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优化的实验方案 Mycobacterium leprae 品系管理：裸鼠冷冻保种与维持

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DOI：

10.3791/50620

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2014年3月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Instituto Lauro de Souza Lima (ILSL), 2Laboratory Animal House, Instituto Lauro de Souza Lima (ILSL), 3Department of Microbiology, Instituto Lauro de Souza Lima (ILSL), 4Department of Pharmacology, Instituto Lauro de Souza Lima (ILSL)

本文内容

摘要

麻风分枝杆菌， 麻风病的致病因子无法生长 体外我们描述了一种易于遵循的制备杆菌悬液的方案，以确保大量菌体的维持 M. leprae 适用于多种应用。本文详细描述了通过小鼠足垫接种进行传代、评估杆菌活力以及杆菌储备液的冻存与复苏的实验方案。

摘要

麻风病由Mycobacterium leprae引起，是一种重要的传染病，在包括巴西在内的世界许多国家仍呈地方性流行。目前尚无已知方法可在体外培养M. leprae，这为该病原体的实验室研究带来了重大障碍。因此，M. leprae菌株的维持与增殖通常在无胸腺裸鼠（NU-Foxn1nu）中进行。使用小鼠的实验室条件易于获得、操作简便，并可实现标准化及实验方案的建立，从而获得可重复的实验结果。本报告中，我们描述了一种利用胰蛋白酶从裸鼠足垫中纯化杆菌的简单方法，所得菌悬液细胞碎片极少，且经荧光显微镜检测显示细菌活力指数较高。同时，我们还展示了一种对齐尔-尼尔森染色结合光学显微镜进行杆菌计数的标准方法的改良。此外，我们还介绍了一种冻存与复苏杆菌菌种的方案，作为M. leprae菌株保藏与储存的替代方法。

引言

麻风病是由Mycobacterium leprae引起的一种疾病，在全球许多国家仍是一个重要的公共卫生问题1,2。尽管麻风病被认为是一种影响皮肤和周围神经的传染病，但关于其复杂免疫病理机制的相关环节，目前仍存在诸多认知空白。

阻碍M. leprae研究的一些难点特征包括其无法在人工培养基上生长，以及相对较长的倍增时间（约14天）3,4。大多数使用M. leprae的实验操作均采用从麻风病患者皮肤病变中纯化的杆菌，或从实验动物模型（如犰狳和多种小鼠品系）中获得的杆菌进行设置5,6。

多年来，研究人员一直依赖从多菌型麻风病患者的皮肤病变中纯化M. leprae，用于实验操作。尽管已尝试多种体外培养或维持活M. leprae的实验室条件，但迄今为止，动物模型仍被证明是最适合研究用途的系统。20世纪60年代和70年代，研究人员开始使用小鼠和犰狳来检测和评估M. leprae的活力，监测细菌在抗M. leprae药物作用下的生长情况，以及用于分枝杆菌菌株的增殖与维持2,4。

动物模型存在一些局限性，尤其是在犰狳和非人灵长类动物中，包括伦理问题、动物饲养成本高、需要特殊的饲养基础设施，以及实验结果和最终产量的可重复性差。目前，小鼠是麻风病研究首选的模式动物。使用小鼠的实验室条件易于获得，操作简便，并可实现标准化的实验方案7,8,9。裸鼠已被用于维持M. leprae菌株，因为即使初始活菌载量较低，由于其T细胞缺陷的免疫反应，仍可导致显著的肉芽肿形成和良好的杆菌增殖。因此，该动物模型已在麻风病研究领域获得广泛认可。

本报告中，我们介绍了一种从裸鼠足垫中酶法纯化杆菌的简单方案，旨在制备细胞碎片极少且细菌活力指数高的M. leprae菌悬液。细菌活力通过荧光显微镜检测确定，该方法可在实验室中快速完成。我们还对传统的冷Ziehl-Neelsen染色结合光学显微镜进行杆菌计数的方法进行了改良。此外，我们提供了一种M. leprae菌株保藏与储存的替代方案，可实现杆菌储备液的冷冻与解冻保存。

方案

1. 准备 麻风分枝杆菌 悬浮液

  1. 在处死裸鼠（NU-Foxn1nu）之前，准备好胰蛋白酶溶液和培养基（试剂方案 - 方案 1、2 和 3）。根据《美国兽医协会动物安乐死指南：2013年版》10，在接种M. leprae后4-5个月处死裸鼠（动物实验及图像使用已获圣保罗大学巴鲁埃里牙科学院动物护理委员会批准，并按照其指南进行）。在用于处理动物的生物安全柜内，用70%乙醇酒精清洁整只小鼠。
  2. 使用止血钳夹住后肢足部，在跗关节远端固定。用剪刀在止血钳下方剪下足部，并将足部浸入2%碘液中20分钟。 然后对另一只后足重复此操作。
  3. 将足部转移至另一个洁净的生物安全柜中进行后续操作。从2%碘液中取出足部，用无菌纱布擦干，然后使用22号或23号手术刀片切取两个足垫组织，去除靠近骨骼的所有软组织（真皮、表皮、肌腱和神经）。去除跖骨以及第1和第5节趾骨。将组织置于无菌培养皿中，用刀片刮除表皮。用剪刀将组织剪成小块，转移至圆底试管中。称量组织重量，并加入1 ml Hanks平衡盐溶液（HBSS）。将试管置于冰上，防止样品升温。
  4. 再加入1 ml HBSS，使用组织匀浆器匀浆样品。
    1. 第一次匀浆循环：以速度4（14,450 rpm）进行3次脉冲，每次15秒。
    2. 将上清液转移至无菌50 ml锥形管中，通过细胞筛过滤以去除残留碎片。让溶液自然重力滤过。
    3. 再加入2 ml HBSS，重复匀浆循环（第 1.4.1节），再次将样品通过细胞筛过滤。
    4. 用HBSS冲洗滤网，使总体积达到9 ml。弃去细胞筛。
  5. 解冻一份0.5%胰蛋白酶溶液。 向9 ml细胞悬液中加入1 ml胰蛋白酶，使终浓度为0.05%。弃去剩余已解冻的胰蛋白酶。将混合物在37 °C水浴中孵育60分钟。孵育结束后，加入无菌生理盐水将体积补至40 ml，以稀释胰蛋白酶。
  6. 在4°C下以1,700 × g离心30分钟。
  7. 小心倒置试管弃去上清液。轻弹试管使沉淀重悬，然后加入1 ml无菌生理盐水。将悬液转移至新的锥形管中，并测量最终悬液体积（用于计算每克组织的产量）。
  8. 在将悬液转移至新管时，使用带26 G针头的1 ml胰岛素注射器反复吹打，以进一步匀浆杆菌悬液。
  9. 通过将2滴（50 μl）悬液分别接种至7H9培养基和Lowenstein-Jensen培养基中进行微生物学检测，37 °C孵育30天，以检测是否存在污染性分枝杆菌。同样，接种脑心浸液（BHI）培养基，37 °C孵育24小时，以检测是否存在污染性需氧细菌。
  10. 将悬液分装至若干试管中用于染色：35 μl用于冷Ziehl-Neelsen染色（方案2），200 μl用于活力测定（方案3）。
  11. 经Ziehl-Neelsen染色（ZN）后，计算每毫升酸性抗性杆菌数（AFB/ml）。用于裸鼠接种时，配制浓度为1 × 108 AFB/ml的悬液；确保有足够的体积用于每只动物每个足垫接种30 μl（方案 5），并在接种前保持悬液低温。用于冷冻保存时，配制浓度为1 × 107 AFB/ml的悬液（方案4）。

2. 冷抗酸染色法 

  1. 在开始染色前，配制血清/酚溶液和ZN染色液（试剂方案 - 方案4和5）。使用免疫组织化学笔在三张载玻片上各画三个圆圈（内径10 mm）。用2号铅笔标记载玻片：（1）正常或未稀释，（2）1:10，（3）1:100（注意： 一些石墨在齐-尼染色后会褪色。
  2. 将细菌悬液（步骤 1.10）进行 1:10 和 1:100 的连续稀释， 即 加入5 μl未稀释的悬液和45 μl生理盐水，然后取5 μl 1:10稀释液，加入45 μl生理盐水。
  3. 每圈加入5 μl血清/酚溶液和10 μl杆菌悬液。用一次性接种环的柄部混匀并均匀涂布于圈内区域。将载玻片置于水平桌面上，静置至悬液完全干燥。
  4. 干燥后，通过快速通过火焰固定涂片  在本生灯的蓝色火焰上将载玻片来回通过3次（总计约20秒）11.
  5. 染色时，用过滤后的齐-尼氏石炭酸复红（约5 ml）覆盖载玻片整个表面，作用20分钟。
  6. 用流动的水（缓慢水流）冲洗载玻片。
  7. 用10%酸性酒精溶液覆盖载玻片约20秒。
  8. 再次用流动水冲洗载玻片。
  9. 用亚甲蓝溶液覆盖载玻片，孵育5分钟。
  10. 用流水冲洗载玻片，并在室温下晾干。
  11. 使用100倍油镜物镜计数20个视野/圆（每张玻片共60个视野）。根据《麻风病实验室技术》中的描述，每毫升抗酸杆菌（AFB/ml）的计算方法如下：12:
    AFB/视野 = 在3个圆圈（60个视野）中发现的全部分枝杆菌数量除以60。
    AFB/ml = AFB/视野 × 常数（圆面积 × 100 ÷ 物镜孔径面积），若计数的是稀释后的悬液，则需将 AFB/ml 数值乘以稀释倍数（10 或 100）。

3. 活性测定 

  1. 开始前，准备好经高压灭菌的 M. leprae 悬液（试剂制备方案 - 方案7）。使用适当的试剂盒（参见试剂与设备表）对悬液中 M. leprae 的存活能力进行定性检测。在弱光条件下进行以下稀释操作：将溶液A用生理盐水稀释10倍（1 μl 原液加9 μl 生理盐水），将溶液B用生理盐水稀释20倍（1 μl 原液加19 μl 生理盐水）。
  2. 向200 μl 待测菌悬液（步骤1.10）中加入3.6 μl 稀释后的溶液A和6 μl 稀释后的溶液B。通常将预先高压灭菌的 M. leprae 悬液作为活力染色的阴性对照。
  3. 将悬液在室温避光条件下孵育15分钟。
  4. 在4 °C条件下，以10,600 × g离心5分钟。
  5. 弃去上清液，将沉淀重悬于15 μl 10%甘油溶液中。取8 μl 悬液滴加于洁净载玻片表面，并加盖一小块盖玻片。使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察（参见Molecular Probes推荐方案）。通过比较Syto 9（Sy）染色与碘化丙啶（PI）染色结果来评估染色效果。
    注意：Sy染料可穿透所有死菌和活菌，而PI染料仅能进入细胞膜受损的细菌。高压灭菌后的悬液（阴性对照）可能因存在细胞碎片而形成细菌聚集体。用于活/死评估的半定量评分标准为0至2+：0表示少于30%的细胞PI染色阳性；1+表示30–50%的细胞PI染色阳性；2+表示超过50%的细胞PI染色阳性。评分为0被视为最适于使用。

4. M. leprae 悬液的冻融

  1. 开始前，配制冻存液（试剂配制方案 - 方案6）。冻存时采用以下步骤：
    1. 取150 μl含1 x 107 AFB/ml的菌悬液，加入无菌冻存管中，再加入1 ml冻存液。
    2. 将冻存管放入冻存盒中，于-80 °C保存24小时。
    3. 将冻存管转移至储存盒中，于-80 °C长期保存。
  2. 复苏时采用以下步骤：
    1. 从-80 °C取出含有冻存菌悬液的冻存管，放入37 °C水浴中，开始解冻菌悬液。
    2. 将解冻后的菌悬液倒入含有20 ml无菌生理盐水的离心管中，轻轻混匀直至完全解冻。
    3. 在4 °C条件下，以1,700 × g离心30分钟。
    4. 弃去上清液，加入适量无菌生理盐水至所需体积。通过注射器反复吹打（见步骤1.8）使菌悬液均匀混悬。
    5. 进行齐-尼染色、活菌计数及接种操作时，请参照方案2、方案3和方案5。

5. 小鼠接种 

  1. 本操作需要两人协作完成，一人固定小鼠，另一人注射接种物。待接种动物应遵循伦理准则和相关规定，所有操作必须经机构动物护理与使用委员会批准。 用手抓住裸鼠颈背部皮肤以固定动物，使其四肢朝上。
  2. 用26 G针头反复抽吸以充分混匀悬浮液。使用1 ml注射器吸取足够接种两只足垫的杆菌悬液（每足垫30 μl）。
  3. 握住后肢足部，注射前用70%乙醇清洁足垫部位，将针头斜面向上，从足垫近端向远端方向行皮内注射，注入30 μl悬液。足垫注射可在麻醉小鼠中进行。
  4. 注射后停留5秒再拔出针头，以避免接种物反流。接种后小鼠应饲养于软垫垫料环境中，需监测其活动能力及是否存在自残行为。

结果

该实验方案的成功可通过三种方式评估。首先，通过接种物中细胞碎片的量以及最终悬液中活杆菌所占百分比来评估接种物的质量（见方案3）。如图1和图2所示，最终的杆菌悬液中细胞碎片极少，且活力很高（评分为0+）；请注意，大多数杆菌被Syto 9绿色荧光染料染色（该染料可穿透100%的死菌和活菌，图1），仅有少量杆菌被红色PI荧光染料染色（该染料仅可穿透细胞膜受损的细菌，图2）。

荧光显微镜下的显微图像；细胞中绿色荧光蛋白的表达。
图 1. M. leprae 悬液的 Syto 9 染色。 绿色荧光显示存活和死亡的 M. leprae 均存在。400X。

荧光显微镜图像；红色颗粒；细胞结构分析；光学激发。
图 2. M. leprae 悬液的碘化丙啶（PI）染色。 红色荧光显示死亡的 M. leprae 数量较少。400×。

其次，高活力的接种物在接种后4-5个月会影响分枝杆菌在动物足垫内的增殖，并形成明显的肉眼可见病灶，如视频中所示（方案1）。评估该方案成功与否的第三种方法是通过评价将不同冻存时间的分枝杆菌接种至小鼠足垫后，抗酸杆菌（AFB）在体内的存活与增殖情况（见方案4）。

实验（动物）第0天冷冻时每毫升分枝杆菌数量第0天活力评分冷冻时间（天）冷冻后接种的分枝杆菌数量冷冻后活力评分7个月后回收的每毫升分枝杆菌数量
1 (1)1.0 x 1070+601.7 x 1051+2.3 x 108
1 (2)1.0 x 1070+601.7 x 1051+3.8 x 107
1 (3)1.0 x 1070+601.7 x 1051+8.5 x 107
1 (4)1.0 x 1070+601.7 x 1051+4.6 x 107
2 (1)1.0 x 1070+154.2 x 1051+1.7 x 107
2 (2)1.0 x 1070+154.2 x 1051+4.8 x 106
2 (3)1.0 x 1070+154.2 x 1051+8.6 x 106
3 (1)1.0 x 1070+151.7 x 1051+1.2 x 107
3 (2)1.0 x 1070+151.7 x 1051+1.8 x 107
3 (3)1.0 x 1070+151.7 x 1051+1.8 x 107
3 (4)1.0 x 1070+151.7 x 1051+2.6 x 107
3 (5)1.0 x 1070+151.7 x 1051+3.7 x 106

表1. 使用冻存后悬液检测M. leprae增殖的结果。

表1展示了使用冻存后的M. leprae悬液进行培养的结果。解冻后悬液的活力评分为1+。冻存方案在三次独立实验中进行，以测试不同的冻存时间。在接种物分别冻存15天或60天的两次实验中，结果相似：冻存后传代培养在接种7个月后，每个足垫回收的抗酸杆菌（AFB）数量均增加了10–1,000倍（表1）。因此，将M. leprae悬液在添加OADC（油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶）的7H9培养基中冻存，能够维持其活力。

采用三种接种物评估 M. leprae 在两种不同冷冻时间（15 天和 60 天）后的增殖情况。接种 7 个月后，从接种小鼠的足垫中回收杆菌，并经齐-尼染色后进行计数。半定量活力评分标准：0 表示 PI 染色细胞少于 30%；1+ 表示 PI 染色细胞占 30–50%；2+ 表示 PI 染色细胞超过 50%。AFB：抗酸杆菌。

讨论

迫切需要一份关于成功繁殖M. leprae的图文并茂的详细实验方案。本研究证明，通过过滤和胰蛋白酶消化制备接种物的方法，可以获得细胞碎片极少且杆菌活力高的接种物（评分0+）。已有研究使用氢氧化钠来分散组织，以纯化杆菌6。  我们实验室在使用氢氧化钠纯化M. leprae时，发现会导致杆菌成团，从而影响悬液的均一性，妨碍活力测定及动物接种（数据未显示）。

通过过滤和胰蛋白酶消化制备接种物时可能遇到的问题包括大量细胞碎片 以及接种物被细菌或真菌污染。如果在纯化后观察到大量细胞碎片，则可能是胰蛋白酶已失活，或存在过量的生物材料。必须评估胰蛋白酶储备液的酶活性。 若怀疑初始生物材料过多，应将材料分装为若干等份，并分批进行实验操作。 为避免接种物被细菌或真菌污染，必须注意在无菌条件下处理材料。 一旦检测到真菌和/或细菌污染，应弃去该悬液。

本方案的一个局限性在于，使用所述半定量方法评估活力具有主观性。 尽管半定量评估活力的方法相比已发表的定量方法精确度较低，但更具实用性6。活力评分为0+和1+时，足以满足M. leprae的传代培养和冻存需求。Lahiri et al. 已经证明，接种含有80–90%活菌的接种物后，裸鼠在接种后4–5个月时足垫即可达到适合收获的条件（高活力杆菌）。因此，早期感染阶段（约4个月）是最佳收获时间。对于冻存接种物的收获，本方案中裸鼠的接种后维持时间较长（7个月），以确保获得完整的生长曲线。确保足够活力的关键步骤是使用新鲜的杆菌悬液，最好在从宿主获取生物材料并完成处理后的24小时内使用。 此外，试剂的质量、新配制的稀释胰蛋白酶以及活力染色液，对于保证结果的可重复性也至关重要。 

该方案的另一个局限性在于，最终结果 M. leprae 悬浮液未完全去除宿主 DNA、RNA、蛋白质， 等等. 因此，必须增加其他纯化步骤才能获得 M. leprae 不含宿主细胞成分的悬液

已有研究报道了一种通过冷冻M. leprae病变的完整组织标本以维持分枝杆菌活性的方法9。然而，Portaels 等的研究表明，在冻融来自犰狳的M. leprae感染组织标本后，其活性显著下降，损失范围达65–97%9。 我们的实验方案显示，与未冷冻的等分试样相比，M. leprae悬液在冻融后的存活指数有所下降（表1）。 事实上，将M. leprae悬液置于冷冻保护液中冷冻后，其存活率在50–70%之间，存活评分记为1+，而未冷冻悬液的存活评分为0+。尽管如此，在接种裸鼠后7个月，M. leprae的增殖情况仍令人满意（表1）。将冷冻保存60天后复溶的样品接种裸鼠，其分枝杆菌数量较初始接种量平均增加了100倍。结果表明，将M. leprae悬液而非感染组织标本置于冷冻保护液中冷冻，效率更高。 本方案中的一个关键步骤是将抗酸杆菌（AFB）置于冷冻容器中进行缓慢冷冻，这是维持其活性所必需的，Colston和Hilson的研究已证实了这一点8。后续将开展实验，进一步评估分枝杆菌在更长时间冷冻保存后的存活能力。

总之，由于 M. leprae 不生长 体外我们的方案为维持有活力的接种物提供了一种快速简便的替代方法，且成功的冷冻步骤使得菌株无需通过动物连续传代即可保存，从而能够建立明确菌株的保藏库。

本部分包含执行本方案所需试剂的制备说明。

1. 胰蛋白酶

胰蛋白酶0.5 g
蒸馏水加至 100 ml

过滤除菌，于 -20 °C 保存。

2. 7H9

7H9 肉汤基础4.7 g
40% 甘油储备液5 ml
蒸馏水加至 900 ml

将碱与水混合，然后在搅拌的同时加入甘油。在121 °C下高压灭菌20分钟以灭菌。于4 °C保存。

3. 脑心浸液（BHI）

BHI37 g
蒸馏水加至 1,000 ml

在121 °C下高压灭菌15分钟以灭菌。4 °C保存。     

4. 酚血清

4.1）5% 苯酚

苯酚5 ml
蒸馏水加至 100 ml

4.2）血清苯酚

胎牛血清2 ml
5% 苯酚98 ml

4 °C 下保存。

5. 抗酸染色冷染液的配制

5.1）品红酸性染料

品红1 g
熔融至 60 °C 的苯酚晶体5 ml
纯乙醇10 ml
蒸馏水加至 100 ml

每次使用前均需过滤。

5.2）亚甲蓝基础液

亚甲蓝3 g
95% 乙醇加至 200 ml

5.3）醇酸

70% 酒精990 ml
盐酸10 ml

6. 冻存用培养基：

OADC10 ml
甘油20 ml
7H9 培养基加至 100 ml

使用前将甘油进行高压灭菌，并通过过滤法对OADC进行除菌。

7. 高压灭菌的 M. leprae 悬液

在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。于 -20 °C 保存。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢 Beatriz G. C. Sartori、Lázara M. Trino、Ana Elisa Fusaro 和 Cláudia P. M. Carvalho 提供的技术支持。感谢 Pranab K. Das 对动物实验设施建立的支持。感谢 Lais R. R. Costa 对稿件的审阅。本研究得到了圣保罗州麻风病防治基金会和圣保罗州研究资助基金会（FAPESP 2009/06122-5）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细菌活性检测试剂盒 BacLightInvitrogen; Molecular ProbesL7007
Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）SigmaH9269
Cryo 1 °C 冻存容器Nalgene5100001
罗氏琼脂培养基（Lowenstein-Jensen 培养基）LB Laborclin901122
生理盐水TEK Nova IncS5812
标记笔 PenDakoS2002
50 ml 锥底离心管TPP91050
细胞滤网  - 40 µm 尼龙BD Falcon352340
胰蛋白酶SigmaT-7409
Middlebrook 7H9 液体培养基基础Sigma-AldrichM0178 Fluka
甘油Gibco BRL15514011
脑心浸液（BHI）Oxoid LTDACM1135
品红Merck Millipore1159370025
苯酚 Invitrogen15509037
乙醇Merck MilliporeEX02764
盐酸Merck1131349010
BBL Middlebrook OADC（油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶）Becton Dickinson211886
胎牛血清Gibco; LifeTechnologies26140079

参考文献

  1. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008. , Forthcoming.
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