测量活酵母细胞中线粒体氧化还原状态和ATP的比率型生物传感器

摘要

我们描述了两种基于GFP的比率型遗传编码生物传感器的使用方法，用于在活酵母细胞中以亚细胞分辨率监测线粒体氧化还原状态和ATP水平。

摘要

线粒体参与多种细胞过程，从能量代谢和钙稳态到细胞寿命调控以及程序性细胞死亡。这些过程受到线粒体氧化还原状态和ATP生成的影响，同时也反过来影响这些指标。本文描述了两种基于比率检测的遗传编码生物传感器的使用方法，可在活酵母细胞中以亚细胞分辨率检测线粒体的氧化还原状态和ATP水平。线粒体氧化还原状态通过靶向定位于线粒体基质的氧化还原敏感型绿色荧光蛋白（roGFP）进行测量。Mito-roGFP在GFP的第147和204位含有半胱氨酸，可发生可逆且依赖环境的氧化与还原反应，从而改变该蛋白的激发光谱。MitGO-ATeam是一种基于荧光共振能量转移（FRET）的探针，其结构将F_oF₁-ATP合酶的ε亚基夹在FRET供体与受体荧光蛋白之间。当ATP结合到ε亚基时，会引起蛋白构象变化，使FRET供体与受体彼此靠近，从而实现从供体到受体的荧光共振能量转移。

引言

线粒体是产生ATP、合成氨基酸、脂肪酸、血红素、铁硫簇和嘧啶所必需的细胞器。线粒体还在钙稳态以及细胞凋亡调控中发挥关键作用¹。越来越多的证据表明，线粒体与衰老及年龄相关性疾病（包括帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病）密切相关²。尽管个体一生中均携带与神经退行性疾病相关的线粒体蛋白突变，但疾病症状仅在生命后期才出现。这表明，随着年龄增长，线粒体发生了某些变化，从而导致疾病病理的显现。事实上，线粒体功能状态与酵母和哺乳动物细胞的整体细胞健康及寿命密切相关^3,4。本文中，我们介绍如何利用基因编码的比率型荧光生物传感器，在活体酵母细胞中评估线粒体的两个关键特征：氧化还原状态和ATP水平。

线粒体在有氧能量动员中的功能已得到充分证实。线粒体的氧化还原状态是细胞器内还原性和氧化性物质共同作用的结果，包括NAD⁺/NADH、FAD/FADH₂、NADP⁺/NADPH、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）以及活性氧（ROS）。线粒体解偶联或缺氧会影响线粒体的呼吸活性，并改变细胞器内NAD⁺与NADH的比例。活性氧（ROS）主要来源于线粒体内膜上电子传递链各复合物之间电子传递效率低下，以及外膜上单胺氧化酶催化胺类脱氨反应⁵，ROS可损伤脂质、蛋白质和核酸，并与衰老及衰老相关的神经退行性疾病密切相关....

方案

1. 用生物传感器转化酵母细胞

1. 使用醋酸锂法将含有 mito-roGFP 或 mitGo-ATeam2 的质粒转化至目标酵母菌株中²⁷。
2. 为确认质粒携带的生物传感器成功转化并防止质粒丢失，将转化子筛选并培养在相应的选择性完全合成培养基上（mito-roGFP 使用 SC-Ura 培养基，mitGo-ATeam2 使用 SC-Leu 培养基）。若荧光探针被亚克隆至本文所述以外的其他质粒中，则应使用相应选择性培养基。通过荧光显微镜观察转化子，以确认其表达荧光生物传感器且线粒体形态正常。

2. 细胞培养与成像前准备

细胞功能及其对药物处理的反应在很大程度上依赖于细胞密度和代谢活性。当细胞处于活跃分裂期（对数中期，约 0.5 - 1 × 10⁷ 个细胞/毫升）时，可获得最佳实验结果。获得密度一致的对数中期培养物最可靠的方法是从处于静止期的预培养物中接种。

1. 准备静止期预培养物：从平板上挑取一个转化细胞的单菌落，接种于选择性液体培养基中（5 ml，置于50 ml锥底试管中）。在30 °C、225 rpm振荡条件下培养，直至培养物在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到平台期（24–48小时）。
2. 准备对数中期培养物用于观察：取适量预培养物接种于5 ml选择性培养基中（....

结果

使用 mito-roGFP 测量线粒体氧化还原状态

本文结果显示，mito-roGFP1 具有足够的动态范围，可在活酵母细胞中检测线粒体氧化还原状态从完全氧化到完全还原的变化，且不会影响酵母细胞的生长或线粒体形态。首先，我们发现表达线粒体靶向 GFP 和 roGFP1 的细胞生长速率正常（图 1A）。通过指数生长期生长曲线的最大斜率以及达到最大生长速率所需时间测定，表达 mito-GFP 与 mito-roGFP1 的细胞其最大生长速率相似。此外，表达 mito-roGFP1 的酵母细胞中线粒体呈现野生型形态（图 1B）。具体而言，这些线粒体呈管状结构，沿母细胞-芽体轴排列，并在母细胞和子细胞的末端富集。由于线粒体功能障碍常导致其发生碎片化，而此处观察到的正常形态表明 mito-roGFP1 不会干扰线粒体的正常功能。

为了评估 mito-roGFP1 的动态范围，我们分别用过氧化氢（H₂O₂）和二硫苏糖醇（DTT）处理处.......

讨论

本文介绍了利用 mito-roGFP1 和 mitGO-ATeam2 作为生物传感器，在活体酵母细胞中评估线粒体氧化还原状态和 ATP 水平的方法。我们发现，由质粒表达的 mito-roGFP1 或 mitGO-ATeam 能够定量地靶向定位至线粒体，且对线粒体的形态、分布以及细胞生长速率均无明显影响³。mito-roGFP1 能够检测线粒体氧化还原状态从高度氧化到高度还原的变化。同样，mitGO-ATeam 可以测量酵母在呼吸驱动生长过程中以及经呼吸抑制剂处理后线粒体 ATP 水平的变化。此外，由于这两种生物传感器均具有亚细胞分辨率，因此能够检测单个细胞内线粒体之间在氧化还原状态或 ATP 水平上的异质性。最后，由于这两种生物传感器均为比率型探针，其信号不受探针浓度变化、样品厚度差异或照明不均的影响。这些探针为在活细胞中以亚细胞分辨率研究线粒体功能提供了一种微创且可靠的方法。

要成功应用此方法，应以尽可能高的信噪比采集图像。重要的第一步是在显微镜下观察10至20个转化子菌落的细胞，并选择那些具有强荧光、正常线粒体形态和正常生长速率的细胞。接下来，应优化成像条.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
			试剂
抗霉素A	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	1397-94-0	溶于乙醇，配制成 2 mg/ml 的储存液。
SGlyc（合成甘油酵母培养基）*若使用SGlyc-Ura则省略 **SGlyc-Leu省略**			溶于 H2O. 用 NaHCO₃ 调节 pH 至 5.53高压灭菌。 成分： 0.67% 无氨基酸酵母氮源基础培养基 3% 甘油 0.05% 葡萄糖 2 mg/ml 腺嘌呤 2 mg/ml 尿嘧啶* 1 mg/ml L-精氨酸 1 mg/ml L-组氨酸 1 mg/ml L-亮氨酸** 3 mg/ml L-赖氨酸 2 mg/ml L-甲硫氨酸 4 mg/ml L-苯丙氨酸 2 mg/ml L-色氨酸 3 mg/ml L-酪氨酸
SC（合成完全，基于葡萄糖）酵母生长培养基 *在SGlyc-Ura中省略 **SGlyc-Leu省略**			溶于 H2O. 用 NaHCO₃ 将 pH 调至 5.53高压灭菌。 成分： 0.67% 无氨基酸酵母氮源基础培养基 3% 葡萄糖 2 mg/ml 腺嘌呤 2 mg/ml 尿嘧啶* 1 mg/ml L-精氨酸 1 mg/ml L-组氨酸 1 mg/ml L-亮氨酸** 3 mg/ml L-赖氨酸 2 mg/ml L-甲硫氨酸 4 mg/ml L-苯丙氨酸 2 mg/ml L-色氨酸 3 mg/ml L-酪氨酸
瓦拉普			以1:1:1（w:w:w）的比例混合各成分，通过浸入70℃水浴中熔化。 °C H2O浴。分装至玻璃培养皿中。室温保存。 成分： 凡士林石油脂、石蜡、羊毛脂
			设备与软件
经预清洁的 Gold Seal Rite-on 显微载玻片	Thomas Scientific（美国新泽西州斯韦兹伯勒）	3050	尺寸：25 x 75 mm；厚度：0.93 至 1.05 mm
高性能盖玻片，No. 1.5，18×18 mm	蔡司（美国 Thornwood）	474030-9000-000	这些在厚度上变异较小（170±5 μm）比标准盖玻片更薄，可减少球面像差并提升三维成像性能
Fisherbrand 显微镜盖玻片，No. 1.5	Fisher Scientific（匹兹堡，宾夕法尼亚州）	12-545E	尺寸：22 × 22 mm，1.5号厚度（170 μm)
配备光谱检测器和100x/1.49 NA Apo-TIRF物镜的A1激光扫描共聚焦显微镜	尼康（Melville，NY）
配备100x/1.3NA EC Plan-Neofluar物镜（Zeiss）和Orca ER冷却CCD相机（Hamamatsu）的AxioObserver.Z1显微镜，由Axiovision软件控制	蔡司（美国滕伍德）；滨松（日本滨松市）
Volocity 3D 图像分析软件	Perkin Elmer（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）		去卷积恢复模块；用于比率计算与测量的定量模块
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院（贝塞斯达，马里兰州）		http://rsb.info.nih.gov/ij/