激活的癌基因（如 RASV12）与细胞极性基因（如 scribbled）的突变之间的协同作用，可导致果蝇（Drosophila）体内肿瘤的生长，且肿瘤细胞还表现出侵袭性行为。本文介绍了一种诱导和观察良性及侵袭性肿瘤的简单实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
在过去几十年中，Drosophila 果蝇极大地推动了我们对正常发育和疾病遗传基础的理解，时至今日，它仍在复杂疾病研究中发挥着重要作用1-7。肿瘤从良性状态向转移性状态的进展是一个复杂的过程8，该过程已在Drosophila中建立模型，以帮助我们更深入地理解此类疾病的遗传机制9。本文介绍了一种简便的实验方案，用于在Drosophila幼虫中通过遗传手段诱导、观察并分析肿瘤的进展过程。该肿瘤诱导技术基于MARCM系统10，利用活化的癌基因RasV12与细胞极性基因（scribbled、discs large和lethal giant larvae）失活之间的协同作用，从而诱导产生侵袭性肿瘤9。我将展示如何在完整幼虫体内可视化这些肿瘤，以及如何将其解剖分离以进行后续分析。本文所呈现的简化实验流程，将有助于希望研究特定基因在肿瘤侵袭过程中作用的研究人员应用该技术。
引言
肿瘤从良性发展为转移性状态是一个逐步的过程，其特征是逃避机体存在的保护机制8。例如，体内的肿瘤细胞必须能够逃避凋亡和免疫系统的清除，突破称为基底膜的特化细胞外基质（ECM），并克服周围细胞施加的任何社会性调控8。正是通过这一逐步进展，癌细胞获得了迁移并定植于远端部位的能力，这一过程称为转移。目前，我们对肿瘤细胞如何克服机体屏障的认识仍处于初级阶段，然而迄今为止的研究结果表明，癌细胞反复利用了正常的发育过程和信号通路11-13。
果蝇 黑腹果蝇 通过过去几十年来发展起来的复杂遗传学技术，极大地促进了我们对正常发育和疾病的理解 14-17利用诱变和过表达工具，我们对多种癌基因和肿瘤抑制基因有了更深入的理解 18-22然而，肿瘤转移是多种基因突变协同作用的结果，这一过程主要在细胞培养模型中进行研究 23,24 以及各种异种移植模型 25-27这些模型尽管功能强大，但仍存在局限性，因为它们无法完全模拟活体生物体内的条件。此外，现有的小鼠转基因模型操作繁琐，不利于对侵袭性行为进行遗传学分析。 28,29. 多项研究试图阐明肿瘤细胞的侵袭过程 黑腹果蝇 30,31这些技术主要利用将原发肿瘤移植到宿主，随后通过追踪移植肿瘤对邻近组织的侵袭来进行研究。
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方案
1. 良性非侵入性肿瘤的诱导
- 使用 表2 中列出的品系诱导良性肿瘤。
- 为以下基因型的“测试者”品系制备起始培养物：y,w, ey-FLP1; Tub-Gal80,FRT40A; Act5C>y+>Gal4, UAS-GFP
- 为以下基因型的“被测试”品系制备起始培养物：w; FRT40A, UAS-RasV12/CyO
- 从“测试者”品系中收集十只雌性处女蝇，从“被测试”品系中收集十只雄性果蝇。
- 将“测试者”品系的雌蝇与“被测试”品系的雄蝇共同放入一个含有果蝇食物的试管中进行杂交。
- 将杂交试管置于25 °C培养箱中，使雌雄果蝇交配并产卵24–48小时。
- 检查试管中是否有足够的卵沉积，并观察是否存在一龄幼虫，同时确保培养物未干涸。
- 若培养物出现干燥，可加入数滴经高压灭菌的蒸馏水以保持湿润。
- 持续监测培养物，并根据需要重复步骤1.7.1。
- 按照第3节所述方法，在荧光体视显微镜下观察游走期三龄幼虫。
2. 侵袭性肿瘤的诱导
- 使用表2中列出的品系诱导
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结果
通过本方案，实验者将能够通过在幼虫眼-触角成虫盘中过表达一种活化的癌基因来诱导良性肿瘤的形成。此外，实验者还可通过在具有细胞极性基因突变的细胞克隆中过表达活化癌基因，从而在眼-触角成虫盘中诱导产生侵袭性肿瘤。这些肿瘤可在荧光体视显微镜下借助荧光信号被清晰观察到，表现为整条幼虫或从幼虫体腔中解剖获得的头部复合体中的“绿色荧光”组织。图1）。良性肿瘤将定位于眼触角盘复合体，表现为GFP阳性细胞克隆，而侵袭性肿瘤则会导致肿瘤的大量过度生长，并继而迁移至腹神经索（VNC）及其他邻近器官，形成GFP阳性侵袭性肿瘤。 >10日龄幼虫（来源于侵袭性肿瘤基因型）中，可观察到GFP阳性、从原发部位脱落并漂浮于幼虫体腔内的继发性肿瘤。此外，携带良性肿瘤的幼虫能够按时化蛹，而携带侵袭性肿瘤的幼虫则表现为幼虫期延长，无法正常化蛹。这些携带侵袭性肿瘤的幼虫可被明显识别为“巨型幼虫”，其体腔内充满液体。
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讨论
癌症是一种复杂的疾病，如今人们对它的理解已远胜于过去。然而，在全面揭示其潜在机制之前，仍有许多问题有待学习和阐明。本文介绍的简单实验方案能够在完整生物体中通过遗传手段诱导良性和侵袭性肿瘤，并进而研究该模型中肿瘤进展相关的生物学特性。目前在果蝇（Drosophila）及其他生物中已有的大多数技术，要么依赖细胞培养系统来研究肿瘤发生与转移，要么采用将原发肿瘤组织移植到成年宿主体内的方法23-27。这两种基于细胞和移植的技术均存在局限性。例如，移植技术操作繁琐、耗时较长，且可能导致非肿瘤组织被误植到宿主体内，从而产生实验假象。此外，基于细胞培养的系统仅能近似模拟整个生物体内真实存在的环境，这一局限性使得难以重现肿瘤与其微环境之间至关重要的相互作用，而这种相互作用在肿瘤进展和转移过程中发挥着关键作用34。本文所述技术已被多个研究团队成功用于探究果蝇（Drosophila）中肿瘤进展的遗传与分子基础。例如，利用该技术已证明，JNK信号通路在侵袭性肿瘤中表达上调，并且对肿瘤的进展具有必要性35,36。在另一项研究中，该遗传模型也揭示了基质金属蛋白酶.......
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披露
我无任何利益冲突需要披露。
致谢
本实验室的研究工作得到了西肯塔基大学生物学系启动资金、西肯塔基大学研究基金会RCAP-I项目资助（项目编号：11-8032）以及KBRIN-AREA项目的资助；KBRIN-AREA项目由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所通过资助号5P20GM103436-13的母项目提供支持。我还要感谢田旭博士，在其实验室中我首次接触到该技术；同时感谢雷蒙德·帕利亚里尼博士，他在田旭实验室中首次建立了该技术。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10X PBS（磷酸盐缓冲液）pH 7.2 储存液 | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| 预冷的 1X PBS pH 7.2 工作液 | Invitrogen, Sigma Aldrich | 现配现用，冷藏保存，可使用长达一周 | |
| Flynap | Carolina Biologicals | 用于麻醉幼虫的果蝇麻醉剂 | |
| 固定液 | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% 多聚甲醛 | 用于固定解剖得到的头端复合体 | |
| 冰桶 | 若干 | 用于保持溶液低温；解剖头端复合体时需在预冷的 1X PBS 中进行，随后置于冰上的 Eppendorf 管中 | |
| 1.7 ml Eppendorf 管 | 各种品牌 | ||
| 载玻片、盖玻片 | Fisher Scientific | ||
| Vectashield 封片剂或其他任何封片介质 | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 或 700 油 | Polysciences Inc. 或 Halocarbon.com | Halocarbon 200 用于在荧光体视显微镜下观察时封载幼虫样本 | |
| Sally Hansen "Hard as Nails" 指甲油 | 可在任何普通商品零售店购买 | 用于密封盖玻片边缘 | |
| Leica MZ16.5 荧光体视显微镜或任何其他荧光体视显微镜 | Leica 及其他厂商 | 用于观察幼虫中的 GFP 荧光 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 孔斑点板或任何其他解剖皿 | Sigma Aldrich | ||
| 画笔 | 可在任何普通商品零售店购买 | ||
| 表 1. 本实验方案所需材料。 |
参考文献
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M.
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重印与许可
