用于双色荧光显微镜的双相机发射分光系统能够生成具有优异光学和时间分辨率的实时图像序列，这是某些活细胞检测（包括平行板流动腔黏附实验）所必需的。当使用软件将同时获取的发射通道图像进行合并时，可生成伪彩图像序列。
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摘要
摘要
多色免疫荧光显微技术可用于检测细胞膜上的特定分子，结合平行板流动腔实验，可研究动态流动条件下细胞黏附的调控机制。例如，可将多种荧光标记的癌细胞灌注于潜在反应性基底上，以模拟癌症转移机制。然而，单相机多通道系统和彩色相机在实时活细胞分析的图像采集方面存在局限性。为克服这些限制，我们采用双相机发射光分光系统，同时捕获流动腔中荧光标记细胞的实时图像序列。双相机发射光分光系统将特定波长范围的光信号分别导入两台黑白CCD相机，从而同时获取空间位置相同但针对不同荧光染料的两幅图像。随后，将伪彩处理的单通道图像合并为单一的实时叠加序列，从而揭示在感兴趣区域快速移动的细胞上多种靶分子的分布情况。
引言
分析细胞表面分子的方法（如免疫染色）通常使用化学偶联荧光染料的探针，以实现对目标分子的检测。活细胞成像和基于流体动力学的细胞黏附实验通常采用单色CCD相机进行记录，这类相机专为在细胞和/或分子水平上捕捉生理过程而设计1, 2。这些相机具有高灵敏度、快速帧率（每秒超过30帧），并提供优异的时间分辨率（得益于高帧率和短曝光时间）。然而，单色相机仅能捕获单一发射通道（即检测单一荧光染料）以获取图像。虽然可引入单相机发射分光系统来捕获多个发射通道，但此类系统常会缩小视场，并要求所有通道使用相同的曝光时间进行成像。为了从标记了多种荧光染料的细胞中捕获完整的彩色光谱，可选用彩色相机作为替代方案。然而，在某些应用中，彩色相机通常无法提供活细胞成像所需的时间分辨率。因此，在需要以多个波长对活细胞成像的同时保持高时间分辨率的应用中，需采用另一种成像设备。一个典型的实验应用是平行板流动腔黏附实验，其中细胞在生理相关条件下流经可能具有反应性的基底1, 3。在流动中表达特定细胞表面分子的细胞可能在基底上发生黏附和滚动，例如在表达黏附分子的单层细胞或表面吸附的细胞外基质蛋白上4, 5。滚动中的细胞可能在不到一秒的时间内发生旋转和平移运动。滚动或黏附细胞上的分子特征（如细胞表面分子簇）也有可能在细胞表面发生主动重排。因此，成像系统必须具备极高的时间分辨率（每秒30帧或更高，以及“接近零”的曝光时间），以生成能够清晰展示细胞滚动逐步进程的图像序列6, 7。双相机发射分光系统能够满足对多种荧光染料标记细胞成像的上述要求。
双相机发射分光系统将荧光通道分裂并过滤到两个相似的相机中，以同时捕获空间位置完全相同但特异性针对不同荧光团的两幅图像，同时保持完整的视野。该技术能够实现对每个通道实时捕获图像的直接比较，并允许用户在具有不同成像能力的相机型号之间快速切换。这一功能有助于针对不同强度、寿命和消光系数的荧光团，快速调整其中一个相机的图像采集设置8。结合成像软件，双相机发射分光系统可实现多波长下活细胞成像实验的实时记录，并可增强利用荧光研究细胞行为的体外（in vitro）实验。
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方案
1. 软件安装
- 购买配备 SimulPix 模块的 StreamPix 5 多相机软件，或其他能够采集并整合由黑白 CCD 相机拍摄的图像的成像软件。
- StreamPix 5 的最低系统要求包括：配备 Core 2 Duo 2.4 GHz 或更高处理器、2 GB 或以上内存的 PC；支持的 IEEE 数字或模拟相机及兼容的图像采集卡；Windows XP/7/Vista 32 位或 64 位操作系统；分辨率支持 1,024 × 768 或更高的显示器；具备良好 2D 性能的图形适配器（推荐使用 OCU express 16x 或更高版本）以及用于 RAID-0 配置下录制的 7,200 RPM 硬盘驱动器。
2. 双摄像头系统的安装，可实现双色同步实时成像
- 将 DC2 Photometrics 发射光分光器或类似的双相机发射光分光装置通过滑动 DC2 C 接口适配器插入显微镜的视频端口，使装置上的二向色镜外壳可被触及。
- 将两个单色 CCD 相机插入至母口 C 接口 1 和母口 C 接口 2。建议使用相同的相机型号。也可使用相似型号的相机，但兼容性取决于内部硬件，尤其是 CCD 图像传感器。
- 使用成像软件显示来自两个相机的图像。以下步骤（2.3.1 - 2.3.4）适用于配备 SimulPix 模块的 StreamPix 5 软件，若使用其他多相机成像软件，需相应调整操作。
- 打开 StreamPix 5，在任务栏中选择 "workspace"。
- 打开屏幕最右侧的 "workspace manager"，并选择 "new workspace"。
- 为相机命名后，根据软件提示从预填充列表中选择采集卡。选择与相机型号匹配的采集卡，并对第二个相机工作区重复此操作。对于合并工作区，再次执行该步骤，但会出现 "all cameras are in use" 的错误提示，此提示属正常现象。
- 加载合并工作区后，在查看屏幕右侧的对接面板中，将工作区 1 和工作区 2 中的相机分配至合并工作区。
- 在双相机发射光分光系统中对准相机。
- 使用 PlanApo 40X（或更高倍数）物镜，在明场或相差模式下利用制造商提供的校准网格对相机进行对准。
- 将光线导向显微镜目镜，将制造商提供的金属涂层校准网格放置于显微镜载物台上，并使网格在载物台上摆放端正。
- 调焦使网格清晰成像。
- 移动但不取下二向色镜外壳，以对准相机 1（旁路相机）。以无像素合并、无自动缩放的方式显示网格图像，并使用 C 接口端口 1 上的调焦旋钮对图像进行聚焦。
- 将二向色镜外壳完全推入双通道采集装置，使图像被二向色镜分光至两个相机。
- 松开三个 5/64" 英寸的固定螺丝，旋转母口 C 接口 2 上的第二个相机，直至两个图像中网格的方向完全一致。使用 C 接口端口 2 上的调焦旋钮，使相机 2 的图像清晰聚焦。
- 使用成像软件中合并工作区的合成图像完成最终对准。此功能可实时显示两个校准网格图像的伪彩叠加效果。仅使用 DC2 右侧的左右（R/L）调节旋钮调整合成图像的位置，直至两幅图像的左右垂直边界精确对齐。
- 使用上下（U/D）旋钮调整第二幅图像的上下对准，直至水平网格线完全对齐。
- 若在上下对准过程中发生轻微相机旋转，可通过松开相机 2 的三个 5/64" 英寸螺丝并旋转相机，直至显示图像正确对齐，以纠正此问题。
3. 平行板流动小室黏附实验用癌细胞的制备
- 按照先前所述方法，在最低必需培养基（MEM）中培养BT-20乳腺癌细胞，加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素，配制成完全培养基，在37 °C、5.0% CO2条件下培养2。
- 用低浓度胰蛋白酶处理收获癌细胞，并用血细胞计数板计数细胞。
- 用含钙镁的DPBS（DPBS+）配制的0.1%牛血清白蛋白（BSA）洗涤细胞，并将细胞重悬于其中，浓度为107 个细胞/mL。
- 将一抗（纯化的鼠抗人CD24抗体和纯化的大鼠HECA-452抗体（抗唾液酸岩藻糖基化抗原））用含0.1% BSA的DPBS+稀释至预先确定的最佳浓度，与细胞孵育30分钟9, 10。
- 以1,200 rpm离心收集细胞，弃去上清液（一抗溶液），用含0.1% BSA的DPBS+洗涤细胞两次。
- 将二抗（AlexaFluor 568标记的山羊抗小鼠IgG（发射波长最大值为603 nm）和AlexaFluor 488标记的山羊抗大鼠IgM（发射波长最大值为519 nm））用含0.1% BSA的DPBS+稀释至预先确定的最佳浓度，与细胞孵育30分钟。
- 洗涤细胞两次，然后重悬于含0.1% BSA的DPBS+中，调整细胞浓度为106 个细胞/mL。
4. 平行板流动腔黏附实验用活性底物的制备
- 将两段独立的管路分别连接到可置于35 mm组织培养皿内的平行板流动腔的入口和出口端口。其中一根管路连接至含有悬浮在0.1% BSA DPBS+中的标记细胞的储液器，另一根管路连接至注射泵，用于以指定流速抽吸液体。
- 将真空管路连接至流动腔1。
- 将流动腔置于含有表达E-选择素的中国仓鼠卵巢细胞（CHO-E）单层的35 mm组织培养皿上方。CHO-E细胞在37 °C和5.0% CO2条件下，使用MEM完全培养基培养2。
- 调整流动腔和/或流动腔垫圈，以确保形成良好的真空密封1。
- 从储液器中抽吸液体，同时观察流动腔组件是否密封良好，并无可见气泡形成1。
- 将流动腔组件放置在显微镜（Leica DMI 6000B）上1。
5. 双色图像采集
- 开启徕卡EL-6000紧凑型光源或类似装置，以产生高强度光线，并将光线耦合至导光管。使用倒置显微镜使光线通过一个组合滤光片立方体。 即 G/R（绿/红）滤光片组，用于激发特定颜色/强度的荧光染料。
- 确保二向色镜外壳处于正确的操作位置（压下状态），且未处于旁路模式。
- 在荧光模式下操作显微镜，并选择合适的荧光滤光片组（绿色/红色）。
- 确定相机1（红色；620±60 nm）和相机2（绿色；535±40 nm）的曝光时间与增益。
- 下压二向色镜，以获取红色和绿色发射通道的图像。使用仅用红色荧光标记的细胞进行流室实验，并通过调节相机1的曝光时间，在红色通道中获取图像。 "活体环境" 成像软件的
- 将相机2的曝光时间与相机1的曝光时间相匹配。如果在绿色通道中观察到图像，则存在串色伪影，需降低两台相机的曝光时间。
- 保持相机1和相机2的曝光时间一致，逐步缩短曝光时间，直至绿色通道中不再可见串色伪影。如有必要，调节相机1的增益以改善红色通道的图像可见度。
- 用仅标记绿色荧光染料的细胞重复步骤 5.4.1 - 5.4.3，但在使用相机 2 采集绿色通道图像时，需设定曝光时间，确保相机 1 在红色通道中无荧光串扰伪影。
- 如果无法消除串色干扰，则需重新滴定抗体 11，或当相机1与相机2的曝光时间存在显著差异，导致合并图像可能出现时间上的错位时。
- 使用成像软件同时查看在流动腔实验中由两台单色CCD相机采集的图像。
- 使用 Streampix 5 的 SimulPix 模块或其它替代软件包合并两台相机采集的图像。
- 如有需要，使用 SimulPix 或其他软件中的数字校正调整功能对合并后的图像进行空间对齐。可通过 SimulPix 模块对图像进行水平、垂直和旋转方向的校正。
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结果
采用平行板流动腔黏附实验，验证了一种双相机发射分光系统，该系统可同时在两个发射通道中实时捕获图像序列（图1）。该双相机发射分光系统检测了经荧光标记的BT-20细胞，这些细胞使用抗人CD24和HECA-452（识别唾液酸化岩藻糖基化抗原）单克隆抗体及相应的二抗进行标记（图2）。部分滚动的细胞显示红色信号（CD24），但绿色信号（HECA-452）不可见；另一些细胞显示绿色信号而红色信号不可见；还有一些细胞则同时显示红色和绿色信号（图2）。合并的发射通道图像揭示了在CHO-E单层细胞上滚动并黏附的BT-20细胞表面CD24与唾液酸化岩藻糖基化分子的分布及共定位情况（图3和图4）。该双相机发射分光系统最初由于相机对准问题存在轻微的图像对齐误差，但通过使用StreamPix 5软件的SimulPix模块进行数字校正后，该误差得以消除（图5）。总体而言，该双相机发射分光系统具备足够的空间、时间和光学分辨率，可用于揭示细胞快速通过视野的应用场景（如...
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讨论
双相机发射分光系统具备在细胞或分子快速运动的应用中捕捉高质量图像所需的空间、时间和光学分辨率。在生成代表性结果时，对双相机发射分光系统中的参数（包括软件设置和相机设置）进行了优化，以获得滚动细胞与黏附细胞在空间和时间上均对齐的融合图像序列。该优化步骤至关重要，因为错位可能导致图像无法准确反映所研究的物理现象。 例如 在绿色和红色通道中均观察到的一个滚动单细胞，在合并的工作区中可能显示为两个滚动的细胞。当相机按照方案第2.4步所述进行物理对准时，应在双相机发射分光系统的设置过程中实现空间对齐。可通过成像软件中的数字对齐设置（第5.7步），对相机捕获图像的空间对齐进行数字校正，以校正水平、垂直或旋转偏移。 图5).
通过调整相机1和相机2的“实时设置”（包括曝光时间、偏移量和增益），可实现两台相机所捕获图像之间的时间对齐。增益和偏移量的调整不会影响合并图像的时间对齐，但若用户设定的两台相机曝光时间存在差异，则可能导致图像错位。因此，可通过调节增益来补偿两台相机在图像采集过程中所使用曝光时间的差异。理想情况下，仅当增益调节明显损害图像质...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢俄亥俄大学化学与生物分子工程系的 Douglas Goetz 博士和俄亥俄大学生物医学科学系的 Fabian Benencia 博士，感谢他们富有见地的讨论和对手稿的审阅。我们还感谢 W. Nuhsbaum 公司的 Christopher Huppenbauer 博士提供的有益技术讨论。本研究得到了美国国家科学基金会（CBET-1106118）和美国国立卫生研究院（1R15CA161830-01）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂/材料 | |||
| BT-20细胞 | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E细胞 | R. Sackstein 博士惠赠（Brigham and Women）’哈佛医学院，哈佛大学医院 | ||
| MEM | 赛默飞世尔科技 | SH30024.01 | |
| FBS | 赛默飞世尔科技 | SH30396.03 | |
| 青霉素-链霉素 | 赛默飞世尔科技 | SV30010 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 / 0.1% EDTA | 赛默飞世尔科技 | SV30031.01 | |
| DPBS | 赛默飞世尔科技 | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 555946 | |
| 抗人CD24单克隆抗体 | BD 生物科学 | 555426 | |
| 抗大鼠 IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| 抗小鼠 IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [页眉] | |||
| <强>仪器设备 | |||
| EXi 蓝色荧光显微镜数字 CCD 相机 | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 数字 CCD 相机 | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2发射分光器 | 光度测量 | DC2 | |
| 倒置荧光显微镜 | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 软件 | Norpix |
参考文献
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