微藻中脂肪酸含量与组成的分析

摘要

本文描述了一种基于机械细胞破碎、溶剂法脂质提取、转酯化反应以及气相色谱对脂肪酸进行定性和定量分析的方法，用于测定微藻中的脂肪酸含量及组成。采用三棕榈酸甘油酯作为内标物，以校正提取过程中可能发生的损失以及转酯化反应不完全所造成的影响。

摘要

本文介绍了一种测定微藻中总脂肪酸含量和组成的分析方法。脂肪酸是微藻生物量的主要组成成分，可存在于不同的酰基脂质类别中。其中，三酰基甘油（TAG）中的脂肪酸具有重要的商业价值，因其可用于生产交通燃料、大宗化学品、营养保健品（如ω-3脂肪酸）以及食品原料。为了推动商业化应用，亟需可靠的分析方法以准确定量脂肪酸的含量和组成。微藻为单细胞生物，其外层由坚固的细胞壁包裹。因此，脂肪酸分析方法必须能够充分破碎细胞以释放全部酰基脂质，且所采用的提取步骤应能有效提取所有类别的酰基脂质。

利用本文所述方法，仅需少量样品（5 mg），即可准确且可重复地鉴定和定量微藻中存在的所有脂肪酸，无论其碳链长度、不饱和度或所属脂质类别如何。

该方法不能提供不同脂质类别相对丰度的信息，但可以扩展用于分离不同的脂质类别。

该方法基于一系列步骤，包括机械性细胞破碎、基于溶剂的脂质提取、脂肪酸转化为脂肪酸甲酯（FAMEs），以及利用气相色谱法（GC-FID）对FAMEs进行定量和鉴定。在分析前加入三戊十五烷甘油酯（tripentadecanoin）作为TAG内标物，以校正提取过程中的损失及转酯化不完全所造成的影响。

引言

脂肪酸是微藻生物量的主要成分之一，通常占细胞干重的5%至50%。^1-3它们主要以甘油酯的形式存在。这些甘油酯又主要由磷脂、糖脂和三酰基甘油（TAG）构成。尤其是TAG中所含的脂肪酸具有商业价值，因其可作为生产交通燃料、大宗化学品、营养保健品（ω-3脂肪酸）和食品商品的资源。^3-6微藻可在基于海水的培养基中生长，其单位面积生产力远高于陆生植物，并可在不适合农业耕作的地点（甚至可能在近海区域）的光生物反应器中进行培养。由于这些优势，微藻常被视为生产生物柴油及其他大宗产品的陆生植物有前景的替代方案。^3-6. 生产过程中可能无需占用农业用地或淡水（当在封闭式光生物反应器中培养或使用海洋微藻时）。因此，源自微藻的生物燃料被视为3^rd第二代生物燃料

不同微藻物种之间的脂肪酸总细胞含量（占干重的百分比）、脂质类别组成以及脂肪酸链长度和饱和度存在显著差异。此外，这些特性还随培养条件（如营养物质的可利用性、温度、pH值和光照强度）而变化^1,2。例如，在氮缺乏条件下，微藻可大量积累三酰甘油（TAG）。在最佳生长条件下，TAG通常占干重的比例不到2%，但在氮缺乏条件下，其含量可高达微藻干重的40%¹。

微藻主要产生碳链长度为16和18个碳原子的脂肪酸，但某些物种可合成长达24个碳原子的脂肪酸。微藻既能合成饱和脂肪酸，也能合成高度不饱和脂肪酸。后者包括具有营养益处的ω-3脂肪酸，如C20:5（二十碳五烯酸；EPA）和C22:6（二十二碳六烯酸；DHA），目前尚无植物来源的替代品^1,2,4,7。脂肪酸链长的（分布）以及饱和程度也决定了藻类来源生物燃料和食用油的性质与质量^4,8。

为了开发微藻来源脂肪酸的商业应用，需要可靠的分析方法来定量测定脂肪酸的含量和组成。

正如 Ryckebosch et al.⁹ 所指出的，微藻中脂肪酸的分析与其他底物（例如 植物油、食品、动物组织等）相比具有显著差异，原因如下：1）微藻为单细胞生物，其细胞外包围着坚固的细胞壁，这使得脂质提取更加困难；2）微藻含有多种多样的脂质类别，且脂质类别的分布具有高度变异性⁷。这些不同的脂质类别在化学结构和性质（如极性）方面存在广泛差异。此外，微藻还能合成酰基脂质以外的其他脂质类别；3）微藻含有种类繁多的脂肪酸，碳链长度从12至24个碳原子不等，包含饱和脂肪酸以及高度不饱和脂肪酸。因此，针对非微藻类底物开发的脂肪酸分析方法可能不适用于微藻中脂肪酸的分析。

正如Ryckebosch等⁹所综述的，常用脂质提取方法之间的主要区别在于所使用的溶剂体系。由于微藻中存在多种不同极性的脂质类别，所提取的脂质量会因使用溶剂的不同而有所差异^10-12。这导致了文献中报道的脂含量和组成存在不一致的情况^9,10。根据所用溶剂体系的不同，仅依赖溶剂提取而未通过珠击或超声等方法进行细胞破碎的提取方法，可能无法完全提取所有脂质，原因在于某些微藻物种具有较为坚固的细胞结构^9,13。在脂质提取不完全的情况下，不同脂质类别的提取效率可能存在差异¹⁴。这还可能影响所测得的脂肪酸组成，因为不同脂质类别的脂肪酸组成本身具有差异性⁷。

本方法基于一系列操作步骤，包括机械性细胞破碎、基于溶剂的脂质提取、脂肪酸转化为脂肪酸甲酯（FAMEs），以及利用气相色谱结合火焰离子化检测器（GC-FID）对FAMEs进行定性和定量分析。在分析前，加入三酰基甘油（三十五烷酸甘油酯）作为内标物，以校正提取过程中的可能损失及转酯化不完全的问题。该方法可用于测定微藻生物量中脂肪酸的含量及其组成。仅需少量样品（5 mg），即可准确且可重复地检测、鉴定并定量存在于不同酰基脂质类别中的全部脂肪酸，包括储存型脂质（TAG）和膜脂（糖脂、磷脂）。本方法无法提供不同脂质类别相对丰度的信息，但可通过扩展方法实现不同脂质类别的分离¹，进而分别测定各类脂质的浓度及脂肪酸组成。

文献中描述了多种其他用于分析微藻中脂质的方法。一些方法侧重于总亲脂性组分¹⁵，而另一些方法则侧重于总脂肪酸^9,16。这些替代方法包括通过重量法测定总提取脂质、脂肪酸直接转酯化后结合色谱法进行定量，以及使用亲脂性荧光染料对细胞染色。

一种常用的替代色谱法测定脂肪酸的方法是采用重量法测定脂质含量^17,18重力测定法的优点在于无需使用气相色谱仪等先进且昂贵的设备；由于标准化分析仪器广泛可用，实验步骤易于建立例如 Soxhlet）；而重量法测定比基于色谱的方法更节省时间。然而，使用基于色谱的方法的主要优势在于，该方法仅测定脂肪酸。在重量法测定中，不含脂肪酸的脂类（如色素或类固醇）也会被计入测定结果。这些不含脂肪酸的脂类可能占相当大的比例（>总脂质的50%。如果仅关注脂肪酸含量（例如用于生物柴油应用），使用重量法测定会导致结果被高估。此外，在重量法测定中，用于称量提取脂质的分析天平的精度决定了所需样品量，该用量通常远大于使用色谱法时所需的量。最后，色谱法相较于重量法的另一优势在于，色谱法可提供有关脂肪酸组成的信息。

另一种替代我们所介绍方法的技术是直接酯交换法^16,19,20。该方法将脂质提取与脂肪酸转化为脂肪酸甲酯（FAMEs）的过程合并为一步。此法比分别进行提取和酯交换的步骤更为快速，但将这两个步骤合并会限制可用于提取的溶剂选择，可能对提取效率产生不利影响。而分别进行脂质提取和酯交换步骤的另一个优点在于，可在两步之间额外进行脂质类别分离¹，而使用直接酯交换法则无法实现这一操作。

测定微藻中脂质含量的其他常用方法包括使用亲脂性荧光染料（如尼罗红或BODIPY）对生物量进行染色，并检测荧光信号^21,22。这些方法的优点是比其他方法更省力。其缺点是由于物种差异、培养条件、脂质类别以及分析流程的不同，荧光响应在不同情况下存在变异性。例如，这些变异中的一部分是由微藻对染料摄取能力的差异所引起的。因此，需要采用另一种定量方法进行校准，最好针对所有不同的培养条件和生长阶段分别进行。最后，该方法无法提供脂肪酸组成的信息，且在准确性和可重复性方面不如基于色谱的方法。

本方法基于 Lamers 等人et al.²³ 和 Santos 等人et al.²⁴ 描述的方法，并已被其他多位研究人员应用^1,25-27。此外，还有其他基于相同原理的方法可用，可能获得类似结果^9,28。

方案

1. 样品制备

样本制备包含两种可选方案，分别作为步骤1.1和1.2。两种方法均同样适用且结果相似，但如果藻类培养物体积有限，则推荐使用方法1.1。

注意：对于任一实验方案，需额外准备两根珠磨管，除不添加藻类外，其余步骤均与完整方案一致，用作空白对照。通过此方式，可识别并定量分析因提取所用材料中的组分而在气相色谱图中出现的峰。

1.1. 样品制备方案选项1：当藻类培养物量有限时推荐使用

1. 测定培养液中藻类的干重浓度（g/L），例如可参照 Breuer 的方法 等¹.
2. 将含有5-10 mg藻类干重的培养液体积转移至玻璃离心管中。根据步骤1.1.1中测定的生物量浓度，计算所转移生物量的准确体积。
3. 离心5分钟，1,200 × g。
4. 弃去部分上清液，管中保留约0.25 ml。
5. 通过轻轻吹打将藻类在剩余上清液中重新悬浮，并用200 μL移液器将全部细胞沉淀转移至珠磨管中 μ移液器
6. 用离心管和玻璃移液管冲洗 ±0.15 ml 去离子水，并将液体转移至同一支珠磨管中。
7. 将珠磨管在最大转速下离心一分钟，以确保管底无残留气泡。密封的珠磨管可在-80℃保存 °C.
8. 将含有样品的珠磨管进行冻干。可将密封的珠磨管于-80℃保存 °C.

1.2. 样品制备方案选项 2

1. 离心一定体积的藻类培养液，弃去上清液。无需确定生物量浓度或测量所用培养液体积。
2. 根据培养基中主要盐类的浓度，测定或计算培养基的渗透压。
3. 用甲酸铵溶液重悬细胞沉淀进行洗涤，所用体积与步骤1.2.1中相同，且该甲酸铵溶液的渗透压应与培养基相近。等渗的甲酸铵溶液可防止细胞在洗涤过程中发生裂解。

注意：洗涤细胞是必要的步骤，用于去除培养基中存在的盐分。对于海洋微藻的脂肪酸分析而言，这一步骤尤为重要，因为其培养基中含有较高的盐浓度。如果盐分未被去除，则在本实验方案后续测定细胞干重时会导致结果偏高。使用甲酸铵溶液洗涤细胞，是因为该溶液在冻干过程中会完全挥发，不会留下任何残留物。

4. 离心藻类悬浮液，弃去上清液。
5. 冻干细胞沉淀。
6. 称取5-10 mg冻干微藻粉末至珠磨管中，记录准确重量。

2. 细胞破碎与脂质提取

注意：本节描述了一种较为彻底的细胞破碎程序。其中某些细胞破碎步骤可能存在冗余，对于某些微藻物种或特定培养条件下获得的生物质，较温和的破碎方法可能也能达到相同效果。但上述情况需针对具体实验条件进行验证。因此，建议采用本方案所提出的彻底破碎程序，作为一种适用于所有微藻材料的通用方法。

1. 准确称取一定量的三十五烷酸甘油酯（含有三个C15:0脂肪酸的三酰甘油），并将其加入到已知精确体积的氯仿:甲醇（4:5，v/v）混合溶剂中，使三十五烷酸甘油酯的浓度精确已知，目标浓度为50 mg/L。三十五烷酸甘油酯作为脂肪酸定量的内标物。
2. 向每个珠磨管（见试剂与仪器表中的说明）中加入1 ml含有三十五烷酸甘油酯的氯仿:甲醇（4:5，v/v）溶液。检查珠磨管盖内是否残留有研磨珠，残留会导致管子泄漏。使用正置换移液器准确加入溶剂。
3. 以2,500 rpm对珠磨管进行8次珠磨，每次60秒，每次珠磨之间间隔120秒。
4. 将珠磨管中的溶液转移至带有聚四氟乙烯（Teflon）衬垫螺旋盖的洁净耐热15 ml玻璃离心管中。务必同时将所有研磨珠从珠磨管中转移出来。
5. 为清洗珠磨管，向其中加入1 ml含有三十五烷酸甘油酯的氯仿:甲醇（4:5，v/v）溶液，盖紧盖子并混匀，然后将此溶液转移至第2.4步所用的同一玻璃管中。共清洗三次（每份样品总共使用4 ml含三十五烷酸甘油酯的氯仿:甲醇（4:5，v/v）溶液——第2.2步加入1 ml，后续三次洗涤加入3 ml）。
6. 将玻璃管涡旋振荡5秒，随后在超声水浴中超声10分钟。
7. 加入2.5 ml MilliQ水，其中含有50 mM 2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇（Tris）和1 M NaCl，并用HCl溶液调节至pH 7。这将导致氯仿与甲醇:水之间发生相分离。添加1 M NaCl有助于促进脂质向氯仿相的平衡分配。
8. 涡旋振荡5秒，然后超声10分钟。
9. 在1,200 × g条件下离心5分钟。
10. 使用玻璃巴斯德吸管将全部氯仿相（下层相）转移至洁净的玻璃管中。注意避免转移任何中间相或上层相。
11. 向原管（含有甲醇:水溶液）中加入1 ml氯仿，对样品进行再次萃取。
12. 涡旋振荡5秒，然后超声10分钟。
13. 在1,200 × g条件下离心5分钟。
14. 使用玻璃巴斯德吸管收集氯仿相（下层相），并与第2.10步所得的第一次氯仿相合并。
15. 若在上一步中难以完全收集氯仿相，则重复步骤2.11–2.14。否则继续进行第2.16步。
16. 在氮气流中蒸发管中的氯仿。此步骤完成后，样品可在氮气氛围下于-20 °C保存。

3. 转酯化生成脂肪酸甲酯

1. 向装有干燥提取脂质的试管（最初含有氯仿相的试管）中加入3 ml含5%（v/v）硫酸的甲醇，并 tightly 封闭试管。
2. 涡旋振荡5秒。
3. 在 70 ℃ 下孵育样品 3 小时 °C，置于金属浴或水浴中。定期（每隔 ±30 分钟）确保样品未发生沸腾（由盖子未正确关闭引起），并涡旋振荡管子。在此反应过程中，脂肪酸被甲酯化为其脂肪酸甲酯（FAMEs）。
4. 将样品冷却至室温，加入3 ml MilliQ水和3 ml正己烷。
5. 涡旋混匀5秒，然后使用试管旋转混合器混合15分钟。
6. 以1,200 × g离心5分钟。
7. 用玻璃巴斯德吸管收集2 ml己烷（上）相，转移至新的玻璃试管中。
8. 向收集的己烷相中加入 2 ml MilliQ 水进行洗涤。
9. 涡旋5秒，然后在1,200 × g离心5分钟。此步骤后可将样品在-20℃保存 °在氮气氛围下于 C 反应（无需相分离）。

4. 使用气相色谱法对脂肪酸甲酯进行定量分析

1. 使用玻璃巴斯德吸管将己烷相（上相）装入气相色谱小瓶中。
2. 将瓶盖盖在气相色谱小瓶上。确保瓶盖完全密封且无法转动，以防止小瓶内样品蒸发。
3. 重新填充气相色谱清洗溶剂（正己烷），清空废液瓶，并将样品瓶放入自动进样器中。在进样实际样品之前，先在气相色谱仪上运行2针仅含正己烷的空白样品。
4. 使用Nukol色谱柱（30 m × 0.53 mm × 1.0）在气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）上进样分析 μm）。使用250的进样口温度 °C，并使用氦气作为载气，压力为81.7 kPa，分流比为0.1:1，总流速为20 ml/min。FID检测器温度为270 °C与H₂ 流速为 40 ml/min，空气流速为 400 ml/min，He 流速为 9.3 ml/min。设定进样体积为 1 μl/样品。使用正己烷预洗和后洗进样器。初始烘箱温度设定为90 °C，持续0.5分钟，然后以20 °C/min，直至烘箱温度达到200 °C时，将烘箱温度保持在200 °39 分钟内升至 C。总运行时间为 45 分钟。

结果

通过此过程获得的典型色谱图如图1所示。所使用的气相色谱柱和方案可根据脂肪酸的链长和饱和程度对脂肪酸甲酯（FAMEs）进行分离。链长较短的脂肪酸以及饱和程度较高的脂肪酸（双键较少）保留时间较短。当前所用的气相色谱柱和方案不旨在分离脂肪酸异构体（链长相同且饱和度相同，但双键位置不同），但通过采用不同的气相色谱柱和方案可实现该分离。

可根据气相色谱峰面积、内标物浓度（mg/L）（步骤2.1）以及添加至样品中的生物量（mg）（步骤1.1.2或1.2.6，取决于所选的样品制备方案）来计算脂肪酸的浓度和组成。

通过以下方法可测定生物量中每种脂肪酸的含量（mg脂肪酸/g干重）

讨论

本方法可用于测定微藻生物量中总脂肪酸的含量及其组成。该方法可检测来自所有脂质类别的脂肪酸，包括储存型脂质（TAG）以及膜脂（磷脂和糖脂）。微藻中存在的所有脂肪酸链长及饱和度均可被检测并区分。本方法基于机械破碎细胞、溶剂提取脂质、脂肪酸转化为脂肪酸甲酯（FAMEs），并通过气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）对FAMEs进行定量分析。该方法仅需少量样品（5 mg），具有较高的准确性和可重复性，适用于多种微藻物种。本方法专为分析目的设计，特别适用于小样品量的检测，不建议放大用于大量微藻脂肪酸的提取。该方法的局限性在于操作较为繁琐，从开始实验到获得结果可能需要数天时间。在工业级微藻脂肪酸生产的过程监测中，这一特点可能被视为不足。若需更快的结果，可考虑采用其他方法，如使用亲脂性荧光染料染色等。关于分析操作的实施，建议如下：

1. 通过使用三酰基甘油（三亚麻酸甘油酯，tripentadecanoin）作为内标物来标准化提取和转酯化过程。在使用气相色谱法对样品中的脂肪酸甲酯（FAMEs）进行定量时，通常会使用内标法，但大多数情况下使用的是FAME内标物。建议使用三酰基甘油（TAG）内标物而非FAME内标物，并在细胞裂解和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三棕榈酸甘油酯（C15:0 TAG）	Sigma Aldrich	T4257	CAS 编号 7370-46-9
样品中预期所有脂肪酸的 TAG 或 FAME 标准品	Sigma Aldrich
样品中预期所有脂肪酸的 TAG 或 FAME 标准品	Lipidox
样品中预期所有脂肪酸的 TAG 或 FAME 标准品	Larodan
珠磨破碎仪	Bertin Technologies	Precellys 24
珠磨破碎管	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）	Hewlett-Packer	HP6871
气相色谱柱	Supelco	Nukol 25357
正置换移液器 100–1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
正置换移液器吸头 C-1000	Mettler Toledo	C-1000
手动移液器，Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
玻璃试管	VWR	SCERE5100160011G1
硼硅酸盐玻璃试管 16 × 100 mm，5.1 × 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
聚四氟乙烯涂层螺旋盖	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 试管旋转混合仪	VWR	445-2101
加热蒸发浓缩仪	Cole-Parmer	YO-28690-25