我们描述了一种基于化学诱变和全基因组测序的Chlamydia遗传分析方法。此外，还介绍了一种可在感染细胞内实现DNA交换的系统，可用于遗传定位。该方法可能广泛适用于缺乏转化系统和分子遗传工具的微生物体系。
我们描述了一种基于化学诱变和全基因组测序的Chlamydia遗传分析方法。此外，还介绍了一种可在感染细胞内实现DNA交换的系统，可用于遗传定位。该方法可能广泛适用于缺乏转化系统和分子遗传工具的微生物体系。
Chlamydia trachomatis 是性传播疾病和眼部感染的病原体，由于难以通过重组DNA进行实验性转化，其遗传特性至今仍不甚清楚。尽管缺乏分子遗传学工具，我们仍建立了一种在 C. trachomatis 中进行遗传分析的方法。该方法包括：i.) 化学诱变，以快速构建具有不同表型的、遗传背景明确的突变体文库；ii.) 全基因组测序（WGS），用于定位潜在的遗传缺陷，并找出突变基因与共同表型之间的关联；iii.) 通过将突变株与野生型细菌共同感染哺乳动物细胞，获得重组菌株。由此，我们得以确立基因型与表型之间的因果关系。将化学诱导的基因变异与全基因组测序相结合以建立基因型–表型相关性的策略，可广泛应用于目前难以进行遗传分析的众多医学和环境重要微生物。
专性胞内细菌Chlamydia trachomatis每年在美国造成约280万例生殖道感染（美国疾病控制中心），并可引发盆腔炎、异位妊娠和不孕等后遗症（1）。 Chlamydia 属细菌具有独特的生理特性，其发育周期为双相型，包含两种形态：具有感染性但不复制的原体（elementary body, EB）和无感染性但可复制的网状体（reticulate body, RB）。感染始于EB附着于上皮细胞，随后通过内吞作用进入细胞（2）。在由膜包被的空泡（称为包涵体）内，EB转化为RB形态，并通过二分裂方式进行复制。在周期中期，RB重新转化为EB，当宿主细胞裂解时，EB被释放到细胞外空间，以启动新一轮感染（3）。
C. trachomatis 对常规分子遗传学工具（如靶向基因替换、转座子和转导噬菌体）具有抗性，而这些工具在大多数细菌遗传学研究中至关重要。目前尚不清楚单个Chlamydia基因在多大程度上参与了逃避免疫识别、营养获取、发育转换或其他对病原体在真核宿主细胞内存活至关重要的过程（4）。因此，尽管该病原体具有重要的临床意义，其特性仍远未被充分阐明。
衣原体属（Chlamydia）的基因组相对较小（约1 Mb）(5)，目前已利用下一代测序技术对多个物种和生物变种进行了测序。通过全基因组测序（WGS）进行的比较基因....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
1. 化学诱变
注意：我们发现，与EB形态相比，复制型RB形态更易于进行化学诱变。在中期（感染后18至20小时），RB的数量达到峰值，此时尚未进入RB向EB的转化阶段。由于Chlamydia trachomatis是一种专性胞内病原体，诱变剂对宿主细胞健康的影响可能限制细菌的回收效率。实验发现，Vero细胞对高浓度EMS所产生的不良影响比其他测试的细胞系更具耐受性。
通过重组分离突变需要对抗生素抗性重组子代进行筛选。我们建议使用具有抗生素抗性的菌株（例如 利福平、壮观霉素或甲氧苄啶抗性菌株）来构建突变体，以便进行重组分析并分离同基因型菌株。抗生素抗性菌株是通过逐步筛选过程获得的（15, 16）。
注意：Chlamydia trachomatis （菌株 L2/434/Bu / ATCC VR902B）属于生物安全等级2级（BSL2）病原体。操作此类病原体时，请遵循机构的标准操作程序（SOP）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
暴露于诱变剂后，包涵体中通常无细菌存在，推测是由于细菌细胞死亡所致。通常情况下，LGV-L2 血清型在感染后 48 小时内会完全裂解被感染的细胞，但经诱变剂处理后，该周期可延长至 >90 小时。大约有 10% 的包涵体可恢复生长。在我们的实验中，用 20 mg/ml EMS 处理的感染 Vero 细胞，其感染性子代的回收率相比未处理对照组下降了 99%。诱变剂处理还导致出现形态改变的蚀斑，包括小蚀斑（SPQ）（图 3）。其他形态还包括呈颗粒状、团块状或蜂窝状的蚀斑（图 3）。这些表型可能反映了在宿主环境中感染和存活所必需的某些生物学过程存在缺陷。具有小蚀斑（SPQ）形态的突变体通常产生的感染性子代显著减少，并可能需要长达 2 至 3 周才能扩增。在传代这些菌株时应格外谨慎，因为回复突变和抑制突变可能以较高频率积累。
这些研究中使用的EMS剂量可导致每个Chlamydia 基因组产生3到30个突变，该结果通过全基因组测序（WGS）实验评估得出（图4.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
该方法满足遗传分析的基本要求，因为它建立了基因型与表型之间的关联。重要的是，这一目标的实现无需依赖传统的分子工具进行重组DNA转化以及细菌基因的插入失活，而后者常常是分析非模式微生物基因功能时的限速步骤。
一个关键步骤是确保噬斑纯化突变体的单克隆性。若与野生型或“更具适应性”的突变体发生交叉污染，可能导致突变菌株迅速被竞争淘汰。同样，若对非单克隆样品进行全基因组测序以定位突变，可能得到模糊的结果。应避免从噬斑密集的孔中分离突变体，或挑取彼此过于接近的噬斑。此外，对于生长缓慢的突变体，回复突变体可能以相对较高的频率出现。我们建议保存原始或低代次的菌种。若怀疑存在交叉污染或回复突变体，应重新进行噬斑纯化。
可通过降低EMS的浓度来减少突变频率。据我们实验结果，EMS浓度为20 mg/ml时，突变率（通过利福平抗性变异株的产生来评估，该变异由编码RNA聚合酶的基因rpoB发生点突变所致）达到最佳。利福平抗性的诱导可通过在含利福平培养基中形成的噬斑频率进行评估，该频率应与化学诱导突变的频率相对应。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | Life Technologies | 11995-073 | |
| 胎牛血清（FBS） | Cellgro | 35-010-CV | |
| 甲基磺酸乙酯（EMS） | Sigma | M0880 | |
| 环己酰亚胺 | Sigma | C4859-1ML | |
| 庆大霉素 | Life Technologies | 15750-060 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Life Technologies | 14190-144 | |
| 含 0.493 mM MgCl 的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液2 和 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG缓冲液（1.25 M蔗糖，50 mM磷酸钠，25 mM谷氨酸） | |||
| SPG缓冲液（0.25 M蔗糖，10 mM磷酸钠，5 mM谷氨酸） | |||
| 水（无菌，组织培养级） | |||
| 2x DMEM（由粉末配制，用7.4 g/L碳酸氢钠缓冲） | Sigma | D7777 | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG 琼脂糖，已高压灭菌 | Lonzo | 50070 | |
| 基因组DNA纯化试剂盒 | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| 乙醇（分子生物学级） | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）缓冲液 | |||
| 25 cm² 组织培养瓶（T25 培养瓶） | |||
| 6孔组织培养板 | |||
| 12孔组织培养板 | |||
| 96孔组织培养板 | |||
| 化学安全通风橱 | |||
| 生物安全柜 | |||
| >用于旋转组织培养板的离心机及适配器 | |||
| >解剖显微镜 | |||
| 荧光计（Qubit） | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 仪器 | Covaris |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可