许多治疗应用需要将药物载体及其携带的药物安全高效地转运通过体内的细胞屏障。本文介绍了一种对已有方法的改进，用于评估药物纳米载体（NCs）通过细胞屏障（如胃肠道（GI）上皮）的转运速率和机制。
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摘要
摘要
亚微米级载体（纳米载体；NCs）通过提高药物的溶解度、稳定性、循环时间、靶向性及释放性能，从而增强其治疗效果。此外，穿越体内的细胞屏障对于治疗性纳米载体经口服进入血液循环，以及从血液向需要干预的组织转运均至关重要。纳米载体穿越细胞屏障的途径包括：（i）细胞旁路途径，即通过暂时破坏相邻细胞间相互连接的紧密连接结构实现通透；或（ii）跨细胞途径，即物质通过内吞作用被细胞摄取，穿越细胞本体后从细胞对侧膜表面分泌释放（转胞吞作用）。通过将治疗剂或其载体与特异性结合参与转运过程的细胞表面标志物的靶向分子偶联，可促进其跨细胞屏障的递送。本文提供了用于评估纳米载体在模型细胞屏障中转运程度与机制的方法，该模型由生长于transwell小室中多孔膜上的单层胃肠道（GI）上皮细胞构成。通过测量跨上皮电阻（TEER）、对照物质的跨上皮转运以及紧密连接蛋白的免疫染色，可确认通透性屏障的形成。以约200 nm的聚合物纳米载体为例，该载体携带治疗性载荷，并包被一种靶向细胞表面决定簇的抗体。通过125I放射性同位素标记抗体或治疗性载荷进行示踪，将标记后的纳米载体加入细胞单层上方的腔室中，并孵育不同时间。可检测与细胞结合和/或转运至下方腔室的纳米载体。通过测定游离的125I，可扣除降解部分的信号。通过分析纳米载体转运对上述屏障参数可能造成的变化，评估细胞旁路途径的贡献；而跨细胞转运则通过调控内吞和转胞吞通路，分析其影响来确定。
引言
体内的细胞屏障在外部环境与内部腔室之间起到门户作用。例如，上皮衬层就分隔了胃肠道（GI）暴露于外界的表面与血液系统1-3细胞屏障也构成了血液与组织和器官的实质及细胞成分之间的界面。这种情况存在于血管内的内皮衬层，例如血液-肺屏障、血脑屏障。 等等。1 穿越体内的这些细胞屏障对于将治疗和诊断试剂高效递送至需要干预的循环系统及组织/器官中至关重要。
为提高治疗剂或诊断剂的递送效率，可将这些化合物装载至亚微米级纳米载体（NCs）中。这些药物递送载体可通过多种化学成分和结构设计，以优化药物的溶解度、保护性、药代动力学、释放特性及代谢行为4,5. 纳米颗粒也可用亲和性或靶向性基团进行功能化（例如 抗体、多肽、糖类、适配体 等等。以促进其在需要治疗作用的身体部位的黏附2,6靶向递送纳米载体至细胞屏障表面表达的特异性标志物，可进一步促进其进入和/或穿越这些屏障层2,6.
在两个环境之间选择性转运物质的功能需要细胞层具备某些独特特征。其中一个特征是细胞极性，即面向腔隙腔面的顶膜在膜形态以及脂质、转运蛋白和受体的组成方面，与朝向组织间质的基底外侧膜存在差异2。另一个特征是连接相邻细胞的细胞间连接结构。构成紧密连接的蛋白质（特别是连接黏附分子JAMs、闭合蛋白occludins和claudins）的调控可调节屏障功能，从而选择性地允许或阻止物质在细胞间的转运，这种转运方式称为旁细胞转运，可使物质从管腔侧穿过细胞间隙进入基底外侧空间3。体内许多天然或合成成分（如白细胞、分子、颗粒及药物递送系统）与细胞屏障结合后，可能诱导细胞连接打开，这种打开可能是短暂且相对无害的，也可能是持续较久的，从而导致有害物质穿过屏障，带来安全隐患2,5,7-9。因此，可通过测量跨上皮电阻（TEER）以及分子的被动旁细胞扩散（本文称为旁细胞泄漏）来评估该通路：电流阻力降低或惰性化合物向基底外侧空间的旁细胞泄漏增加，分别表明细胞连接的开放5,10,11。为补充这些方法，可对上述任一紧密连接蛋白进行染色以评估其完整性，正常情况下染色应集中分布于细胞周边的细胞间连接处5,10,12。
此外，靶向特定细胞表面决定簇的药物递送系统（例如与网格蛋白包被小窝或称为小窝蛋白的烧瓶状膜凹陷相关的决定簇）可能通过内吞作用触发细胞对囊泡的摄取，从而为药物递送至细胞内区室提供途径5,13。此外，内吞作用可能导致囊泡在细胞内部转运，并在基底外侧释放，这一现象被称为跨细胞转运或穿胞作用14。因此，了解内吞作用的动力学和机制可用于开发细胞内和跨细胞药物递送策略，相较于旁细胞途径，该方式具有相对更高的安全性和可控性。内吞作用的机制可通过经典途径（网格蛋白介导和小窝蛋白介导的内吞作用以及巨胞饮作用）或非经典途径（如细胞黏附分子（CAM）介导的内吞作用）的调节剂进行评估5,13,15。
虽然细胞内运输通常在标准培养皿或盖玻片上进行研究，但由于缺乏基底外侧区室，细胞无法极化，因而难以研究物质跨细胞层的转运。为克服这一障碍，长期以来研究人员利用Transwell小室系统来研究跨细胞单层的转运过程。10,11,16,17，由上层（顶侧）室、多孔通透性膜（细胞附着其上并形成紧密单层）以及下层（基底外侧）室组成（图1在此构型中，可通过将处理物加入上室来测量从顶侧到基底侧方向的转运，处理物经细胞单层及下方的多孔膜转运后，最终收集下室中的培养基，以定量转运的物质。也可通过将处理物先加入下室，再从上室收集培养基，来测量从基底侧到顶侧方向的转运。5,10,12,16存在多种技术可用于验证Transwell上细胞通透性屏障的形成，包括上述的TEER和细胞旁路转运实验。此外，还可将培养细胞的可渗透滤膜取出，用于成像分析例如 通过荧光显微镜、共聚焦显微镜和电子显微镜等方法进一步验证细胞单层模型及其转运机制。膜类型的选择取决于多种因素，包括待转运物质或物体的大小、细胞类型和成像方法，而膜具有不同的孔径、材料和表面积可供选择。16,18-20Transwell 小室相较于复杂的哺乳动物系统，还能实现对转运过程的可控且精确的定量分析，因为其腔室体积和细胞表面积均为已知的恒定值。尽管许多影响因素参与其中 体内 递送过程中的障碍被消除，包括肠道黏液、剪切应力、消化酶和免疫细胞的存在， 等等。，这种小规模 体外 该模型为运输过程提供了有用的初步信息。
为了说明这些方法在研究纳米载体（NC）跨细胞屏障转运中的应用10,11,16,17，本文描述了一个示例：通过评估一种模型药物递送系统穿越人结肠直肠腺癌上皮（Caco-2）细胞单层的通透性，来模拟NC穿越胃肠道（GI）上皮的转运潜力。为此，将细胞培养于Transwell插件中的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）滤膜上，该滤膜孔径为0.8 μm ，直径6.4 mm ，具有透明特性，可用于显微镜成像。通过测量跨上皮电阻（TEER）、白蛋白从顶侧到基底侧的转运以及紧密连接组分闭合蛋白（occludin蛋白）的荧光显微镜观察，来验证通透性屏障的状态。本实验采用一种靶向聚合物纳米载体（NC）模型，其由100 nm的不可降解聚苯乙烯纳米颗粒组成。NC通过表面吸附单独包被靶向抗体，或同时包被靶向抗体与治疗性载荷，其中任一组分均可用125I标记以进行放射性同位素示踪。在该示例中，所用抗体识别细胞间黏附分子-1（ICAM-1），这是一种表达于胃肠道上皮细胞（及其他细胞）表面的蛋白，已被证实可促进药物载体及其载荷的细胞内和跨细胞转运21。载荷为α-半乳糖苷酶（α-Gal），是一种用于治疗法布里病（Fabry disease）的治疗性酶，该病是一种遗传性溶酶体贮积症22。
将尺寸约为200 nm的包被纳米颗粒（NCs）加入细胞单层上方的顶室中，在37 °C下孵育不同时间。随后可检测到NCs上的125I与细胞单层结合和/或转运至细胞下方的基底外侧室。通过额外测定游离的125I，可扣除降解部分，从而估算包被NCs的转运量。通过上述参数检测细胞旁通路相关的通透性屏障变化，进一步评估转运机制；而跨细胞转运则通过调节内吞和转吞途径后观察转运变化来确定。
这些方法可提供有关细胞屏障模型、药物递送系统转运程度与速率以及转运机制的重要信息，从而能够全面评估药物穿越细胞屏障递送的潜力。
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方案
1. 在Transwell小室中培养细胞单层
- 在无菌的生物安全二级细胞培养操作台中，放置0.8 mm 使用镊子将孔径为 PET 的 Transwell 小室放入 24 孔板中（每种条件 4 个孔，以确保统计学意义）。所有进入生物安全柜的物品均需用乙醇消毒。
注意：滤膜的孔径需根据所用纳米颗粒（NC）的平均尺寸进行选择，以允许其通过膜。此外，为获得具有统计学意义的结果，每个实验条件在同一次实验中至少需要设置四个重复孔，并且至少进行三次独立的实验。
- 准备细胞培养基：在DMEM培养基中添加4.5 g/L葡萄糖、15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，置于水浴中加热至37 °C。
- 将人结肠腺癌上皮细胞（Caco-2）用细胞培养基稀释后，取200–400 μl细胞悬液接种至Transwell小室的上层（顶侧）腔室中，接种密度为1.5 × 105 个细胞/cm2。在下层（基底外侧）腔室中加入700–900 μl细胞培养基。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养16–21天，每3–4天更换一次上下腔室的培养基，体积参照步骤1.3中的说明。为维持细胞单层上方的压力（而非下方），需按以下顺序更换培养基：先吸除下腔室中的培养基，再吸除上腔室中的培养基，随后向上腔室加入新鲜培养基，最后向下腔室加入新鲜培养基。
2. 使用跨上皮电阻（TEER）和紧密连接免疫染色验证胃肠道上皮通透性屏障
- 短期储存（少于2周）时，将STX100电极浸入电解质溶液（0.1–0.15 M KCl或NaCl）中。将电极电缆连接至EVOM伏欧表的电极接口，使系统内部短路并保持电极对称性。长期储存时，用dH2O冲洗后，在干燥、避光条件下保存。
- 为电极消毒时，将其浸入乙醇中15分钟，随后静置晾干15秒。或者，可将电极存放于紫外灯罩内。每次测量电阻前，用无菌电解质溶液（磷酸盐缓冲液，PBS）或0.1–0.15 M KCl或NaCl溶液冲洗电极。
- 将伏欧表设定在电阻测量模式，垂直地将电极插入含有Transwell小室的孔中，短电极置于上室，长电极置于下室并接触孔底。待EVOM读数稳定后，记录每孔的电阻值（单位为欧姆；Ω）。
- 通过减去背景电阻（即无细胞Transwell小室的TEER值），再乘以膜表面积，计算样品的电阻率（经面积归一化的电阻；Ω×cm2）。文献中通常报告电阻率值。（见讨论部分）
- 每隔1–2天重复测量一次，直至TEER值上升至最大并趋于平稳，表明通透性屏障已形成，此过程通常从细胞接种起需2–3周。达到平台期的TEER值及所需时间可能因细胞传代次数不同而有所差异。
- 为验证高TEER值细胞单层中紧密连接的存在（TEER值等于或高于屏障形成阈值），使用冷的2%多聚甲醛孵育15分钟固定细胞。随后用PBS洗涤细胞，并在室温下与1 μg/ml抗occludin抗体孵育30分钟。再次用PBS洗涤后，在室温下与7.5 μg/ml荧光标记的二抗孵育30分钟。使用低TEER值的孔作为屏障形成的阴性对照。
注意：可使用针对其他紧密连接蛋白的抗体替代抗闭合蛋白抗体。
- 小心切除固定单层细胞所附着的滤膜，并将其安装到载玻片上，用于落射荧光或共聚焦显微镜成像。
3. 评估靶向载体的跨上皮转运
- 按照先前所述方法7，用125I标记靶向抗体（本示例中为抗ICAM-1的小鼠单克隆抗体，anti-ICAM）。采用Bradford法测定蛋白浓度，并使用γ计数器测定抗体上的125I含量，然后计算标记抗体的比活性，单位为每毫克抗体的计数每分钟（CPM/mg）。
注意：为控制特异性，可通过标记小鼠IgG重复该操作步骤，该IgG将用于制备非靶向包被的纳米载体（NCs）。为研究治疗性货物的转运，可重复该操作步骤以标记货物，例如本示例中的α-半乳糖苷酶（α-Gal）。靶向剂、非特异性对照或治疗性货物均可使用其他替代物。也可采用其他替代方法对化合物进行标记，并估算标记后产物的浓度。
- 将标记的靶向抗体（以抗ICAM为例）与NCs表面偶联。在此示例中，按照文献7所述，将聚苯乙烯纳米微球（直径100 nm）与125I标记的抗ICAM在室温下孵育1小时，以实现抗体在微球表面的吸附。
注意：非特异性对照使用 125I-IgG。若需示踪某种货物分子的转运过程，请联合使用靶向抗体与125I标记的货物分子（本实验示例中为α-半乳糖苷酶）。
- 在13,000 × g条件下离心3分钟，通过抽吸去除上清液中的未包被组分。用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS重悬含有包被纳米颗粒（NCs）的沉淀，通过移液吹打重悬，并以低功率超声处理以破坏可能存在的颗粒聚集体（20–30次短时脉冲）。
- 对于纳米颗粒的表征，采用动态光散射法测定包被颗粒的粒径、多分散系数及ζ电位（遵循仪器厂商操作说明）；使用γ计数器定量颗粒表面125I标记的靶向抗体分子（例如 抗ICAM抗体）的数量。
注意：这些方法可重复用于非特异性及治疗性对应物。包被颗粒的大小约为200 nm。
- 向融合的 Caco-2 单层细胞（TEER ≥350 Ω×cm2，参见讨论部分）的上室中加入125I-抗体纳米载体（例如 125I-抗 ICAM 纳米载体；56 nCi/ml），背景值以上（接种后 16–21 天）。在 37 °C 下孵育一个或多个所需时间间隔。在孵育前后测量 TEER（第 2.3 节），以评估纳米载体对通透性屏障的影响。
注意：此操作可重复用于非特异性及治疗性对应物。
- 分别从上室和下室收集培养基，并用 0.5 ml 37 °C 的 DMEM（上室）或 1 ml dH2O（下室）洗涤一次。收集洗涤液，使用γ计数仪测定总放射性同位素含量。
- 为测定细胞组分，切除可渗透滤膜，e.g. 可使用剃须刀片沿边缘切割，然后将滤膜置于含 1% Triton X-100 的γ计数管中孵育 10 分钟（以释放细胞内容物），再测定与细胞相关的总放射活性。
- 为测定运输过程中或因潜在降解而从 NCs 释放的 125I，首先将 300 μl 样品（来自上室、下室或细胞组分）与 700 μl 含 3% BSA 的 PBS 及 200 μl 三氯乙酸（TCA）混合，室温孵育 15 分钟。在此期间，使用γ计数仪测定该样品的总放射活性。
- 将 TCA 样品在 3,000 x g 条件下离心 5 分钟，以分离完整蛋白（沉淀）与降解蛋白或 125I 组分（上清）。测定游离125I 组分的放射活性，并从离心前测得的总放射活性中减去该值，由此可得未降解的标记蛋白量。
4. 靶向纳米载体跨上皮转运的机制
- 按照第 3.1 节所述及先前报道的方法7，用 125I 标记白蛋白。
注意：白蛋白是一种分子量为66.5 kDa的蛋白质，因此属于相对较大的物质。尽管它可作为较大物体被动转运的有效对照（例如 200 nm的NCs在此处被使用），但在研究较小药物载体的转运时，应替换为更小的惰性示踪分子（见讨论部分）。
- 为利用白蛋白旁细胞渗漏评估旁细胞转运，将Caco-2单层细胞培养于Transwell小室上，方法如上所述。
- 向细胞单层上方的上室培养基中加入仅含125I-白蛋白的溶液（作为显示基础渗漏水平的阴性对照），或同时加入125I-白蛋白和非放射性标记的靶向抗体纳米载体（NCs）（见第3.5节）。在37 °C孵育选定的时间间隔，该时间应与测试NC转运时所用的时间一致。在孵育前、孵育过程中及孵育后测量TEER（见第2.3节），然后按第3节所述收集所有组分，用于总125I和游离125I的测定。注意：可同时加入125I-白蛋白和非放射性标记的对照IgG NCs作为对照。
- 为打开细胞间连接提供阳性对照，向Transwell小室的上室和下室培养基中加入含5 mM H2O2的细胞培养液，在37 °C孵育30分钟。随后测量TEER（见第2.3节），并将125I-白蛋白加入上室，孵育选定的时间间隔。在孵育期间的不同时间点测量TEER，以确定由H2O2诱导的细胞连接打开所导致的TEER值下降。
- 在平行实验中，通过将融合的Caco-2单层细胞与以下物质共同孵育，评估125I标记靶向NCs的穿细胞转运（也称为转胞吞作用）：50 μM 单丹磺酰尸胺（MDC；网格蛋白介导的内吞作用抑制剂）、1 μg/ml 菲立普林（filipin；小窝蛋白介导的内吞作用抑制剂）、0.5 μM 渥曼腺素（wortmannin；磷脂酰肌醇3激酶[PI3K]抑制剂，参与巨胞饮作用）或20 μM [5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利]（EIPA；巨胞饮作用和CAM介导的内吞作用抑制剂15）。
注意：125I-IgG 纳米复合物和 125I-白蛋白可作为这些抑制剂作用的阴性对照，其他方法（例如 siRNA 技术）可能提供更具选择性的抑制效果。
- 在细胞与抑制剂和放射性标记物质孵育前、孵育期间及孵育后，测量TEER（见第2.3节），以作为抑制剂对单层细胞通透性影响的额外对照。
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结果
为验证用于研究靶向纳米载体（NCs）跨上皮转运的细胞模型，图2 显示，以 1.5 × 105 个细胞/cm2 密度接种的 Caco-2 单层细胞约在第12天达到汇合，并在第18天前维持单层完整性，这由经上皮电阻（TEER）值所证实（图2A）。在TEER值较高（390 Ω×cm2，第14天）的单层细胞中，紧密连接蛋白occludin呈阳性表达（图2B），而在TEER值较低（17 Ω×cm2，第5天）时紧密连接标记较弱，进一步验证了上述结果。
通过追踪NC组分上的放射性标记，可确定最初加入到顶端腔室的这些组分（NC靶向抗体或货物）的总量、与细胞结合的部分以及转运至基底外侧的部分。在减去各组分中游离的125I（代表已降解的对应物）后，可利用这些数值计算多个更准确描述NC转运情况的参数。例如，可计算出穿过细胞单层的抗体分子、货物分子或结合的NC数量，以评估绝对转运量；也可计算相对于...
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讨论
利用上述方法，可建立用于研究靶向纳米载体（NCs）跨细胞屏障转运的细胞模型，例如文中提供的Caco-2上皮细胞模型，该模型适用于评估口服给药系统中药物从胃肠道管腔进入血液的转运过程。通过在Transwell小室中培养胃肠道上皮细胞单层，可测定经上皮电阻（TEER）并进行紧密连接的荧光免疫染色，以确认细胞通透性屏障的形成。随后，使用125I对靶向剂和治疗剂进行放射性标记，从而实现对靶向纳米载体进入及跨胃肠道细胞单层的快速且灵敏的定量分析。最后，结合内吞抑制剂、TEER检测以及白蛋白旁细胞渗漏实验，开展机制研究，以评估转运过程是通过囊泡途径还是旁细胞途径进行的。
建立类似模型的一个重要参数是细胞类型的选取，所选细胞应能反映所研究细胞屏障的生理特性。目前市面上可获得多种来源于人类或动物的上皮细胞和内皮细胞。16,18-20这些细胞可单独培养，即单层培养，如本文所述；也可与其他细胞类型共同培养，即共培养。例如 分泌黏液的细胞、免疫细胞、周细胞 等等。)16,18-20在共培养体系...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了霍华德·休斯医学研究所和国家科学基金会向 R.G. 提供的博士后奖学金，以及美国国立卫生研究院（资助号 R01-HL98416）和美国心脏协会（资助号 09BGIA2450014）向 S.M. 提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Transwell 小室 | BD Falcon | 353095 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），1× | Cellgro | 10-013-CM | |
| 胎牛血清（FBS） | Cellgro | 35-015-CV | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen Strep） | Gibco | 15140 | |
| 人结肠腺癌上皮细胞（Caco-2 细胞） | ATCC | HTB-37TM | |
| 125I 碘 | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | 放射性危害 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190-235 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Equitech Bio | BAH-66 | |
| 多聚甲醛（16%） | 费舍尔科技（Fisher Scientific） | 15710 | |
| 小鼠免疫球蛋白 G（IgG） | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| 抗人 ICAM-1 的小鼠单克隆抗体（抗 ICAM 抗体） | Marlin 1987 | ||
| α-半乳糖苷酶（来源于绿咖啡豆） | Sigma | G8507-25UN | |
| 荧光素异硫氰酸酯（FITC）乳胶微球，100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| 曲拉通 X-100（Triton X-100） | Sigma | 234729-500ML | |
| 三氯乙酸（TCA） | 费舍尔科技（Fisher Scientific） | SA433-500 | |
| Occludin 抗体（Y-12），山羊多克隆抗人抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| 单丹磺酰尸胺（MDC） | Sigma | D4008 | |
| 菲立宾（Filipin） | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利（EIPA） | Sigma | A3085 | |
| 渥曼青霉素（Wortmannin） | Sigma | W1628 | |
| γ 计数器 | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| 伏特-欧姆计 | 世界精密仪器公司（World Precision Instruments） | EVOM2 | |
| TEER 电极 | 世界精密仪器公司（World Precision Instruments） | STX100 | 适用于不同孔板的电极 |
| 动态光散射（DLS） | Malvern | Nano-ZS90 |
参考文献
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
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