运动神经切断及活体斑马鱼中胶质细胞行为的延时成像

摘要

尽管周围神经系统（PNS）在损伤后具有显著的修复能力，但调控这一现象的细胞和分子机制仍知之甚少。通过使用活体转基因斑马鱼和可重复的神经横断实验，我们能够研究神经变性和再生过程中胶质细胞的动态行为。

摘要

神经系统常被描述为身体中一个固定不变的组成部分，尽管它实际上是一个极具可塑性和适应性的器官系统，能够以稳定且模式化的方式对外界刺激作出反应，同时保持惊人的灵活性与可塑性。与中枢神经系统（CNS）不同，外周神经系统（PNS）具备显著的自我修复能力，但我们才刚刚开始理解调控这一现象的细胞与分子机制。利用斑马鱼作为模式系统，我们前所未有地获得了将再生研究与 体内 成像与遗传操作。周围神经由轴突构成，其外包裹着多层胶质细胞和结缔组织。轴突由髓鞘化或非髓鞘化施万细胞包绕，这些细胞连同轴突进一步被一种称为神经束膜的细胞性鞘包裹形成神经束。在损伤后，成年个体的周围神经具有显著的能力，可清除受损的轴突碎片并重新支配靶组织。为了研究所有周围神经系统胶质细胞在周围神经再生中的作用，本文描述了一种轴突横断检测方法，该方法利用 commercially available 氮泵染料激光器对活体转基因斑马鱼中的运动神经进行轴突切断。我们进一步介绍了将此类实验与损伤神经及对照神经的延时成像相结合的方法。这一实验范式不仅可用于评估胶质细胞在神经再生中的作用，还可作为揭示神经系统修复所依赖的分子机制的研究平台。

引言

斑马鱼因其光学透明性以及易于进行转基因操作，被广泛用于研究神经系统的发育。这两项优势相结合，使得在活体胚胎中对动态细胞行为进行卓越的成像成为可能。此外，由于斑马鱼与哺乳动物几乎共享所有神经系统形成所必需的基因，因此在此模式生物中获得的细胞与分子信息可直接推广至其他脊椎动物物种。尽管斑马鱼在神经发育研究中具有极强的实用性，但其独特的特性还具有揭示神经系统损伤后维持与重建机制的潜力。斑马鱼幼体在发育至较晚的幼体阶段时仍保持透明，且可通过使用黑色素生成的药理学抑制剂或缺乏色素细胞的遗传突变体，有效阻断其色素沉着。因此，利用该模式生物研究较年长个体中的神经损伤与再生是可行的，并提供了直接探究神经系统重建过程中细胞与分子机制的独特机会。在本论文中，我们描述了如何在斑马鱼幼体外周神经系统（PNS）中高效且可重复地造成神经损伤。该损伤模型不仅适用于研究变性过程，还可用于研究外周胶质细胞与免疫细胞的反应，以及这些细胞群体在再生过程中的相互作用。

周围神经系统（PNS）是一个复杂的运动神经和感觉神经网络，负责在中枢神经系统（CNS）与皮肤、器官和肌肉之间传递信息，使生物体能够与环境互动并维持生存。在这些神经中，周围胶质细胞（包括髓鞘形成和非髓鞘形成的施万细胞以及神经束膜胶质细胞）与结缔组织共同包裹轴突，最终形成成熟的神经。这些神经受损后会启动一种称为沃勒变性（Wallerian degeneration）¹⁰的过程。这种轴突断裂、免疫细胞募集、碎片清除及再生的机制具有高度保守性，并受到严格的遗传调控¹。以往在哺乳动物系统中的研究已描述了施万细胞在神经变性和再生过程中的作用^{1, 2, 6, 8}。在这些基于固定组织或细胞培养的研究中，施万细胞不仅能够募集巨噬细胞至损伤部位以协助清除碎片，还能自身参与髓鞘的吞噬作用。尽管这些研究提供了极为重要的信息，但我们此前从未在活体（in vivo）条件下实时观察到胶质细胞对周围轴突损伤的反应，也尚无其他研究探讨过在这些过程中不同类型周围胶质细胞之间的相互关系。

近期，多个实验室采用斑马鱼和激光介导的轴突损伤方法研究了沃勒变性，其方法与本文所述类似^{4, 5, 7, 9}。在其中一些研究中，研究人员使用自行构建的双光子共聚焦显微镜，对幼体斑马鱼中位置较浅的感觉轴突进行了横断损伤^{4, 5, 9}。另一项研究与我们的实验设计非常相似，使用商用激光消融系统对5日龄幼鱼腹侧运动神经中位置更深的轴突进行了切断⁷。在这两类实验设置中，研究重点均为沃勒变性过程，并同时对轴突和免疫细胞进行了成像观察。为进一步拓展这些研究，我们描述了在年龄较大、神经更为成熟且已髓鞘化的幼鱼中损伤运动轴突，并检测了在变性和再生过程中所有与神经相关的周围胶质细胞的反应。

为此，我们对受精后6天和7天（dpf）的幼鱼进行运动神经横断，并观察单个胶质细胞群体的反应，同时研究这些细胞群体在受损轴突沿线的相互作用。利用标记外周胶质细胞（包括施万细胞和神经束膜胶质细胞）以及轴突标记物的双转基因和三转基因品系，我们采用一种 commercially available 激光消融系统，该系统由氮泵染料激光器（波长435 nm）与转盘共聚焦系统连接组成，以实现轴突横断。此实验装置使我们能够对活体斑马鱼幼鱼进行观察，损伤特定的外周运动轴突束，并对不同胶质细胞群体对轴突损伤的反应及其相互关系进行延时成像。本方案还可进一步调整，用于在不同年龄的斑马鱼、不同转基因品系或遗传突变体中制造神经损伤，以回答不同的科学问题。

方案

1. 斑马鱼胚胎消融与活体成像的制备与固定

1. 配制0.8%低熔点琼脂糖的卵水母液。分装至13×100 mm一次性培养管中，4 °C保存备用。
2. 交配携带稳定整合转基因的成年斑马鱼，以荧光标记目标运动神经元和胶质细胞类型。将斑马鱼胚胎收集于卵水中，并置于28.5 °C培养箱中，以便后续准确分期³。
3. 受精后约24小时（hpf），去除卵水，加入含0.002% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的卵水。将胚胎放回培养箱。
4. 在24至96 hpf期间，应在荧光体视显微镜下筛选具有目标转基因的胚胎。将筛选出的胚胎转移至新鲜的含PTU卵水中，并放回培养箱。
5. 当幼鱼达到受精后6天（dpf）（或所需年龄）时，从培养箱中取出，挑选数尾幼鱼用于制片，并转移至较小的培养皿中。
6. 去除培养皿中的水，立即替换为含约0.02% 三卡因（Tricaine）的PTU卵水。让幼鱼在麻醉液中静置约5分钟。
7. 取一份0.8%低熔点琼脂糖放入烧杯中，加入自来水，微波加热30秒，或直至琼脂糖完全融化。将烧杯冷却，直至培养管中的琼脂糖触感微温（不烫手）。
8. 选取一条麻醉后的幼鱼，转移至单孔或多孔35 mm玻璃底培养皿中。去除随幼鱼带入的水分，然后立即用足够量的温热琼脂糖覆盖幼鱼，使琼脂糖填满培养皿的玻璃底部区域，但不形成明显凸起。
9. 在琼脂糖凝固过程中，使用解剖针将幼鱼调整至侧卧位，紧贴培养皿底部，然后略微向背部倾斜。为确保后续损伤操作和成像的准确性，幼鱼必须紧贴培养皿底部的玻璃表面。使用解剖针维持幼鱼在此位置，直至琼脂糖完全凝固，幼鱼被牢固固定。
10. 待琼脂糖完全凝固后，缓慢用移液器加入足够的含三卡因的水（可使用麻醉时所用的相同三卡因溶液），完全覆盖琼脂糖和幼鱼。

2. 激光校准与测试

1. 开启所有共聚焦显微镜设备、用于激发斑马鱼转基因的适当二极管激光器以及氮气泵浦染料激光器。确保已安装“空白”分光镜，激光衰减器完全打开，并且已安装435 nm香豆素染料池。在计算机上打开成像软件。
2. 将63倍、数值孔径1.2的水浸物镜移至工作位置，并在物镜上滴加少量适用于水浸物镜的浸没介质。使用63倍物镜可实现良好的激光消融精度，而水浸物镜具有较大的工作距离，这对于操作6-7天龄的斑马鱼幼鱼是必要的。
3. 取一块单面镀有反射膜的玻璃载片用于激光校准。将载片反射面向下放置于显微镜载物台上。
4. 通过目镜在明场照明下找到并聚焦镜面上的划痕或蚀刻痕迹。明场光源会向下照射到玻璃载片上，但仅在镜面被划伤或蚀刻去除的区域才能透过并到达物镜，因此在目镜中镜面呈黑色，而蚀刻处则呈现为亮点或亮线。
5. 使用成像软件在计算机屏幕上观察并聚焦这些蚀刻痕迹。打开控制激光校准和功率设置的窗口。将脉冲次数设为“1”，衰减片设为“3”%透射率。脉冲次数表示激光在每个选定区域（ROI）内的发射次数，%透射率代表激光功率。请确保已为63倍、1.2NA水浸物镜选择正确的校准设置。
6. 从主工具栏中选择椭圆工具，在计算机屏幕图像上点击以创建一个圆形ROI。重复此操作共四次，使四个圆形ROI随机分布在图像中。
7. 某些系统可能具有安全功能，当目镜光路处于开放状态时禁止激光发射。若如此，请手动关闭通往目镜的光路。
8. 发射激光。这将在每个圆形ROI内产生四个微小的点状蚀刻。如果激光未发射，请检查激光器是否已开启并正确连接，以及通往目镜的光路是否已关闭。如果激光发射但未观察到蚀刻痕迹，请检查“空白”分光镜是否已正确安装。如果所有设置均正确，可逐步提高激光功率并进行“frap”操作，直至可见蚀刻痕迹。若需将激光功率调至10以上才能在玻璃上产生蚀刻，可能表明激光等离子体盒需要更换。
9. 如果蚀刻点位于所选ROI中心，则无需校准（继续执行步骤2.12）。如果蚀刻点偏离中心，则需要更新校准设置。
10. 进行校准时，点击更新校准设置。激光将发射一次，生成包含单个蚀刻点的图像。若未出现该点，取消校准过程，提高激光功率后重新开始校准。
11. 点击蚀刻点的中心位置。激光将再次发射并生成另一个点。点击新生成的点，并重复此过程，直至完成校准，屏幕上以网格形式出现9个蚀刻点。重复步骤2.6至2.9以验证校准是否成功。
12. 从显微镜载物台上取下玻璃载片，并清洁物镜。打开通往目镜的光路，将“空白”分光镜更换为“100%ILL”分光镜。

3. 使用激光消融进行神经切断及胶质细胞行为的活体共聚焦延时成像

1. 取下用于固定载玻片的载物台，更换为适合固定35 mm玻璃底培养皿的载物台。继续使用63倍、数值孔径1.2的水浸物镜。
2. 在物镜上滴加少量水浸介质，将固定有幼虫的培养皿放置于载物台上，并用夹具固定培养皿。
3. 通过目镜和宽场照明聚焦幼虫，定位运动神经。在体节10–20区域扫描神经，选择一条待切断的运动神经。
4. 使用成像软件在计算机屏幕上显示神经的实时图像。选择Z平面，采集未损伤神经的轴突和胶质细胞图像。
5. 在成像软件中设置延时成像参数，根据实验需求以5–30分钟的时间间隔采集所有细胞类型的Z投影图像。建议在进行消融操作前完成所有延时成像设置，以便在损伤完成后立即开始延时成像，避免延误。
6. 取下“100%ILL”分光镜，更换为“空白”分光镜，并关闭通向目镜的光路。
7. 返回神经的实时图像，使用适当的荧光通道观察将要被切断的轴突。
8. 使用椭圆工具，在待消融区域创建一个细长的椭圆形感兴趣区域（ROI），然后在选定区域内创建更小的ROI。
9. 在控制激光参数的窗口中，将脉冲次数设置为“2”，衰减片设置为“18%”透射率。在选定的ROI内发射激光。若ROI内仍存在荧光，提高激光功率，等待约10秒后再次发射激光。重复此过程，直至荧光在ROI内完全消失。
10. 等待10秒或更长时间，再次检查消融区域的荧光情况。需注意，某些ROI可能最初看似已被消融，实则仅为光漂白。若荧光恢复，需提高激光功率并再次发射激光。重复该过程，直至ROI内的荧光消失且在10秒内不再恢复。建议从较低激光功率开始，逐步增加至所需功率。所需激光功率可能因显微镜系统个体差异、香豆素染料使用时间、样本固定方式、幼虫年龄及组织厚度而异。一旦确定理想激光功率，可在同一实验后续神经消融中重复使用该设置。
11. 完成消融后，立即开始延时成像。
12. 延时成像结束后，使用成像软件整合数据，为每个时间点生成多通道彩色Z投影图像，并制作QuickTime视频，以便同时分析轴突与胶质细胞的行为变化。

结果

此处所述的检测方法可用于评估胶质细胞及其他与神经相关的细胞群体对轴突损伤的反应 体内. 视频 1 展示了使用该方法制造的神经损伤示例及周围胶质细胞的反应。该实验在 Tg(nkx2.2a:megfp);Tg(olig2:dsred) 斑马鱼，其中神经束膜胶质细胞表达膜定位的EGFP，运动神经元表达胞质DSRed。在一条6天龄活体斑马鱼的躯干运动神经的头侧投射路径上进行损伤，随后对EGFP和DSRed通道进行延时成像。这使得损伤后立即同时观察轴突和胶质细胞的行为成为可能。

图1展示了从视频1中截取的静态时间点的静态图像。虚线椭圆表示使用激光消融的感兴趣区域（ROI）。损伤后1分钟（mpt），消融区域无荧光信号，损伤区域从近端到远端断端的距离约为3.5 µm。可通过成像远端神经断端并观察华勒变性（Wallerian degeneration）的迹象（包括远端轴突断裂和快速清除）来确认横断操作的成功。在图1中，120 m...

讨论

该实验设计中最关键的步骤是：1）正确固定幼虫以进行损伤操作及后续的体内成像，以及2）校准激光并选择合适的功率参数，以实现干净的神经横断，同时将周围组织的额外损伤降至最低。为确保轴突切断实验在体内成像及后续分析中取得成功，建议将多个幼虫分别固定在独立的玻璃底培养皿中，或固定在带有分隔区的玻璃底培养皿内。在激光校准完成后，建议先在测试用幼虫上尝试不同的功率设置，以确定神经横断的最佳参数。这些参数在不同实验间通常较为一致，但在以下情况下可能发生改变：1）幼虫固定不当；2）使用了不同龄期的幼虫；3）激光未正确校准；4）激光设备需要维护；或5）神经位于前后位置差异较大的区域，导致组织厚度不同。理想的神经横断应在神经上造成2至5 μm的损伤，且不干扰邻近组织。

在分析任何细胞类型对神经系统损伤的反应时，我们建议至少进行两种类型的对照实验。第一种是选择一个紧邻目标神经但不接触任何神经组织的区域进行损伤操作，这有助于确定所观察到的细胞反应是由一般性损伤引起，还是由轴突损伤特异性引起。第二种对照是在同一尾鱼中对未受损伤的神经进行成像观察。此类对照可消除因胚胎发...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苯硫脲	Sigma	P7629-100G
芬奎尔三卡因甲磺酸盐 MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
低熔点琼脂糖	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview 细胞培养皿，玻璃底，无菌，Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
单孔玻璃底培养皿 35 × 10 mm，12 mm 厚	Willco Wells	GWSt-3512
MicroPoint 激光系统（含所有组件）	Andor Technology - 通过 Quorum Technologies, Inc. 购买	2203-SYS
MicroPoint 激光香豆素染料（435 nm）	Andor Technology	MP-27-435-DYE