使用惰性气体射流对贴壁细胞进行透化处理

摘要

本方案描述了一种利用惰性气体射流对贴壁细胞进行暂时性透化的方法。该技术通过机械力破坏细胞质膜，从而促进遗传物质和生物分子转入贴壁的哺乳动物细胞中。

摘要

存在多种细胞转染技术，可 broadly 分为三大类：病毒法、化学法和机械法。本方案描述了一种利用惰性气体射流对贴壁细胞进行瞬时通透化处理的机械方法，该方法可促进通常不可穿透的大分子物质进入细胞。我们认为该技术的作用机制是通过对贴壁细胞的质膜施加剪切力，从而暂时形成微孔。一旦微孔形成，细胞即对遗传物质及其他生物大分子具备通透性。然而，所涉及的机械力存在导致细胞永久性损伤或从基质上脱落的风险。因此，该技术的有效性仅存在于较窄范围的惰性气体动力学参数内。已有研究表明，惰性气体射流可高效实现多种贴壁细胞系的通透化处理，包括 HeLa、HEK293 和人腹主动脉内皮细胞。本方案适用于贴壁细胞的通透化处理，既可用于 体外 并且，正如我们已证明的那样， 体内，表明其可用于研究，并可能在未来具有临床应用潜力。此外，它还具有以空间限制方式使细胞通透的优势，可能成为一种有价值的研究工具。

引言

随着生物医学的发展以及对细胞力学理解的深入，将生物分子递送至细胞内已成为众多研究领域和医学治疗中的关键环节。目前已开发出多种技术，用于将外源分子穿过质膜导入细胞质中。这些技术通常可分为病毒类、化学类或机械类方法。病毒技术利用病毒载体将RNA和DNA等遗传物质导入细胞¹。该方法在某些细胞系中转染效率较高，但可能引发免疫反应和炎症反应²。常见的化学转染方法包括磷酸钙沉淀法³、细菌外毒素法⁴以及脂质体转染法（lipofection）⁵。这些技术已被证实有效，但仍存在细胞毒性及非特异性等问题。此外，磷酸钙沉淀法在某些细胞系中的转染效率可达70%，但在原代细胞中极少成功⁶。这一点尤为重要，因为当前越来越多的研究聚焦于原代细胞，尤其是在开发多种临床治疗方案以及研究DNA功能的过程中。

通过机械刺激暂时破坏细胞膜是将外源分子导入细胞的一种替代方法。技术包括：分子显微注射⁷，利用电场破坏细胞膜的电穿孔技术^8,9，利用超声波进行声孔效应以破坏细胞膜^10-12，如本实验所示的粒子轰击法 "基因枪"，可将携带基因的微粒射入细胞¹³，以及最近应用的流体剪切应力，已被证明可暂时性地增加哺乳动物细胞的通透性^14,15尽管机械方法可以避免前述部分问题，但通常伴随着较低的效率以及非常复杂且专用的装置。麦吉尔大学开发了一种常压辉光放电等离子体炬（APGD-t），其最初目标是实现表面功能化及分离贴壁细胞 体外¹⁶偶然发现，一种活/死染色试剂在未添加透化剂的情况下被细胞吸收。进一步观察发现，这种现象仅出现在孔板的特定区域，恰好与等离子炬的路径相吻合。随后，我们继续研究了大气压辉光放电等离子体（APGD-t）的透化能力；在对照实验中发现，未激发的等离子体载气惰性气体射流本身也能够实现细胞透化。这一结果与最初的假设相矛盾，即等离子体射流产生的活性物质会暂时破坏细胞膜功能；相反，结果表明仅机械力就足以引起细胞透化。基于此，我们实验室进一步开展了研究，旨在定量表征惰性气体射流的透化效率，并评估其转染能力。¹⁶.

通过这些研究发现，血浆膜上确实会形成微孔，且这些微孔通常在约5秒内重新封闭。¹⁵我们已证明了该技术的实用性 体外 和 体内 鸡胚的尿囊绒毛膜中

方案

1. LabView 程序的开发

1. 将质量流量控制器（MKS M100B Mass-Flo Controller）连接至氦气管路，以确保精确的气体流速。该设备通过0至5 V的输入电压进行控制。LabView程序中的控制回路确定任意时刻所需的电压值。计算机与质量流量控制器之间的通信通过数据采集设备（NI USB-6009）实现，同时由12 V电源为质量流量控制器供电。
2. 使用两个线性定位滑台来控制6孔板在两个方向上的移动。每个滑台组件由MA15系列Velmex Unislide滑台与一个步进电机组成，两个组件均由一个Velmex VXM步进电机控制器统一控制。该控制器支持手动调节每个电机，也可接收外部串行指令字符串，二者结合可实现特定的运动模式。多种运动模式可预先编程至LabView程序中，用户仅需输入所需的火炬移动速度及路径尺寸即可。

2. 仪器设备的准备

1. 打开氦气瓶和减压阀。
2. 开启电机控制器。
3. 启动 LabView 程序并确认所有条件正常。
4. 确保平台处于中心位置。检查方法是观察每个电机滑台，确认每个滑块均未接近滑台任一端。可通过程序自动居中滑块，或手动使用电机控制器前面板上的点动控制进行调整。
5. 若为当日首次运行，建议在不放置细胞的情况下先运行一次程序，以确保系统设置工作正常。

3. 气体喷流毛细管喷嘴高度的制备

1. 从支架上取下毛细管，并将高度刻度盘归零。
2. 将6孔板放置在平台上。
3. 重新安装气体喷射毛细管，并将其下移至孔底，直至接触盖玻片。将毛细管固定在支架中。
4. 使用高度刻度盘将毛细管向上调节3 mm。在毛细管底座上标记此高度。
5. 将毛细管升至安全高度，然后取下6孔板。

4. 细胞通透化实验方案

1. 采用标准培养技术，在6孔板中的玻璃盖玻片上培养贴壁细胞系至汇合。对于HeLa细胞，每孔接种2 × 10⁵个细胞，处理前孵育48小时。
2. 配制含有目标载体的适当体积溶液。对于hrGFPII-1，使用50 ng/μl的浓度溶于1×PBS中，在转染后24小时可在HeLa细胞中获得较强的荧光信号。对于葡聚糖实验，建议使用80 μg/ml的10 kDa绿色荧光葡聚糖。此后，该溶液将被称为"载体溶液"。
3. 从孔中移除细胞培养基，并用1×PBS冲洗三次。
4. 将步骤4.2中配制的1,370 μl载体溶液加入孔中。液体深度应约为1.3 mm。
5. 将含有载体溶液的孔置于平台中央。将气体喷嘴下降至先前标记的位置，使喷嘴高度位于盖玻片上方3 mm处。
6. 在LabView程序中设定氦气流速，并选择所需的运动模式。准备就绪后点击"运行"以开始通透化程序。此时会有一段初始延迟，期间质量流量控制器正在调节至所需流速。一旦达到设定流速，LabView程序将启动步进电机，使孔按预设的通透化模式移动。平台停止后，等待约30秒，然后移除载体溶液。注意：最佳通透化效果通常出现在喷嘴出口处动态压力为100至200 Pa时，具体数值取决于毛细管直径。
7. 用1×PBS洗涤孔三次。
8. 向孔中加入新鲜培养基。
9. 根据实验需求重复步骤4.3至4.6。注意：务必设置对照样本，即向孔中加入载体溶液但不开启气体喷射。对照组孔中的溶液应保留约1分钟，随后进行步骤4.5和4.6。
10. 若进行hrGFP转染实验，将6孔板放回培养箱孵育24小时，以使细胞完成转染物质的转录。若进行葡聚糖通透化实验，则将6孔板放回培养箱孵育15分钟。

5. 细胞成像

1. 如需评估细胞死亡情况，可在成像前立即使用适当的活/死细胞染色剂进行复染。
2. 使用合适的显微镜对细胞成像，以评估转染/通透化效率。

结果

使用内径为0.86 mm毛细管的氦气射流对HeLa细胞进行通透化处理，并以10 kDa绿色荧光葡聚糖标记，结果如图1所示。通透化处理后立即用2 μl/ml的EthD-1溶液（LIVE/DEAD活力/细胞毒性检测试剂盒）对细胞进行复染，以显示细胞死亡情况。复染完成后立即封片并进行成像。本图展示了在三种不同出口压力下使用氦气射流处理的结果，并与对照样本进行了比较。可见，随着动态压力升高，通透化轨迹宽度和通透效率均增加，而细胞死亡率仅略有上升（A和B）。然而，当动态压力过高时，HeLa细胞会从盖玻片上被剥离，导致周边区域通透化效果显著减弱。关于细胞剥离与转染效率的更详细分析此前已由Chouinard-Pelletier et al.¹⁵开展。

通过扫描电子显微镜观察，在细胞膜中发现了微孔（图 2）。使用内径为 0.86 mm 的毛细管，在出口压力为 300 Pa 的条件下，以氦气射流对 HeLa 细胞进行穿孔处理。完成穿孔...

讨论

惰性气体射流透化是一种用于贴壁细胞转染的有效技术。该技术利用机械力将生物分子导入细胞，无需使用可能有害的化学试剂或病毒载体。该方法有望为研究人员和临床医生提供一种高效且相对简单的精确转染细胞的手段。其透化过程具有独特的选择性，允许研究人员仅对单个菌落中的特定细胞进行处理，这在多种应用中具有重要价值。

可根据具体实验需求调整多个参数，例如毛细管喷嘴直径和角度、气体流速、液体和毛细管高度、细胞系、目标生物分子以及惰性气体的种类。本方案中已指定固定的液体液位和毛细管高度，这些数值的选择旨在尽量减少实验中涉及的变量数量。目前，我们正在通过实验流动可视化和计算流体动力学对系统进行建模。这将帮助我们更深入地理解作用于细胞的力，从而确定通透化作用对液体性质等变量的依赖关系。

必须注意细胞能够存活的最大动态压力。研究发现，当气体射流喷嘴高度为 3 mm 时，一旦动态压力接近 200 Pa，HeLa 细胞就可能发生剥离。这一结果与其他研究一致，例如 Lu et al. 观察到 WT NR6 成纤维细胞在 200–265 Pa ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活力型 hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	用于 HeLa 细胞转染实验的绿色荧光蛋白
葡聚糖，AlexaFluor 488 标记；10,000 MW，阴离子型，可固定	Life Technologies Inc.	D22910	用于通透性实验的葡聚糖
LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒	Life Technologies Inc.	L3224	用于哺乳动物细胞的复染
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	成像时用于载玻片封片
超高纯度氦气	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM 高糖培养基 - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	用于 HeLa 细胞培养
胎牛血清	Invitrogen	26140079	用于 DMEM 培养基
青霉素-链霉素溶液（液体）	Invitrogen	15140-122	用于 DMEM 培养基
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x			实验室自制
			表 1。所需试剂列表
6 孔透明 TC 处理培养板	Corning	3506
#1 22 x 22 盖玻片	Fisher	12-542B
玻璃毛细管	World Precision Instruments		WPI 尺寸信息
内径 (mm)：1, 0.86, 0.68, 0.5 订货号：1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo 流量控制器	MKS	M100B01314CS1BV	质量流量控制器，M100B 系列，需外接 12 V 电源
USB-6009 数据采集设备	National Instruments	779026-01
带步进电机及控制器的 UniSlide 装置	Velmex		两套 MA15 系列 UniSlide 装置，配备由 Velmex 提供的 Vexta 1.8° 步进电机，并由 VXM 步进电机控制器控制
			表 2。 所需设备列表