本文描述了一种基于机械细胞破碎、溶剂法脂质提取、转酯化反应以及气相色谱对脂肪酸进行定性和定量分析的方法，用于测定微藻中的脂肪酸含量及组成。采用三棕榈酸甘油酯作为内标物，以校正提取过程中可能发生的损失以及转酯化反应不完全所造成的影响。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种测定微藻中总脂肪酸含量和组成的分析方法。脂肪酸是微藻生物量的主要组成成分，可存在于不同的酰基脂质类别中。其中，三酰基甘油（TAG）中的脂肪酸具有重要的商业价值，因其可用于生产交通燃料、大宗化学品、营养保健品（如ω-3脂肪酸）以及食品原料。为了推动商业化应用，亟需可靠的分析方法以准确定量脂肪酸的含量和组成。微藻为单细胞生物，其外层由坚固的细胞壁包裹。因此，脂肪酸分析方法必须能够充分破碎细胞以释放全部酰基脂质，且所采用的提取步骤应能有效提取所有类别的酰基脂质。
利用本文所述方法，仅需少量样品（5 mg），即可准确且可重复地鉴定和定量微藻中存在的所有脂肪酸，无论其碳链长度、不饱和度或所属脂质类别如何。
该方法不能提供不同脂质类别相对丰度的信息，但可以扩展用于分离不同的脂质类别。
该方法基于一系列步骤，包括机械性细胞破碎、基于溶剂的脂质提取、脂肪酸转化为脂肪酸甲酯（FAMEs），以及利用气相色谱法（GC-FID）对FAMEs进行定量和鉴定。在分析前加入三戊十五烷甘油酯（tripentadecanoin）作为TAG内标物，以校正提取过程中的损失及转酯化不完全所造成的影响。
引言
脂肪酸是微藻生物量的主要成分之一，通常占细胞干重的5%至50%。1-3它们主要以甘油酯的形式存在。这些甘油酯又主要由磷脂、糖脂和三酰基甘油（TAG）构成。尤其是TAG中所含的脂肪酸具有商业价值，因其可作为生产交通燃料、大宗化学品、营养保健品（ω-3脂肪酸）和食品商品的资源。3-6微藻可在基于海水的培养基中生长，其单位面积生产力远高于陆生植物，并可在不适合农业耕作的地点（甚至可能在近海区域）的光生物反应器中进行培养。由于这些优势，微藻常被视为生产生物柴油及其他大宗产品的陆生植物有前景的替代方案。3-6. 生产过程中可能无需占用农业用地或淡水（当在封闭式光生物反应器中培养或使用海洋微藻时）。因此，源自微藻的生物燃料被视为3rd第二代生物燃料
不同微藻物种之间的脂肪酸总细胞含量（占干重的百分比）、脂质类别组成以及脂肪酸链长度和饱和度存在显著差异。此外，这些特性还随培养条件（如营养物质的可利用性、温度、pH值和光照强度）而变化1,2。例如，在氮缺乏条件下，微藻可大量积累三酰甘油（TAG）。在最佳生长条件下，TAG通常占干重的比例不到2%，但在氮缺乏条件下，其含量可高达微藻干重的40%1。
微藻主要产生碳链长度为16和18个碳原子的脂肪酸，但某些物种可合成长达24个碳原子的脂肪酸。微藻既能合成饱和脂肪....
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方案
1. 样品制备
样本制备包含两种可选方案，分别作为步骤1.1和1.2。两种方法均同样适用且结果相似，但如果藻类培养物体积有限，则推荐使用方法1.1。
注意：对于任一实验方案，需额外准备两根珠磨管，除不添加藻类外，其余步骤均与完整方案一致，用作空白对照。通过此方式，可识别并定量分析因提取所用材料中的组分而在气相色谱图中出现的峰。
1.1. 样品制备方案选项1：当藻类培养物量有限时推荐使用
- 测定培养液中藻类的干重浓度（g/L），例如可参照 Breuer 的方法 等1.
- 将含有5-10 mg藻类干重的培养液体积转移至玻璃离心管中。根据步骤1.1.1中测定的生物量浓度，计算所转移生物量的准确体积。
- 离心5分钟，1,200 × g。
- 弃去部分上清液，管中保留约0.25 ml。
- 通过轻轻吹打将藻类在剩余上清液中重新悬浮，并用200 μL移液器将全部细胞沉淀转移至珠磨管中 μ移液器
- 用离心管和玻璃移液管冲洗 ±0.15 ml 去离子水，并将液体转移至同一支珠磨管中。
- 将珠磨管在最大转速下离心一分钟，以确保管底无残留气泡。密封的珠磨管可在-80℃保存 °C.
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结果
通过此过程获得的典型色谱图如图1所示。所使用的气相色谱柱和方案可根据脂肪酸的链长和饱和程度对脂肪酸甲酯（FAMEs）进行分离。链长较短的脂肪酸以及饱和程度较高的脂肪酸（双键较少）保留时间较短。当前所用的气相色谱柱和方案不旨在分离脂肪酸异构体（链长相同且饱和度相同，但双键位置不同），但通过采用不同的气相色谱柱和方案可实现该分离。
可根据气相色谱峰面积、内标物浓度（mg/L）（步骤2.1）以及添加至样品中的生物量（mg）（步骤1.1.2或1.2.6，取决于所选的样品制备方案）来计算脂肪酸的浓度和组成。
通过以下方法可测定生物量中每种脂肪酸的含量（mg脂肪酸/g干重）
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讨论
本方法可用于测定微藻生物量中总脂肪酸的含量及其组成。该方法可检测来自所有脂质类别的脂肪酸，包括储存型脂质（TAG）以及膜脂（磷脂和糖脂）。微藻中存在的所有脂肪酸链长及饱和度均可被检测并区分。本方法基于机械破碎细胞、溶剂提取脂质、脂肪酸转化为脂肪酸甲酯（FAMEs），并通过气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）对FAMEs进行定量分析。该方法仅需少量样品（5 mg），具有较高的准确性和可重复性，适用于多种微藻物种。本方法专为分析目的设计，特别适用于小样品量的检测，不建议放大用于大量微藻脂肪酸的提取。该方法的局限性在于操作较为繁琐，从开始实验到获得结果可能需要数天时间。在工业级微藻脂肪酸生产的过程监测中，这一特点可能被视为不足。若需更快的结果，可考虑采用其他方法，如使用亲脂性荧光染料染色等。关于分析操作的实施，建议如下：
- 通过使用三酰基甘油（三亚麻酸甘油酯，tripentadecanoin）作为内标物来标准化提取和转酯化过程。在使用气相色谱法对样品中的脂肪酸甲酯（FAMEs）进行定量时，通常会使用内标法，但大多数情况下使用的是FAME内标物。建议使用三酰基甘油（TAG）内标物而非FAME内标物，并在细胞裂解和.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作的部分研究得到了科技创新促进研究所—战略性基础研究（IWT-SBO）项目“阳光与生物太阳能电池”的资金支持。感谢Erik Bolder和BackKim Nguyen在优化珠磨破碎步骤中所做的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三棕榈酸甘油酯（C15:0 TAG） | Sigma Aldrich | T4257 | CAS 编号 7370-46-9 |
| 样品中预期所有脂肪酸的 TAG 或 FAME 标准品 | Sigma Aldrich | ||
| 样品中预期所有脂肪酸的 TAG 或 FAME 标准品 | Lipidox | ||
| 样品中预期所有脂肪酸的 TAG 或 FAME 标准品 | Larodan | ||
| 珠磨破碎仪 | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| 珠磨破碎管 | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 | |
| 气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID） | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| 气相色谱柱 | Supelco | Nukol 25357 | |
| 正置换移液器 100–1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| 正置换移液器吸头 C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| 手动移液器，Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| 玻璃试管 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| 硼硅酸盐玻璃试管 16 × 100 mm，5.1 × 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| 聚四氟乙烯涂层螺旋盖 | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 试管旋转混合仪 | VWR | 445-2101 | |
| 加热蒸发浓缩仪 | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
参考文献
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al.
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