一种用于头部分节复合体中良性和侵袭性肿瘤遗传诱导与可视化的方法 黑腹果蝇

摘要

激活的癌基因（如 RAS^V12）与细胞极性基因（如 scribbled）的突变之间的协同作用，可导致果蝇（Drosophila）体内肿瘤的生长，且肿瘤细胞还表现出侵袭性行为。本文介绍了一种诱导和观察良性及侵袭性肿瘤的简单实验方案。

摘要

在过去几十年中，Drosophila 果蝇极大地推动了我们对正常发育和疾病遗传基础的理解，时至今日，它仍在复杂疾病研究中发挥着重要作用^1-7。肿瘤从良性状态向转移性状态的进展是一个复杂的过程⁸，该过程已在Drosophila中建立模型，以帮助我们更深入地理解此类疾病的遗传机制⁹。本文介绍了一种简便的实验方案，用于在Drosophila幼虫中通过遗传手段诱导、观察并分析肿瘤的进展过程。该肿瘤诱导技术基于MARCM系统¹⁰，利用活化的癌基因Ras^V12与细胞极性基因（scribbled、discs large和lethal giant larvae）失活之间的协同作用，从而诱导产生侵袭性肿瘤⁹。我将展示如何在完整幼虫体内可视化这些肿瘤，以及如何将其解剖分离以进行后续分析。本文所呈现的简化实验流程，将有助于希望研究特定基因在肿瘤侵袭过程中作用的研究人员应用该技术。

引言

肿瘤从良性发展为转移性状态是一个逐步的过程，其特征是逃避机体存在的保护机制⁸。例如，体内的肿瘤细胞必须能够逃避凋亡和免疫系统的清除，突破称为基底膜的特化细胞外基质（ECM），并克服周围细胞施加的任何社会性调控⁸。正是通过这一逐步进展，癌细胞获得了迁移并定植于远端部位的能力，这一过程称为转移。目前，我们对肿瘤细胞如何克服机体屏障的认识仍处于初级阶段，然而迄今为止的研究结果表明，癌细胞反复利用了正常的发育过程和信号通路^11-13。

果蝇 黑腹果蝇 通过过去几十年来发展起来的复杂遗传学技术，极大地促进了我们对正常发育和疾病的理解 ^14-17利用诱变和过表达工具，我们对多种癌基因和肿瘤抑制基因有了更深入的理解 ^18-22然而，肿瘤转移是多种基因突变协同作用的结果，这一过程主要在细胞培养模型中进行研究 ^23,24 以及各种异种移植模型 ^25-27这些模型尽管功能强大，但仍存在局限性，因为它们无法完全模拟活体生物体内的条件。此外，现有的小鼠转基因模型操作繁琐，不利于对侵袭性行为进行遗传学分析。 ^28,29. 多项研究试图阐明肿瘤细胞的侵袭过程 黑腹果蝇 ^30,31这些技术主要利用将原发肿瘤移植到宿主，随后通过追踪移植肿瘤对邻近组织的侵袭来进行研究。 ^32,33一种名为MARCM的强大技术 ¹⁰ 由 Pagliarini 和 Xu 改进而用于模拟肿瘤侵袭的模型 果蝇 ⁹。这种优雅的肿瘤侵袭遗传模型利用了活化型癌基因与细胞极性丧失之间的协同作用。该模型的优势在于，侵袭性肿瘤是在完整的生物体内形成的，从而避免了组织移植的需要。为了实现这种癌基因的协同作用，可使用一种活化型癌基因（如Ras）^V12 在幼虫眼-触角成虫盘的细胞克隆中表达。由于使用了MARCM技术，这些克隆同时标记有绿色荧光蛋白（GFP），便于观察，并且可使细胞极性突变体（如）成为纯合状态 致命性巨大幼虫, 涂鸦，以及 discs large 结果是在头部复合体中出现GFP标记的侵袭性肿瘤。本报告中，我展示了如何在完整幼虫以及分离的头部复合体中诱导并观察这些侵袭性肿瘤。此处所采用的肿瘤诱导方法利用了第二染色体上的试剂。 果蝇 在 表 2，我在X和3上提供股票清单^rd 可用于相同目的的染色体。我认为，这一简化的实验方案将使该技术更易于被致力于研究肿瘤进展分子机制的研究人员所采用。

方案

1. 良性非侵入性肿瘤的诱导

1. 使用 表2 中列出的品系诱导良性肿瘤。
2. 为以下基因型的“测试者”品系制备起始培养物：y,w, ey-FLP1; Tub-Gal80,FRT40A; Act5C>y+>Gal4, UAS-GFP
3. 为以下基因型的“被测试”品系制备起始培养物：w; FRT40A, UAS-Ras^V12/CyO
4. 从“测试者”品系中收集十只雌性处女蝇，从“被测试”品系中收集十只雄性果蝇。
5. 将“测试者”品系的雌蝇与“被测试”品系的雄蝇共同放入一个含有果蝇食物的试管中进行杂交。
6. 将杂交试管置于25 °C培养箱中，使雌雄果蝇交配并产卵24–48小时。
7. 检查试管中是否有足够的卵沉积，并观察是否存在一龄幼虫，同时确保培养物未干涸。
   1. 若培养物出现干燥，可加入数滴经高压灭菌的蒸馏水以保持湿润。
   2. 持续监测培养物，并根据需要重复步骤1.7.1。
8. 按照第3节所述方法，在荧光体视显微镜下观察游走期三龄幼虫。

2. 侵袭性肿瘤的诱导

1. 使用表2中列出的品系诱导侵袭性肿瘤。
2. 使用上述步骤1.2中的起始培养物，其基因型为：y,w, ey-FLP1; Tub-Gal80,FRT40A; Act5C>y+>Gal4, UAS-GFP
3. 为“待测”品系准备起始培养物，其基因型为：w; lgl⁴, FRT40A, UAS-Ras^V12/CyO
4. 从“测试”品系中收集10只雌性处女蝇，从“待测”品系中收集10只雄性果蝇。
5. 将“测试”品系的雌蝇与“待测”品系的雄蝇共同放入一个含有果蝇食物的培养瓶中进行杂交。
6. 将杂交组合置于25 °C培养箱中，让果蝇交配并产卵24–48小时。
7. 检查培养瓶中是否有足够的卵沉积，并观察是否存在一龄幼虫，同时确保培养基不会干燥。
   1. 若培养基出现干燥，可加入几滴灭菌蒸馏水以保持湿润。
   2. 持续监测培养基湿度，并根据需要重复步骤2.7.1。
8. 按照第3节所述方法，在荧光体视显微镜下观察三龄幼虫。

3. 良性与侵袭性肿瘤的观察

1. 使用三龄幼虫进行良性肿瘤的分离与观察。
   1. 将画笔浸入蒸馏水中润湿，用该画笔从培养瓶壁上刮取数只三龄幼虫。
   2. 将幼虫置于凹玻片中，加入1×PBS，再用湿润的画笔轻轻刮除幼虫表皮上的食物残留物。
   3. 将幼虫放入培养皿中，置于-20 °C冰箱中冷冻30分钟，以固定幼虫。
      1. 使用FLYNAP固定幼虫的替代方法。
      2. 将蘸有FLYNAP的棉棒放入步骤3.1.3.2中的培养瓶内，塞紧瓶口后静置30至40分钟，使幼虫在瓶内充分麻醉。
   4. 将固定好的幼虫置于载玻片上，滴加一滴轻质卤代烃油，盖上盖玻片，在具备绿色荧光蛋白（GFP）观察功能的荧光体视显微镜下进行观察。
   5. 携带良性肿瘤的幼虫在头部复合体所在的前部区域会呈现绿色荧光。
2. 从上述第2步设置的培养体系中选取诱导后第10天的幼虫用于侵袭性肿瘤的观察。选择第10天幼虫的原因是，携带侵袭性肿瘤的幼虫幼虫期延长，通常无法正常化蛹。
3. 重复步骤3.1.1至3.1.4，但使用第10天的幼虫代替三龄幼虫。
   1. 第10天携带侵袭性肿瘤的幼虫在头部复合体所在的前部区域会呈现绿色荧光。
4. 若荧光显微镜配备数码相机，可对发出荧光的良性肿瘤和侵袭性肿瘤携带幼虫进行拍照记录。

4. 头部复合体的解剖及良性与侵袭性肿瘤的进一步观察

幼虫半透明的表皮使得观察肿瘤侵袭范围变得困难。因此，通过将头部复合体从幼虫体内解剖出来，可以更清晰地观察肿瘤的侵袭程度。以下步骤应用于解剖头部复合体。

1. 使用湿润的画笔从相应的培养管中选取三龄幼虫（用于良性肿瘤）和第10天的幼虫（用于侵袭性肿瘤）。
2. 将幼虫放入含有冷的1×PBS的解剖培养皿孔中。用画笔轻轻刮去幼虫表皮上的食物颗粒。
   1. 将清洁后的幼虫转移至解剖培养皿中另一个含有冷的1×PBS的新孔中。
   2. 使用能够检测荧光的体视显微镜检查GFP荧光的存在情况，弃去无GFP荧光的幼虫。
3. 在解剖培养皿的新孔中加入1.0 ml冷的1×PBS，并用一对镊子将携带良性或侵袭性肿瘤的幼虫转移至其中（这两种肿瘤类型的解剖流程相同）。
4. 用一对镊子夹住幼虫，位置大约在前端的2/3处。
   1. 使用另一对镊子迅速分离并弃去幼虫后1/3部分。
   2. 松开幼虫前2/3部分。随着幼虫体内压力释放，其内容物将从体腔中渗出。
   3. 使用一对镊子移除已从体腔中渗出的肠道、脂肪体及其他内部组织。
   4. 用一对镊子夹住幼虫的口钩，并将其推入幼虫表皮，再用另一对镊子将幼虫完全翻转。
   5. 用镊子轻柔而仔细地去除脂肪体、唾液腺、肠道、翅盘复合体以及任何气管组织。此时，头部复合体应已清晰可见，并附着于翻转后幼虫的口钩上。脑半球和腹神经索（VNC）仍通过从VNC发出的神经与幼虫表皮相连。
   6. 用一对镊子轻轻破坏头部神经与幼虫表皮之间的连接。
   7. 当VNC与幼虫表皮之间的神经连接被破坏，且多余脂肪体和其他组织被清除后，头部复合体将变得清晰可见，仅通过口钩与幼虫表皮相连。
   8. 若后续需进行固定处理（如抗体染色或进一步观察），可将头部复合体保留在幼虫表皮上。
   9. 若不再进行后续实验操作，可将头部复合体从幼虫表皮上分离，并置于一滴基于甘油的封片剂中用于进一步观察与分析。使用VECTASHIELD作为封片剂。

结果

通过本方案，使用者将能够在幼虫的复眼触角成虫盘中通过过表达激活的癌基因来诱导良性肿瘤。使用者还能够在同时缺失细胞极性基因的细胞克隆中，通过过表达激活的癌基因，在复眼触角成虫盘中诱导侵袭性肿瘤。这些肿瘤可通过荧光体视显微镜轻松观察，表现为整个幼虫或从幼虫体腔中解剖出的头部复合体中的“绿色荧光”组织（图1）。良性肿瘤将局限于复眼触角成虫盘复合体，表现为GFP阳性细胞克隆；而侵袭性肿瘤则会导致肿瘤的大量增生，并继而使GFP阳性侵袭性肿瘤迁移至腹神经索（VNC）及其他邻近器官。在>10日龄的幼虫（来源于侵袭性肿瘤基因型）中，还可能观察到漂浮在幼虫体腔内的GFP阳性且已脱落的继发性肿瘤。此外，携带良性肿瘤的幼虫能够按时进入蛹化，而携带侵袭性肿瘤的幼虫则表现出延长的幼虫期，并无法完成蛹化。这些携带侵袭性肿瘤的幼虫可被明显识别为体腔充满液体的“巨型幼虫”。

讨论

癌症是一种复杂的疾病，如今人们对它的理解已远胜于过去。然而，在全面揭示其潜在机制之前，仍有许多问题有待学习和阐明。本文介绍的简单实验方案能够在完整生物体中通过遗传手段诱导良性和侵袭性肿瘤，并进而研究该模型中肿瘤进展相关的生物学特性。目前在果蝇（Drosophila）及其他生物中已有的大多数技术，要么依赖细胞培养系统来研究肿瘤发生与转移，要么采用将原发肿瘤组织移植到成年宿主体内的方法^23-27。这两种基于细胞和移植的技术均存在局限性。例如，移植技术操作繁琐、耗时较长，且可能导致非肿瘤组织被误植到宿主体内，从而产生实验假象。此外，基于细胞培养的系统仅能近似模拟整个生物体内真实存在的环境，这一局限性使得难以重现肿瘤与其微环境之间至关重要的相互作用，而这种相互作用在肿瘤进展和转移过程中发挥着关键作用³⁴。本文所述技术已被多个研究团队成功用于探究果蝇（Drosophila）中肿瘤进展的遗传与分子基础。例如，利用该技术已证明，JNK信号通路在侵袭性肿瘤中表达上调，并且对肿瘤的进展具有必要性^35,36。在另一项研究中，该遗传模型也揭示了基质金属蛋白酶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X PBS（磷酸盐缓冲液）pH 7.2 储存液	Invitrogen, Sigma Aldrich
预冷的 1X PBS pH 7.2 工作液	Invitrogen, Sigma Aldrich		现配现用，冷藏保存，可使用长达一周
Flynap	Carolina Biologicals		用于麻醉幼虫的果蝇麻醉剂
固定液	0.1M PIPES, pH 7.2, 4% 多聚甲醛		用于固定解剖得到的头端复合体
冰桶	若干		用于保持溶液低温；解剖头端复合体时需在预冷的 1X PBS 中进行，随后置于冰上的 Eppendorf 管中
1.7 ml Eppendorf 管	各种品牌
载玻片、盖玻片	Fisher Scientific
Vectashield 封片剂或其他任何封片介质	Vector Laboratories
Halocarbon 200 或 700 油	Polysciences Inc. 或 Halocarbon.com		Halocarbon 200 用于在荧光体视显微镜下观察时封载幼虫样本
Sally Hansen "Hard as Nails" 指甲油	可在任何普通商品零售店购买		用于密封盖玻片边缘
Leica MZ16.5 荧光体视显微镜或任何其他荧光体视显微镜	Leica 及其他厂商		用于观察幼虫中的 GFP 荧光
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools
Pyrex 9 孔斑点板或任何其他解剖皿	Sigma Aldrich
画笔	可在任何普通商品零售店购买
表 1. 本实验方案所需材料。