革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

摘要

分离和表征革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的脂质A区域，有助于深入了解基于细胞表面的抗生素耐药机制、细菌存活与适应性，以及化学结构多样的脂质A分子如何差异性地调节宿主先天免疫反应。

摘要

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌主要的细胞表面分子，位于外膜双层结构的外层小叶上。LPS 可分为三个区域：远端的 O-多糖、核心寡糖以及脂质 A 区域，后者由一种脂质 A 分子种类和 3-脱氧-D-甘油-D-甘露-辛-2-酮糖酸残基（Kdo）组成。脂质 A 区域是细菌细胞存活所必需的唯一组分。在合成之后，脂质 A 会根据环境压力（如 pH 或温度）发生化学修饰，以增强对抗生素类化合物的抗性，并逃避宿主固有免疫应答介质的识别。本实验方案详细描述了从革兰氏阴性菌中进行小规模和大规模脂质 A 分离的方法。分离得到的物质随后通过薄层色谱法（TLC）或质谱法（MS）进行化学表征。除了基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱外，我们还描述了串联质谱分析脂质 A 分子种类的方案，包括采用电喷雾电离（ESI）结合碰撞诱导解离（CID）以及新近应用的紫外光解离（UVPD）方法。我们的质谱方案能够明确确定其化学结构，这对于表征含有独特或新型化学修饰的脂质 A 分子至关重要。我们还描述了利用放射性同位素标记细菌细胞中的脂质 A 并随后进行分离，以用于薄层色谱分析。与基于质谱的方案相比，薄层色谱法成本更低且速度更快，但在缺乏已知化学结构标准品的情况下，无法明确指认脂质 A 的化学结构。在过去的二十年中，脂质 A 的分离与表征已带来许多令人振奋的发现，加深了我们对革兰氏阴性菌生理学、抗生素耐药机制以及人类固有免疫应答的理解，并为抗菌化合物的研发提供了大量新靶点。

引言

脂多糖（LPS）是几乎所有革兰氏阴性生物的主要外表面分子，由三个分子结构域组成：远端O-抗原多糖、核心寡糖以及锚定在外膜双分子层外小叶上的膜结合型脂质A结构域^1,2。脂质A结构域包含3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸（Kdo）残基和一种脂质A分子，其中脂质A可定义为LPS在温和酸性水解后溶于氯仿的部分^1,2。标准的脂质A分子在化学结构上可描述为一个双葡糖胺骨架，具有六条酰基链和两个磷酸基团（即六酰基化、双磷酸化），这与模式生物大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中观察到的主要脂质A结构一致^1,2。共有九个在革兰氏阴性菌中保守存在的组成型表达基因负责脂质A结构域的合成（图1）^1,2。大多数细菌还具有一组额外的基因，这些基因在系统发育保守性上存在差异，参与脂质A的进一步化学修饰³。去磷酸化、酰基链的去除，以及添加氨基糖（例如氨基阿拉伯糖）和/或磷酸乙醇胺等化学基团是最常见的修饰方式（图1）。许多负责脂质A修饰的酶可直接被环境信号（如二价阳离子）激活，或其表达受双组分信号响应调节系统调控³。

宿主固有免疫系统对脂质A（lipid A）的识别由Toll样受体4/髓样分化因子2（TLR4/MD2）共受体介导

方案

所有溶液均应使用超纯水以及HPLC级甲醇和氯仿配制。含有甲醇、氯仿或吡啶等有机溶剂或浓酸、浓碱的溶液，必须在化学通风橱内配制和使用。所有溶液均可在室温下保存。溶剂应使用带刻度的玻璃量筒量取，并储存于带聚四氟乙烯（PTFE）衬里瓶盖的玻璃溶剂瓶中。含氯仿的溶剂若需长期保存，应置于棕色遮光玻璃瓶中，以避免生成高反应性的酸氯化物光气。聚四氟乙烯（PTFE）离心管和旋转蒸发仪烧瓶在使用前应先用甲醇和氯仿冲洗。处理溶剂和/或放射性废物时，应遵守必要的联邦、州和/或机构废物处置法规。

1. 大规模脂质A提取（50 ml至1.5 L）

1. 制备单相 Bligh-Dyer 混合液：氯仿-甲醇-1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4；体积比为 1:2:0.8（v/v）。在 1 L 溶剂瓶中加入 200 ml 氯仿、400 ml 甲醇和 160 ml PBS。盖紧瓶盖，通过倒置混匀。>30倍体积）。混匀过程中需定期松开瓶盖以排气，并密封保存。
2. 制备预平衡的Bligh-Dyer两相混合液——氯仿:甲醇:水（2:2:1.8 v/v）。将400 ml氯仿、400 ml甲醇和180 ml水加入1 L溶剂瓶中。盖紧瓶盖，通过倒置混匀，混匀过程中需定期松开瓶盖排气。室温过夜平衡后密封保存。
3. 配制弱酸水解缓冲液（50 mM 醋酸钠，pH 4.5；1% 十二烷基硫酸钠（SDS））。配制 500 ml 缓冲液时，称取 2.05 g 醋酸钠，转移至 50....

结果

典型脂质A E. coli 和 沙门氏菌肠亚种 血清型鼠伤寒沙门菌是一种在1-和4'-位带有磷酸基团的葡萄糖胺双糖六酰化结构。在营养丰富的培养基中生长时（例如 Luria肉汤）中，部分脂质A在1位含有焦磷酸基团，产生一个 tris-磷酸化物种³⁶ (图1). Kdo（3-脱氧-D-甘露糖-octulosonic acid）连接在6'-羟基上，作为连接脂质A与其余碳水化合物结构域的桥梁（即 核心寡糖和O-抗原区域）的LPS。尽管革兰氏阴性菌在脂质A生物合成途径上具有与之相似的保守通路，类似于 E. coli K-12中，脂质A的结构具有高度多样性。这种多样性源于一系列潜伏酶的作用，这些酶可修饰脂质A结构，并在环境刺激下被激活。例如，在 S. enterica 脂质A的磷酸基团可被阳离子糖L-4-氨基阿拉伯糖修饰（图1；蓝色）或含磷酸乙醇胺残基（图1；品红）。在 沙门氏.......

讨论

在本方案中，我们详细描述了从细菌全细胞中分离脂质A组分的方法，并介绍了基于薄层色谱（TLC）或质谱（MS）的分析方法，用于对该分离产物进行化学表征。串联质谱是一种强大的从头（de novo）解析生物化合物结构的策略，在对自然界中广泛存在的各类脂质A分子进行化学表征时具有不可替代的价值。碰撞诱导解离（CID）和紫外光解离（UVPD）是两种互补的激活方法，可产生不同类型的碎片离子，为脂质A分子提供关键的指纹图谱。结合使用CID和UVPD进行二级质谱（MS/MS）碎裂分析，能够揭示脂质A结构之间的细微差异，从而更精确地完成化学结构的指认。此类数据对于建立脂质A分子种类在生物学中结构与功能之间的精确关联至关重要。此外，我们还描述了在小规模细菌培养物中利用³²P对脂质A组分进行放射性标记的操作流程，通过薄层色谱结合放射自显影技术，可直观显示³²P标记脂质A的化学分布模式。

本实验方案具有若干特点，任何使用者均应予以注意。对于大规模脂质A制备（方案1），起始溶剂与细菌沉淀物用量之间的比例可进行优化，以提高总体产率。然而，该比例只能通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC 级
甲醇	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC 级
特氟龙 FEP 离心瓶	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
硅胶 60 薄层层析板	EMD Biosciences	5626-6
3MM 型号色谱纸	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
质谱仪
ExciStar XS 准分子激光器	Coherent Inc.
PicoTip 纳喷电喷雾电离发射器	New Objectives		≥ 30 μm 以减少堵塞
Model 505 脉冲/延迟发生器	Berkeley Nucleonics Corporation
热板 Thermolyne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 螺口一次性硼硅酸盐培养管	Corning Pyrex	99449-16X
可重复使用 GPI 45-415 螺口聚四氟乙烯（PTFE）盖	Corning	9999-152
个人分子成像系统（磷屏成像仪）	BioRad	170-9400
自动放射自显影暗盒	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
磷屏 SO230	Kodak
肽质量标准品试剂盒	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A 超声破碎仪	Branson	101063196
1.5 ml 12x32 mm 锥底螺口小瓶	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1