评估药物递送系统跨细胞屏障转运的模型与方法

摘要

许多治疗应用需要将药物载体及其携带的药物安全高效地转运通过体内的细胞屏障。本文介绍了一种对已有方法的改进，用于评估药物纳米载体（NCs）通过细胞屏障（如胃肠道（GI）上皮）的转运速率和机制。

摘要

亚微米级载体（纳米载体；NCs）通过提高药物的溶解度、稳定性、循环时间、靶向性及释放性能，从而增强其治疗效果。此外，穿越体内的细胞屏障对于治疗性纳米载体经口服进入血液循环，以及从血液向需要干预的组织转运均至关重要。纳米载体穿越细胞屏障的途径包括：（i）细胞旁路途径，即通过暂时破坏相邻细胞间相互连接的紧密连接结构实现通透；或（ii）跨细胞途径，即物质通过内吞作用被细胞摄取，穿越细胞本体后从细胞对侧膜表面分泌释放（转胞吞作用）。通过将治疗剂或其载体与特异性结合参与转运过程的细胞表面标志物的靶向分子偶联，可促进其跨细胞屏障的递送。本文提供了用于评估纳米载体在模型细胞屏障中转运程度与机制的方法，该模型由生长于transwell小室中多孔膜上的单层胃肠道（GI）上皮细胞构成。通过测量跨上皮电阻（TEER）、对照物质的跨上皮转运以及紧密连接蛋白的免疫染色，可确认通透性屏障的形成。以约200 nm的聚合物纳米载体为例，该载体携带治疗性载荷，并包被一种靶向细胞表面决定簇的抗体。通过¹²⁵I放射性同位素标记抗体或治疗性载荷进行示踪，将标记后的纳米载体加入细胞单层上方的腔室中，并孵育不同时间。可检测与细胞结合和/或转运至下方腔室的纳米载体。通过测定游离的¹²⁵I，可扣除降解部分的信号。通过分析纳米载体转运对上述屏障参数可能造成的变化，评估细胞旁路途径的贡献；而跨细胞转运则通过调控内吞和转胞吞通路，分析其影响来确定。

引言

体内的细胞屏障在外部环境与内部腔室之间起到门户作用。例如，上皮衬层就分隔了胃肠道（GI）暴露于外界的表面与血液系统^1-3细胞屏障也构成了血液与组织和器官的实质及细胞成分之间的界面。这种情况存在于血管内的内皮衬层，例如血液-肺屏障、血脑屏障。 等等。¹ 穿越体内的这些细胞屏障对于将治疗和诊断试剂高效递送至需要干预的循环系统及组织/器官中至关重要。

为提高治疗剂或诊断剂的递送效率，可将这些化合物装载至亚微米级纳米载体（NCs）中。这些药物递送载体可通过多种化学成分和结构设计，以优化药物的溶解度、保护性、药代动力学、释放特性及代谢行为^4,5. 纳米颗粒也可用亲和性或靶向性基团进行功能化（例如 抗体、多肽、糖类、适配体 等等。以促进其在需要治疗作用的身体部位的黏附^2,6靶向递送纳米载体至细胞屏障表面表达的特异性标志物，可进一步促进其进入和/或穿越这些屏障层^2,6.

在两个环境之间选择性转运物质的功能需要细胞层具备某些独特特征。其中一个特征是细胞极性，即面向腔隙腔面的顶膜在膜形态以及脂质、转运蛋白和受体的组成方面，与朝向组织间质的基底外侧膜存在差异²。另一个特征是连接相邻细胞的细胞间连接结构。构成紧密连接的蛋白质（特别是连接黏附....

方案

1. 在Transwell小室中培养细胞单层

1. 在无菌的生物安全二级细胞培养操作台中，放置0.8 mm 使用镊子将孔径为 PET 的 Transwell 小室放入 24 孔板中（每种条件 4 个孔，以确保统计学意义）。所有进入生物安全柜的物品均需用乙醇消毒。

注意：滤膜的孔径需根据所用纳米颗粒（NC）的平均尺寸进行选择，以允许其通过膜。此外，为获得具有统计学意义的结果，每个实验条件在同一次实验中至少需要设置四个重复孔，并且至少进行三次独立的实验。

2. 准备细胞培养基：在DMEM培养基中添加4.5 g/L葡萄糖、15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，置于水浴中加热至37 °C。
3. 将人结肠腺癌上皮细胞（Caco-2）用细胞培养基稀释后，取200–400 μl细胞悬液接种至Transwell小室的上层（顶侧）腔室中，接种密度为1.5 × 10⁵ 个细胞/cm²。在下层（基底外侧）腔室中加入700–900 μl细胞培养基。
4. 将细胞置于37 °C、5% CO₂、95%湿度条件下培养16–21天，每3–4天更换一次上下腔室的培养基，体积参照步骤1.3中的说明。为维持细胞单层上方的压力（而非下方），需按以下顺序更换培养基：先吸除下腔室中的培养基，再吸除上腔室中的培养基，随后向上腔室....

结果

为验证用于研究靶向纳米载体（NCs）跨上皮转运的细胞模型，图2 显示，以 1.5 × 10⁵ 个细胞/cm² 密度接种的 Caco-2 单层细胞约在第12天达到汇合，并在第18天前维持单层完整性，这由经上皮电阻（TEER）值所证实（图2A）。在TEER值较高（390 Ω×cm²，第14天）的单层细胞中，紧密连接蛋白occludin呈阳性表达（图2B），而在TEER值较低（17 Ω×cm²，第5天）时紧密连接标记较弱，进一步验证了上述结果。

通过追踪NC组分上的放射性标记，可确定最初加入到顶端腔室的这些组分（NC靶向抗体或货物）的总量、与细胞结合的部分以及转运至基底外侧的部分。在减去各组分中游离的¹²⁵I（代表已降解的对应物）后，可利用这些数值计算多个更准确描述NC转运情况的参数。例如，可计算出穿过细胞单层的抗体分子、货物分子或结合的NC数量，以评估绝对转运量；也可计算相对于.......

讨论

利用上述方法，可建立用于研究靶向纳米载体（NCs）跨细胞屏障转运的细胞模型，例如文中提供的Caco-2上皮细胞模型，该模型适用于评估口服给药系统中药物从胃肠道管腔进入血液的转运过程。通过在Transwell小室中培养胃肠道上皮细胞单层，可测定经上皮电阻（TEER）并进行紧密连接的荧光免疫染色，以确认细胞通透性屏障的形成。随后，使用¹²⁵I对靶向剂和治疗剂进行放射性标记，从而实现对靶向纳米载体进入及跨胃肠道细胞单层的快速且灵敏的定量分析。最后，结合内吞抑制剂、TEER检测以及白蛋白旁细胞渗漏实验，开展机制研究，以评估转运过程是通过囊泡途径还是旁细胞途径进行的。

建立类似模型的一个重要参数是细胞类型的选取，所选细胞应能反映所研究细胞屏障的生理特性。目前市面上可获得多种来源于人类或动物的上皮细胞和内皮细胞。^16,18-20这些细胞可单独培养，即单层培养，如本文所述；也可与其他细胞类型共同培养，即共培养。例如 分泌黏液的细胞、免疫细胞、周细胞 等等。)^16,18-20在共培养体系.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Transwell 小室	BD Falcon	353095
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），1×	Cellgro	10-013-CM
胎牛血清（FBS）	Cellgro	35-015-CV
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）	Gibco	15140
人结肠腺癌上皮细胞（Caco-2 细胞）	ATCC	HTB-37TM
125I 碘	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	放射性危害
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	14190-235
牛血清白蛋白（BSA）	Equitech Bio	BAH-66
多聚甲醛（16%）	费舍尔科技（Fisher Scientific）	15710
小鼠免疫球蛋白 G（IgG）	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
抗人 ICAM-1 的小鼠单克隆抗体（抗 ICAM 抗体）	Marlin 1987
α-半乳糖苷酶（来源于绿咖啡豆）	Sigma	G8507-25UN
荧光素异硫氰酸酯（FITC）乳胶微球，100 nm	Polysciences, Inc.	17150
曲拉通 X-100（Triton X-100）	Sigma	234729-500ML
三氯乙酸（TCA）	费舍尔科技（Fisher Scientific）	SA433-500
Occludin 抗体（Y-12），山羊多克隆抗人抗体	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
单丹磺酰尸胺（MDC）	Sigma	D4008
菲立宾（Filipin）	Sigma	F9765
5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利（EIPA）	Sigma	A3085
渥曼青霉素（Wortmannin）	Sigma	W1628
γ 计数器	Perkin Elmer	Wizard2
伏特-欧姆计	世界精密仪器公司（World Precision Instruments）	EVOM2
TEER 电极	世界精密仪器公司（World Precision Instruments）	STX100	适用于不同孔板的电极
动态光散射（DLS）	Malvern	Nano-ZS90