用于双色荧光显微镜的双相机发射分光系统能够生成具有优异光学和时间分辨率的实时图像序列，这是某些活细胞检测（包括平行板流动腔黏附实验）所必需的。当使用软件将同时获取的发射通道图像进行合并时，可生成伪彩图像序列。
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本文内容
摘要
摘要
多色免疫荧光显微技术可用于检测细胞膜上的特定分子，结合平行板流动腔实验，可研究动态流动条件下细胞黏附的调控机制。例如，可将多种荧光标记的癌细胞灌注于潜在反应性基底上，以模拟癌症转移机制。然而，单相机多通道系统和彩色相机在实时活细胞分析的图像采集方面存在局限性。为克服这些限制，我们采用双相机发射光分光系统，同时捕获流动腔中荧光标记细胞的实时图像序列。双相机发射光分光系统将特定波长范围的光信号分别导入两台黑白CCD相机，从而同时获取空间位置相同但针对不同荧光染料的两幅图像。随后，将伪彩处理的单通道图像合并为单一的实时叠加序列，从而揭示在感兴趣区域快速移动的细胞上多种靶分子的分布情况。
引言
分析细胞表面分子的方法（如免疫染色）通常使用化学偶联荧光染料的探针，以实现对目标分子的检测。活细胞成像和基于流体动力学的细胞黏附实验通常采用单色CCD相机进行记录，这类相机专为在细胞和/或分子水平上捕捉生理过程而设计1, 2。这些相机具有高灵敏度、快速帧率（每秒超过30帧），并提供优异的时间分辨率（得益于高帧率和短曝光时间）。然而，单色相机仅能捕获单一发射通道（即检测单一荧光染料）以获取图像。虽然可引入单相机发射分光系统来捕获多个发射通道，但此类系统常会缩小视场，并要求所有通道使用相同的曝光时间进行成像。为了从标记了多种荧光染料的细胞中捕获完整的彩色光谱，可选用彩色相机作为替代方案。然而，在某些应用中，彩色相机通常无法提供活细胞成像所需的时间分辨率。因此，在需要以多个波长对活细胞成像的同时保持高时间分辨率的应用中，需采用另一种成像设备。一个典型的实验应用是平行板流动腔黏附实验，其中细胞在生理相关条件下流经可能具有反应性的基底1, 3。在流动中表达特定细胞表面分子的细胞可能在基底上发生黏附和滚动，例如在表达黏附分子的单层细胞或表面吸附的细胞外基质蛋白上4, 5。滚动中的细胞可能在不到一秒的时间内发生旋转和平移运动。滚动或黏附细胞上的分子特征（如细胞表面分子簇）也有可能在细胞表面发生主动重排。因此，成像系统必须具备极高的时间分辨率（每秒30帧或更高，以及“接近零”的曝光时间），以生成能够清晰展示细胞滚动逐步进程的图像序列6, 7。双相机发射分光系统....
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方案
1. 软件安装
- 购买配备 SimulPix 模块的 StreamPix 5 多相机软件，或其他能够采集并整合由黑白 CCD 相机拍摄的图像的成像软件。
- StreamPix 5 的最低系统要求包括：配备 Core 2 Duo 2.4 GHz 或更高处理器、2 GB 或以上内存的 PC；支持的 IEEE 数字或模拟相机及兼容的图像采集卡；Windows XP/7/Vista 32 位或 64 位操作系统；分辨率支持 1,024 × 768 或更高的显示器；具备良好 2D 性能的图形适配器（推荐使用 OCU express 16x 或更高版本）以及用于 RAID-0 配置下录制的 7,200 RPM 硬盘驱动器。
2. 双摄像头系统的安装，可实现双色同步实时成像
- 将 DC2 Photometrics 发射光分光器或类似的双相机发射光分光装置通过滑动 DC2 C 接口适配器插入显微镜的视频端口，使装置上的二向色镜外壳可被触及。
- 将两个单色 CCD 相机插入至母口 C 接口 1 和母口 C 接口 2。建议使用相同的相机型号。也可使用相似型号的相机，但兼容性取决于内部硬件，尤其是 CCD 图像传感器。
- 使用成像软件显示来自两个相机的图像。以下步骤（2.3.1 - 2.3.4）适用于配备 SimulPix 模块的 StreamPix 5 软件，若使用其他多相机成像软件，....
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结果
采用平行板流动腔黏附实验，验证了一种双相机发射分光系统，该系统可同时在两个发射通道中实时捕获图像序列（图1）。该双相机发射分光系统检测了经荧光标记的BT-20细胞，这些细胞使用抗人CD24和HECA-452（识别唾液酸化岩藻糖基化抗原）单克隆抗体及相应的二抗进行标记（图2）。部分滚动的细胞显示红色信号（CD24），但绿色信号（HECA-452）不可见；另一些细胞显示绿色信号而红色信号不可见；还有一些细胞则同时显示红色和绿色信号（图2）。合并的发射通道图像揭示了在CHO-E单层细胞上滚动并黏附的BT-20细胞表面CD24与唾液酸化岩藻糖基化分子的分布及共定位情况（图3和图4）。该双相机发射分光系统最初由于相机对准问题存在轻微的图像对齐误差，但通过使用StreamPix 5软件的SimulPix模块进行数字校正后，该误差得以消除（图5）。总体而言，该双相机发射分光系统具备足够的空间、时间和光学分辨率，可用于揭示细胞快速通过视野的应用场景（如.......
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讨论
双相机发射分光系统具备在细胞或分子快速运动的应用中捕捉高质量图像所需的空间、时间和光学分辨率。在生成代表性结果时，对双相机发射分光系统中的参数（包括软件设置和相机设置）进行了优化，以获得滚动细胞与黏附细胞在空间和时间上均对齐的融合图像序列。该优化步骤至关重要，因为错位可能导致图像无法准确反映所研究的物理现象。 例如 在绿色和红色通道中均观察到的一个滚动单细胞，在合并的工作区中可能显示为两个滚动的细胞。当相机按照方案第2.4步所述进行物理对准时，应在双相机发射分光系统的设置过程中实现空间对齐。可通过成像软件中的数字对齐设置（第5.7步），对相机捕获图像的空间对齐进行数字校正，以校正水平、垂直或旋转偏移。 图5).
通过调整相机1和相机2的“实时设置”（包括曝光时间、偏移量和增益），可实现两台相机所捕获图像之间的时间对齐。增益和偏移量的调整不会影响合并图像的时间对齐，但若用户设定的两台相机曝光时间存在差异，则可能导致图像错位。因此，可通过调节增益来补偿两台相机在图像采集过程中所使用曝光时间的差异。理想情况下，仅当增益调节明显损害图像质.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢俄亥俄大学化学与生物分子工程系的 Douglas Goetz 博士和俄亥俄大学生物医学科学系的 Fabian Benencia 博士，感谢他们富有见地的讨论和对手稿的审阅。我们还感谢 W. Nuhsbaum 公司的 Christopher Huppenbauer 博士提供的有益技术讨论。本研究得到了美国国家科学基金会（CBET-1106118）和美国国立卫生研究院（1R15CA161830-01）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂/材料 | |||
| BT-20细胞 | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E细胞 | R. Sackstein 博士惠赠（Brigham and Women）’哈佛医学院，哈佛大学医院 | ||
| MEM | 赛默飞世尔科技 | SH30024.01 | |
| FBS | 赛默飞世尔科技 | SH30396.03 | |
| 青霉素-链霉素 | 赛默飞世尔科技 | SV30010 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 / 0.1% EDTA | 赛默飞世尔科技 | SV30031.01 | |
| DPBS | 赛默飞世尔科技 | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 555946 | |
| 抗人CD24单克隆抗体 | BD 生物科学 | 555426 | |
| 抗大鼠 IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| 抗小鼠 IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [页眉] | |||
| <强>仪器设备 | |||
| EXi 蓝色荧光显微镜数字 CCD 相机 | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 数字 CCD 相机 | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2发射分光器 | 光度测量 | DC2 | |
| 倒置荧光显微镜 | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 软件 | Norpix |
参考文献
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligan....
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