduction

方法分子在细胞表面上，如免疫染色分析，采用被化学偶联至荧光基团，从而允许检测目标分子的探针。活细胞成像和流体动力流动为基础的细胞黏附测定法通常记录的黑白CCD相机设计在细胞和/或分子水平^1，2捕获的生理过程。这些摄像机是高度敏感的，提供快速的帧速率（大于每秒30帧），和（由于快速的帧速率和较短的曝光时间），提供出色的时间分辨率。然而，黑白相机只能捕捉到一个单一的发射通道（检测单个荧光基团）来采集图像。单个相机发射分光系统可并入到捕获多个发射信道，但往往减少视场并需要相同的曝光时间进行摄像的所有通道。要抓紧细胞标记MULTIP的全彩色光谱勒荧光团，一个彩色照相机可以作为一种替代方法。然而，彩色相机通常不能够提供期望在某些应用中的活细胞成像的时间分辨率。另一个成像装置所需的应用中，有利的是，图象的活细胞在多个波长，同时保持高的时间分辨率。一个主要的实验应用是在平行平板流动腔粘附试验，其中细胞被灌注在生理学相关条件下在一个潜在的反应基片^1，3。在流动细胞表达特定细胞表面分子可能粘附和轧辊的基体如表达粘附分子或表面吸附的细胞外基质蛋白^4，5的细胞单层上。轧制细胞可以在几分之一秒进行旋转和平移运动。上的滚动和粘附的细胞，如簇的细胞表面分子的分子功能，还具有电位人经过积极的重组在细胞表面上。因此，成像系统必须提供一个特殊的时间分辨率（每秒或更高30帧和"近零"的曝光时间），以生成示出的细胞轧制^6,7的一步一步的进展的图像序列。双摄像头发射分光系统能满足这些....

Protocol

1。软件安装

1. 购买StreamPix 5多摄像头软件SimulPix模块或能够收集并结合了黑白CCD相机拍摄的图像的其它图像软件。
2. 对于StreamPix 5最低要求包括:搭载Core 2 Duo处理器，2.4 GHz或更好地与2 GB RAM或更高的PC。受支持的IEEE数字或模拟相机和兼容图像采集卡。窗户XP/7/Vista 32位或64位。监视器支持分辨率1024×768或更高。 （建议OCU表达16倍或更高）的图形适配器具有良好的2D性能和7,200 RPM的硬盘驱动器，用于记录与RAID-O配置。

2。安装双摄像头系统能够双色同步实时成像

1. 通过滑动DC2 C型安装适配器插入MICR的视频端口连接DC2的配光发射分离器或类似的双摄像头发射分光装置，在显微镜OSCOPE，使得设备上的二向色性的外壳是可访问。
2. 插入两个黑白CCD摄像机转化为雌C接口1和女C型2。相同的摄像机是优选的。类似的相机也可使用，但兼容性是依赖于硬件的内部，最重要的是CCD图像传感器。
3. 使用图像处理软件来显示来自摄像机的图像。下面的步骤（2.3.1 - 2.3.4）适用于StreamPix 5与SimulPix模块，并且必须适用于其他的多摄像头成像软件。
   1. 打开StreamPix 5和任务色带选择"工作空间"。
   2. 打开"工作区管理器"位于最右边的屏幕并选择"新工....

Results

平行板流动腔粘连实验检测证明，同时捕获实时图像序列的两个发射信道的双摄像头发射分光系统（ 图1）。双相机发射分光系统检测出BT-20细胞，进行了荧光标记的抗人CD24和HECA-452（检测sialofucosylated抗原）的单克隆抗体和合适的第二抗体（ 图2）。一些细胞滚动显示红色信号（CD24）还检测不到绿色信号（HECA-452），其他显示绿色信号和检测不到的红色信号，并且还在其它细胞显示红色和绿色信号（ 图2）。合并后的排放渠道透露的BT-20细胞上滚动，坚持CHO-E单分子膜（ 图3和图4）在表面上CD24和sialofucosylated分子的分布和共定位。双摄像头发射spli拟合系统最初由于摄像机的对准有轻微的图像对齐错误，但这个错误是与数字调整（ 图5）使用StreamPix 5的SimulPix模块纠正。总而言之，双摄像发射分光系统有必要以显示应用，例如流室附着力试验，其中细胞通过视场中快速移动的细胞和分子特征的空.......

Discussion

双摄像头发射分光系统需要在应用中的细胞或分子的运动是快速捕捉高品质图像的空间，时间，以及光学分辨率。在产生代表性的结果，在双相机发射分光系统，包括软件的设置，相机设置的参数，进行优化以获得合并的图像序列，其中轧制和贴壁细胞，空间和时间上对齐。此优化步骤是关键的，因为未对准可导致图像不正确传达所研究的物理现象， 例如 ，观察到滚在两个绿色和红色通道的单个细胞可能显示为2轧细胞在合并后的工作区。空间定位应该达到的双摄像头发射分光系统的设置，当相机在协议步骤2.4描述的物理排列。数字更正的图像CAPT空间对齐索引由该相机可以通过在成像软件（步骤5.7和图5）数字对齐设置被应用为水平，垂直或旋转偏移量（S）。

曝光时间，偏移和增益:通过摄像机1和摄像机2拍摄的图像之间的时间对准可以通过调整摄像机的"实时设置"来实现。增益和偏移可以在不影响合并图像的时间对准进行调整，但偏差在用户定义的曝光时间摄像头之间可导致未对准。因而增益可以调整，以补偿用来收集在每个摄像机的图像的曝光时间之间的差异。理想情况下，在摄像机之间的曝光时间差异应只当增益调整出.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/材料
BT-20 细胞	ATCC	HTB-19
CHO-E 细胞	来自 R. Sackstein 博士的礼物（布莱根和妇女s 哈佛医学院医院）
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
青霉素-链霉素	Thermo Scientific	SV30010
0.25% 胰蛋白酶 / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 单克隆抗体	BD Biosciences	555946
抗人 CD24 单克隆抗体	BD Biosciences	555426
抗大鼠 IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
抗小鼠 IgGAlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
设备
EXi 蓝色荧光显微镜 数字 CCD 相机	Q 成像	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 数字 CCD 相机	Q 成像	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 发射分流器	光度测量	DC2
倒置荧光显微镜	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 软件	Norpix