打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

摘要

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。

摘要

生物打印是一种源自快速成型产业的新兴技术。不同的打印工艺可分为接触式生物打印^1-4（挤出式、蘸笔式和软光刻）和非接触式生物打印^5-7（激光前向转移、喷墨沉积），以及基于激光的技术，例如双光子光聚合⁸。该技术可用于多种应用，如组织工程^9-13、生物传感器微加工^14-16，以及作为研究基础生物学问题的工具，例如共培养不同类型细胞的影响¹⁷。与常见的光刻或软光刻方法不同，挤出式生物打印的优势在于无需额外的掩膜或印章。通过使用CAD软件，操作者可根据实际需求快速修改和调整结构设计，这使得生物打印比基于光刻的方法更具灵活性。

本文展示了通过打印牺牲模具来制造多材料三维结构的方法，以在水凝胶内创建阵列微柱结构为例。这些微柱可代表用于血管网络的中空结构，或神经导管内的管道。牺牲模具选用泊洛沙姆407（poloxamer 407），这是一种具有优异打印性能的温敏性聚合物，在4 °C时呈液态，当浓度为24.5% w/v时，在约20 °C以上发生凝胶化而转变为固态¹⁸。该特性使得基于泊洛沙姆的牺牲模具可按需洗脱，相较于固体材料缓慢溶解的方式，尤其在狭窄结构中更具优势。将泊洛沙姆打印在显微镜玻片上以形成牺牲模具，随后将琼脂糖溶液移入模具中并冷却至凝胶化。在冰水中洗脱泊洛沙姆后，琼脂糖模具中的空腔被含有FITC标记纤维蛋白原的海藻酸甲基丙烯酸酯（alginate methacrylate）填充。填充后的空腔经紫外光交联，最终使用落射荧光显微镜对构建物进行成像。

引言

近年来，组织工程在人体组织和器官再生方面已取得显著进展^19,20。然而，迄今为止，组织工程的研究重点往往局限于结构简单或尺寸较小的组织，例如膀胱^21,22或皮肤^23-25。然而，人体内存在许多复杂的三维组织，其中细胞与细胞外基质以特定的空间方式排列。要制造这类组织，需要一种能够在三维结构中将细胞和细胞外基质支架精确定位于指定位置的技术。生物打印技术有望实现这一目标，使制造复杂三维组织的愿景成为可能^10,11,26-28。

生物打印被定义为“利用材料转移工艺对生物相关材料——包括分子、细胞、组织和可生物降解的生物材料——进行图案化和组装，使其具有特定的空间结构，以实现一种或多种生物学功能”⁴。该技术涵盖多种不同的方法，其分辨率和尺度各不相同，从双光子聚合的亚微米级分辨率²⁹，到挤出式打印的150 μm至420 μm分辨率不等^1,12,30。单一材料或材料组合无法满足所有方法的需求³¹。对于挤出式打印，关键参数是粘度和凝胶化时间³²，其中高粘度和快速凝胶化是理想特性。

3D打印是一种可简便制备牺牲性模具以构建复杂几何结构的技术^30,33,34。该方法基于使用快速成型技术（例如挤出式生物打印机）构建模具。所制备的牺牲性模具可用于由难以直接打印的材料（因其黏度低、凝胶化速度慢）形成复杂结构。本文所述方法涉及制备一种由可在低温下快速溶解且能够精确挤出的材料构成的牺牲性模具。嵌段共聚物聚乙二醇₉₉-聚丙二醇₆₇-聚乙二醇₉₉（又称Pluronic F127或泊洛沙姆407）满足这些要求。该材料此前已在改性形式下用于挤出打印¹，但据我们所知，因其在液态环境中不稳定，尚未见以其未改性形式用于打印的报道。泊洛沙姆407还表现出逆向热响应行为¹⁸ 即在降温时由凝胶态转变为溶胶态。最重要的是，它能够被打印成具有极高保真度的复杂任意曲面结构。通过将低黏度溶液（本例中为凝胶化缓慢的琼脂糖）移液至打印所得的牺牲性模具中，即可由此制备结构化水凝胶。牺牲性模具的高保真打印及其在成型结构化水凝胶中的快速洗脱，使得该方法成为一种快速且灵活的模具制备技术，无需使用光刻方法中常见的掩模或印章。成型后的结构化水凝胶还可进一步填充另一种因黏度太低而不适用于挤出打印的材料，本例中为低黏度海藻酸甲基丙烯酸酯溶液。本文以柱状阵列为例，介绍利用热响应逆向牺牲性模具进行水凝胶图案化的方法。

方案

1. 泊洛沙姆407溶液的制备

如果条件允许，应在低温环境（4 °C）下配制泊洛沙姆溶液。若无低温环境，可将玻璃瓶置于盛有冰水的烧杯中。温度较高时，泊洛沙姆会超过凝胶点，无法充分溶解。

1. 将60 ml预冷的PBS溶液加入玻璃瓶中，使用磁力搅拌器剧烈搅拌。
2. 称取24.5克泊洛沙姆，分次少量加入冷的PBS中。每次加入后待其部分溶解，再继续添加。
3. 搅拌溶液直至所有泊洛沙姆完全溶解。
4. 加入冷PBS，直至总体积达到100 ml。最终浓度为24.5%（w/v）。
5. 停止搅拌溶液，并在4 °C下静置，直至溶液中的气泡和泡沫完全消失。凝胶中残留的气泡会被转移至打印机墨盒中，导致打印的牺牲模具出现缺陷。
6. 使用0.22 μm滤器将溶液直接过滤至打印 cartridge 中，以去除可能堵塞针头的任何不需要的颗粒。过滤步骤应在低温室中进行（若无条件，可使用预冷的滤头进行过滤）。 等等。）以避免泊洛沙姆在滤器中凝胶化。将装填好的滤芯在4 °C下保存，直至实验前30分钟。

2. 3D 打印机的准备

本研究中使用的3D打印机为regenHU公司的“BioFactory”。该系统的挤出部分由多个组件构成。顶部加压的料筒通过鲁尔锁紧接头与连接器相连。该连接器连接料筒出口与电磁阀入口之间的空隙。在电磁阀的出口处，可使用不同直径的针头。材料被挤出并沉积到由真空固定于运动平台上的基底上。系统的主要部件如图1所示。其他基于挤出的系统也可用于打印过程，但每种系统均需进行相应的优化。

1. 将电磁阀（喷嘴直径 0.3 mm）和针头（内径 0.15 mm）分别放入装有超纯水的 1.5 ml 离心管中，置于加热超声波清洗仪中清洗 30 分钟。用乙醇冲洗清洗后的阀门，并用氮气枪吹干。
2. 将阀门和针头安装到打印机中，并安装一个空的、洁净的墨盒。
3. 向系统施加 3 bar 压力，用压缩空气吹出已安装阀门和针头中的任何残留液体。对于较小的针头直径，建议在压缩空气出口处安装过滤器（常用注射器滤器，孔径 0.45 μm），以避免微小颗粒进入而堵塞针头。
4. 关闭压力，安装装有泊洛沙姆的墨盒。墨盒应在安装前约 30 分钟从冰箱中取出，使泊洛沙姆升至室温并形成凝胶。
5. 向系统施加 3 bar 压力，挤出泊洛沙姆，直至其到达针尖并以连续丝状物被挤出。

3. 打印参数的优化

为了创建精确的三维结构，必须针对所选材料及其浓度优化打印过程。根据材料的黏度和三维打印系统，每种材料在一组固定参数下会产生特定的分配体积和线条厚度。

1. 使用合适的 CAD 软件（能够从图纸生成 ISO 文件），绘制一条与您打算打印的结构长度相近的单线。
2. 将一块尺寸为 25 mm × 75 mm × 1 mm 的显微镜载玻片或任何其他基底放入打印机中，并通过开启真空泵将其固定。
3. 在打印机软件中，将电磁阀设置为 50 Hz 的高频率，并设定 3 bar 的高压力。
4. 以 300 mm/min 的平台移动速度打印单线的一层。
5. 逐步降低压力，直至达到所需的线宽。您也可以通过调节阀门开启时间来控制挤出的体积。
6. 逐步降低阀门频率，直到无法再打印出连续的线条为止。选择略高于该临界值的频率。

注意：当达到所需的线宽和连续线条后，确定最佳的平台移动速度和层厚 即 针头在完成一层打印后的抬升

7. 逐层叠加打印，观察针头在完成多层打印后是否位于上一层材料的正上方。调整层厚（针头抬升高度），确保每一层均准确打印在下一层之上（图3）。
8. 逐步降低打印平台的速度（从300 mm/min开始），使挤出的材料层起始与终止位置与前一层保持一致（图4）。平台速度过高会导致挤出材料尚未接触前一层时平台已开始移动。
9. 打印柱状结构时，请遵循步骤3.1–3.8，但将绘制单条直线改为绘制单个点。打印柱状结构时需重点关注的参数包括：压力（控制泊洛沙姆层厚及柱体直径）、阀门开启时间（控制挤出体积）以及打印头在柱体沉积位置的停留时间。
10. 当参数优化完成后，连续打印多层直线应形成致密的墙体结构，而连续打印点则应形成柱状结构。请保存已优化的参数以供后续使用。

4. 反向模具的打印与洗脱

从此时起，使用优化过程中确定的参数。

1. 在玻璃显微镜载玻片上打印内部结构（此处为柱状阵列），并过夜干燥。此步骤可：a) 减小结构的尺寸和厚度；b) 增强结构与基底之间的粘附性，从而避免在后续填充过程中发生结构剥离。
2. 使用 CAD 软件绘制一个包含外壁的结构，该外壁应包围住你希望被洗脱并填充的结构。使用泊洛沙姆（poloxamer）打印该外壁结构，打印过程需时 6 分钟。

注意：由于针头的尺寸限制，壁面必须距离内部结构至少 3.5 mm 处打印，否则外壁的打印会破坏内部结构

3. 准备用于填充牺牲模具的溶液（此处为去离子水中含1%琼脂糖）。琼脂糖溶液的温度应保持在35 °C至45 °C之间。温度低于此范围会导致琼脂糖过快凝固；高于此范围则可能因泊洛沙姆结构软化而破坏已打印的支柱结构。
4. 使用移液器缓慢将填充溶液注入牺牲模具中。操作应缓慢进行，以避免破坏模具内壁的结构。
5. 根据所用聚合物的性质，使填充后的溶液发生凝胶化或交联。以琼脂糖为例，其在4 °C下静置10分钟即可完成凝固。
6. 将填充后的牺牲模具置于冰浴中10分钟，以溶出泊洛沙姆结构。
7. 用纸巾轻轻吸干填充后的结构，并将其放置于新的玻璃载玻片上。小心地将结构压紧在载玻片表面，防止第三种水凝胶从空腔泄漏至填充结构与载玻片之间的间隙中。

5. 填充空隙

1. 为了填充泊洛沙姆洗脱后留下的孔隙，将预定的聚合物溶液注入配备30 G针头的注射器中。在本示例中，我们使用了含有0.05% w/v 水溶性光引发剂锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐（LAP）和2.5% v/v Alexa-488标记的纤维蛋白原的1%海藻酸甲基丙烯酸酯溶于0.15 M NaCl的溶液。添加Alexa-488标记的纤维蛋白原用于可视化观察。
2. 使用高强度紫外灯（100瓦，365 nm，与基底距离为3.5 cm）对聚合物进行5分钟的光聚合，并利用落射荧光或共聚焦显微镜对构建物进行成像。

结果

代表性结果表明，反向模具技术（如图2所示）可制备出具有结构的凝胶，并可填充第二种材料。在每次打印过程开始前，需首先优化打印参数。通过逐步调整参数，可实现如图3和图4所示的多层结构打印，前提是单线打印。若层厚（每打印一层后针头的抬升高度）过低，可观察到针头会触碰到先前打印的层；若针头过高，则打印结构表面会出现波浪形图案。这一点在图3A-3D中可见，所有测试的层厚均相对于给定的平台速度过大。由于较高的平台速度会减小实际层厚，设定值与实际层厚之间的微小差异会逐渐累积，导致随着结构高度增加，波浪图案开始出现。通过降低层厚，这些差异减小，波浪图案则在比之前更高的位置出现（如图3C和图3D中虚线所示）。在固定层厚条件下，若平台速度过快，则会导致结构出现波浪形，或结构向顶部逐渐变窄，并在结构起始端出现凸起（打印结构的右边缘），如图4A-4C所示。针对泊洛沙姆优化的参数为：喷射开启时间0.2毫秒，频率31.14 Hz，...

讨论

本文首次提出使用一种热响应性聚合物作为牺牲模具，该聚合物由于泊洛沙姆（poloxamer）在约 20 °C 时发生凝胶-溶胶转变，可在冷水中迅速洗脱。整个过程的速度使得泊洛沙姆在快速构建无法以足够分辨率直接打印的生物聚合物结构方面具有吸引力。此处描述的技术可用于在一种水凝胶内图案化另一种水凝胶，或用于构建微流控通道，此前已有其他材料实现类似应用³⁵。泊洛沙姆作为牺牲模具的优势在于，可将其以任意几何形状逐层打印成固态结构，随后进行填充并洗脱去除。

本文描述了使用泊洛沙姆（poloxamer）制备牺牲模具，并随后用第二种水凝胶回填以制造结构化水凝胶的过程。在填充阶段，结构化水凝胶所用材料的选择需在黏度和温度方面受到一定限制。常用的低黏度前体溶液，如聚乙二醇二丙烯酸酯^36,37、海藻酸钠^38,39、琼脂糖⁴⁰以及甲基丙烯酰化生物聚合物^41-43等，均为合适的填充材料示例。然而，高黏度材料可能无法充分填充狭窄的几何结构，或在填充此处所打印的细小脆弱结构（如支柱）时破坏牺牲模具。因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
泊洛沙姆 （Pluronic F127）	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD 软件	regenHU	BioCAD
甲基丙烯酸海藻酸盐	信达生物 e.V Technologieentwicklung Jena		由信达生物为 FP7 项目合成 Nr NMP4-SL-2009-229292
来自人血浆的纤维蛋白原，Alexa Fluor 488 偶联物	Invitrogen	F13191
信达生物为 FP7 项目合成的 2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸酸锂 （LAP）	信达生物 e.V Technologieentwicklung Jena		Nr NMP4-SL-2009-229292
琼脂糖	Lonza	50004
EQUIPMENT
生物打印机	regenHU	生物工厂
阀门	regenHU	300 μm 喷嘴直径
针	regenHU	150 μm 内径
蔡司 Axioobserver 配备 ApoTome			蔡司
紫外光源	UVP	Blak-Ray B-100AP 高强度紫外灯	100 W