通过人体志愿者浅表刮取活检获得的鼻上皮细胞，在组织培养插件中进行扩增和转移。当细胞达到汇合状态后，于气液界面培养，从而获得纤毛细胞和非纤毛细胞的培养物。分化的鼻上皮细胞培养物为研究呼吸道黏膜提供了可行的实验模型。
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摘要
摘要
体外模型利用人原代上皮细胞，对于理解呼吸上皮在微生物感染或吸入性物质作用下的关键功能至关重要。通过对来自疾病人群的细胞进行直接比较，可帮助我们表征不同的表型，并解析介导上皮细胞功能变化的潜在机制。人支气管上皮细胞的培养已有充分文献记载，但受限于人肺组织的可获得性，或获取支气管刷检样本所伴随的侵入性操作。鼻上皮细胞则可通过创伤更小的浅表鼻腔刮取活检获得，且受试者可多次接受活检而无明显副作用。此外，鼻腔是呼吸系统的入口，因此也是暴露于各类空气传播应激源（如微生物因子、污染物或过敏原）的首要部位。
简而言之，从人类志愿者获取的鼻上皮细胞首先在包被的组织培养板上扩增，然后转移至细胞培养小室中。当细胞达到融合状态后，继续在气液界面（ALI）条件下培养数周，从而建立更接近生理状态的培养环境。ALI培养条件使用成分明确的培养基，可诱导形成分化的上皮层，其形态学和功能特征与人体鼻上皮相似，包含纤毛细胞和黏液分泌细胞。含有分化后鼻上皮细胞的培养小室可根据不同的研究问题进行多种操作（如药物处理、慢病毒载体转导、气体暴露或微生物感染），并可针对多种终点指标进行分析，包括细胞与分子通路、功能变化、形态学等等。
体外 分化的人类鼻上皮细胞模型将使研究人员能够利用在很大程度上模拟鼻上皮的器官型实验模型，回答新颖且重要的研究问题。 在体内.
引言
技术目标
气道中的上皮细胞（ECs）是吸入性环境应激原（如病原体、过敏原或空气污染物）最先直接接触的部位之一。上皮细胞不仅是结构性屏障，还发挥类似交换站的作用，启动并调控呼吸道免疫反应。1-3 通过可溶性介质的释放4-6 及其表面配体/受体的表达 7-9. 虽然永生化细胞系可作为研究呼吸道上皮细胞的模型 体外，它们无法分化成由极化的纤毛细胞和产黏液细胞组成的异质性细胞群体，这与所观察到的情况相似 在体内. 为了重现呼吸上皮中观察到的重要特征 在体内，可使用原代气道ECs。因此，我们的目标是优化利用来自人类志愿者的鼻上皮细胞（NECs）的方法。NECs经扩增和培养 体外，从而获得一种分化鼻上皮细胞的培养模型，该模型模拟了鼻上皮的多种特征 在体内.
原理
使用 体外 模拟人原代ECs的模型 在体内 这种情况——如本研究所述——为研究内皮细胞（ECs）的疾病特异性差异、与气道上皮相关的生理参数，以及内皮细胞与其他细胞类型（如树突状细胞）之间的相互作用提供了独特的机会。 10自然杀伤细胞11 或巨噬细胞。现有的多种方法利用支气管上皮细胞（ECs），这些细胞可通过支气管镜检查期间的刷取活检侵入性获取，或来自其他情况下将被丢弃的肺组织12-17此外，已有商业来源可提供完全分化的人呼吸道上皮细胞培养模型（如 MatTek 公司（美国马萨诸塞州阿什兰）的 EpiAirway 模型、Lonza 公司（瑞士巴塞尔）的 Clonetics、Epithelix Sars 公司（瑞士日内瓦）的 MucilAir），研究者可从中选择不同供体的细胞。然而，由于 commercially available 上皮细胞来源有限、可选或预设的实验参数较少、获取原代人呼吸道上皮细胞的商业成本较高，以及难以获得废弃的肺组织或新鲜的人支气管活检组织，许多研究者无法开展基于完全分化的人呼吸道上皮细胞的研究。因此，我们致力于开发一种技术，该技术将：1）利用无创获取的人鼻上皮细胞（NECs）；2）提供一种可获得分化人呼吸道上皮细胞培养物的实验方案；3）在大多数具备常规组织培养设施的实验室中均可重复实现。
相较于现有技术/模型的优势
与支气管或小气道上皮细胞相比，获取新鲜鼻上皮细胞（NECs）的侵入性显著更低，受试者可多次接受鼻部刮取活检而无明显副作用，且表浅鼻刮取活检可用于那些因病情原因无法接受研究相关支气管镜检查的患者群体。这种非侵入性的表浅刮取活检方法使研究者能够自主设定供体筛选标准。 先验地，包括年龄、性别、疾病状况， 等等。 根据拟实现的研究目标而定。因此，在设计研究方案时，研究者不受临床可获取的组织或上皮样本的限制，无需从商业供应商处购买昂贵的已分化细胞培养模型，也无需设计具有侵入性的支气管镜检查研究。此外，鼻上皮细胞（NECs）易于获取，使得研究者能够开展来自不同供体细胞的实验，从而增强所观察结果的统计学验证能力。最后，鼻腔是暴露于各类空气传播应激源的首要部位之一。因此，构建类器官型 体外 模拟鼻黏膜的培养系统可用于研究病毒颗粒、污染物、过敏原或气体的吸入，通过该细胞培养系统可轻松实现上述研究。
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方案
1. 准备塑料器皿：包被培养板
- 向12孔板的每个孔中加入500 μl PureCol（用无菌水按1:100稀释）。
- 在37 °C培养箱中孵育30分钟，于接种细胞前（见下文步骤3.1）吸除PureCol，并用HBSS冲洗。
2. 获取和预处理人鼻上皮细胞活检样本
- 鼻腔刮取活检
- 使用手术耳镜配合窥器（型号 21700）及可重复使用的聚丙烯鼻窥器（型号 22009，直径 9 mm），在直视下获取鼻甲表面的上皮细胞。该装置可提供对鼻甲结构的最佳视野及操作灵活性。
- 受试者取坐位，背部挺直，头部稍向后仰，或仰卧于检查台上进行活检。
- 将耳镜窥器插入鼻孔，利用光源观察下鼻甲。
- 将无菌热塑性刮匙经窥器插入，使其顶端伸展至鼻甲后部。
- 轻压下鼻甲表面，将刮匙在黏膜表面来回刮取 5 次后撤出。若刮匙凹槽内可见因毛细作用吸附的黏膜细胞，则表明细胞采集成功。
- 将样本置于含 8 ml RPMI 1640 培养基的 15 ml 锥形管中，冰上运输。
- 使用镊子取出刮匙，用 P-1000 移液器将组织从鼻腔刮匙上冲洗下来，随后丢弃刮匙。
- 离心收集细胞沉淀（4 °C，400 × g，5 分钟），吸除上清液（注意：避免吸走沉淀）。
- 用含 10 μl 100× DNase 1 的 1 ml BEGM 培养基重悬沉淀。
- 室温孵育 20 分钟。
- 再次离心（4 °C，400 × g，5 分钟），切勿吸除上清液！
3. 在塑料培养皿上接种细胞（第0天）
- 从培养板中移除 PureCol，并用 HBSS 冲洗（另见步骤 1.2）。
- 向包被好的培养板的 1-4 个孔中（根据活检组织大小而定）加入最小体积的 BEGM++ 培养基（80–100 μl，直至孔中心出现培养基弯月面）。
- 使用 P-1000 移液器小心地将活检组织沉淀从管中转移出来，避免吸入过多培养基。
- 将沉淀置于孔的中央，保持活检组织为细胞团簇状态，不要将其打散成单细胞悬液。一次良好的活检可接种最多 4 个孔。将培养板放入组织培养箱中（37 °C，5% CO2，相对湿度 >90%）。
- 两小时后检查，确保培养基量充足（不要破坏弯月面）。
- 第 1 天，接种后 24 小时：收集所有孔中的非贴壁细胞（倾斜培养板，用 P-1000 收集含细胞的培养基，将所有孔的液体收集至一个 1.5 ml 离心管中）。
- 离心（4 °C，400 × g，5 分钟）。
- 在离心细胞悬液的同时：向第 0 天接种的细胞中加入约 250 μl BEGM++ 和 250 μl BEGM+ 培养基的混合液。
- 对非贴壁细胞重复步骤 3.1–3.5。
- 第 2–5 天：每天更换细胞培养基；每孔加入 500 μl 培养基，并逐步减少 BEGM++ 培养基的用量（接种后第 2 天：125 μl BEGM++ 加 375 μl BEGM+；接种后第 3 天及之后各天：73 μl BEGM++ 加 427 μl BEGM+）。
4. 在培养瓶中扩增细胞
- 每天观察细胞；当细胞达到 80-90% 汇合度时（通常在活检后 5-7 天，若超过该时间仍未达到则表明细胞无法成功生长），按以下步骤消化细胞：小心吸除培养基；每孔加入 500 μl 0.25% 胰蛋白酶，置于 37 °C 培养箱中直至细胞脱落（通常需要 2-3 分钟）。
- 在 15 ml 离心管中准备所需体积的大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）（每 1 ml 胰蛋白酶对应 750 μl SBTI）。
- 通过反复吹打胰蛋白酶溶液使细胞脱落，将细胞悬液转移至含 SBTI 的 15 ml 离心管中。
- 用总共 1 ml HBSS 冲洗所有孔，将冲洗液一并加入含细胞的离心管中。
- 离心收集细胞（4 °C，400 × g，5 分钟），吸除上清液，加入 1 ml BEGM+ 培养基重悬细胞，并涡旋混匀。
- 根据细胞沉淀量将细胞扩增至 T25 或 T75 培养瓶中（此为第 1 代；约两个汇合的六孔板孔中的细胞可接种至一个 T75 培养瓶，一个汇合孔的细胞可接种至一个 T25 培养瓶，通常两个汇合孔可获得一个 T75 培养瓶的细胞量）。
- 向培养瓶中加入 BEGM+ 培养基（每个 T75 加 5 ml，每个 T25 加 3 ml）。
- 将细胞悬液加入培养瓶中，随后将培养瓶放入组织培养箱中培养。
- 接种至培养瓶后 24 小时：向培养瓶中补充额外的 BEGM+ 培养基（T25 加 3 ml，T75 加 10 ml）。
- 在培养瓶中维持细胞生长：吸除旧培养基（从瓶角小心吸出），加入新鲜 BEGM+ 培养基（T25 每瓶 5 ml，T75 每瓶 20 ml）。每 2-3 天更换一次培养基。持续培养至细胞汇合度约为 80%（汇合状态可能不均匀；通常需要 7-10 天；若超过 10 天仍未达到汇合，则细胞无法成功生长）。
5. 在细胞培养小室中接种细胞
- 从培养瓶中移除培养基，加入胰蛋白酶（T25 瓶加 3 ml，T75 瓶加 4 ml）。
- 37℃孵育 °C，直至细胞脱落（约 2-3 分钟）。
- 准备 SBTI（750 μ1 ml 胰蛋白酶中的 l > 2.25 ml（T25）和 3 ml（T75）置于 15 ml 离心管中。
- 通过轻敲锥形瓶并用移液器反复吹打使细胞脱落，然后加入SBTI转移至锥形管中。
- 用HBSS冲洗培养瓶（T25加1 ml，T75加2 ml），将HBSS加入15 ml离心管中。
- 离心以形成沉淀（4 °C，400 × g，5 分钟），小心移除上清液。
- 准备培养板：确定将要接种的培养板数量，用样本编号、编号和传代次数标记培养板即 p2）和日期。加入 700 μ向基底室加入l BEGM+培养基。
- 将细胞沉淀用1 ml BEGM ALI培养基重悬，通过涡旋振荡管子混匀。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数（一个T25培养瓶通常可获得约400万个细胞；一个T75培养瓶的细胞数量可高达2000万个，具体取决于组织来源；每12孔板接种100万至200万个细胞），并用BEGM ALI培养基将细胞悬液稀释至所需接种板数对应的总体积（1.2 × 10⁵ 个细胞/毫升）。6 每孔加入2.5 ml培养基。（注意：如果需要冻存部分细胞，此时应标记试管并收集细胞：我们通常冻存2 x 10⁶6 2 ml 冻存液中的细胞
- 加入200 μl细胞悬液加入至每个未包被的Corning 12孔细胞培养插件的顶端侧>这大约为每孔80,000–150,000个细胞；12 mm Transwell，孔径0.4 μm 孔聚酯（聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET））膜插件）；转移至组织培养孵育箱。
- 24小时后，更换顶端培养基（200 μl 扩增培养基）
- 维持细胞培养： 更换培养基（BEGM ALI 培养基；700 μL） μl 基底外侧和 200 μ每隔一天从顶端（apical）更换培养基。在细胞完全汇合（单层细胞无可见孔洞）之前，必须将插入式培养小室保持在完全浸没状态。根据细胞数量，通常需要2-6天；若超过此时间仍未汇合，细胞很可能失去活性。
6. 当细胞完全汇合后建立气液界面（当Transwell上的细胞完全汇合时）
- 当细胞完全汇合后，将顶端和基底侧培养基均更换为添加了500 nM视黄酸的BEGM ALI培养基，培养48小时。
- 添加含视黄酸的BEGM ALI培养基48小时后：配制PneumaCult-ALI 维持 培养基（按照生产商说明书操作）：计算所需培养基体积（通常每孔板基底室需8.5 ml）；每1 ml PneumaCult完全基础培养基中加入：
- 10 μl PneumaCult 100x维持补充剂
- 2 μl 肝素（2 mg/ml储备液）
- 5 μl 氢化可的松（96 μg/ml储备液）。
- 移除所有培养基，仅在基底侧加入700 μl PneumaCult-ALI维持培养基（顶端侧不加培养基）。
- 在气液界面（ALI）条件下维持细胞培养4周：
- 每隔一天更换一次培养基（我们通常采用周一、周三、周五的换液方案）。
- 在ALI培养一周后，每周一次（周三）对顶端表面进行冲洗：向顶端侧加入200 μl HBSS，放入培养箱中孵育10分钟，然后小心吸除HBSS（在生物安全柜中使用连接真空泵的9英寸玻璃移液管，移液管前端装上200 μl吸头以吸取HBSS）。
注意：在不同培养板之间移液时需更换枪头，且从顶端表面移液至基底侧表面时也需更换枪头。在气液界面（ALI）培养约2周后，细胞开始分化并出现纤毛。细胞培养约4周后在气液界面达到完全分化。
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结果
按照本方案培养的NECs会再分化为由纤毛细胞和非纤毛细胞组成的异质性内皮细胞层，代表了 体内 情况图1）。部分分化的 NEC 为黏液分泌细胞（经 AB/PAS 染色呈蓝色的细胞， 图1B）。尽管本实验方案已进行了优化，但不同细胞群体的分布仍可能存在差异（即 不同比例的纤毛细胞：黏液分泌细胞：非纤毛细胞），甚至可能形成更倾向于鳞状的上皮。这些差异可能取决于供体人群，因而可代表潜在疾病表型的再现，正如我们先前利用吸烟者的鼻上皮细胞（NECs）所证实的那样。 18. 图2 展示了使用不同方案和培养基配方进行再分化时效果欠佳的NECs实例。这些细胞呈鳞状，既非立方形，也无纤毛，无法模拟假复层呼吸道上皮图2).
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讨论
呼吸道上皮细胞不仅为人体提供抵御外源性刺激的物理屏障20，还能作为中枢，启动并调节呼吸道免疫防御反应1-3 通过分泌可溶性介质或直接的受体-配体细胞间相互作用。为了进一步研究内皮细胞（ECs）在免疫反应中的作用，检测来自疾病人群的内皮细胞之间的潜在差异，或研究外源性应激因素对内皮细胞的影响，重建这些 在体内 情况。人类气道包含超过40种不同的细胞类型20 包括不同类型的上皮细胞，如纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞20本方案描述了如何处理浅表鼻腔刮取活检样本以获得可扩增培养并重新分化的鼻上皮细胞（NECs），从而建立在很大程度上模拟鼻上皮组织的NEC培养体系。 在体内
利用这种类器官型原代人鼻上皮细胞（NECs）的体外模型为多种应用提供了独特的机会。该模型可用于研究鼻上皮细胞在不同疾病中的特异性差异（例如囊性纤维化、哮喘、吸烟），揭示疾病的潜在机制，以及对空气污染物（例如臭氧、柴油机尾气、香烟烟雾）进行可控暴露研...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Lisa Dailey 提供的有益建议。
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（ES013611 和 HL095163）、飞行乘务员医学研究所（FAMRI）以及环境保护局（CR83346301）的资助，并声明无利益冲突。本文内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。尽管本文所述研究部分由美国环境保护局通过与北卡罗来纳大学教堂山分校环境医学、哮喘与肺生物学中心签订的协作协议 CR83346301 资助，但该研究尚未经过该机构要求的同行评审和政策审查，因此不一定反映该机构的观点，不应推断其官方认可。提及商品名称或商业产品并不构成对其使用之认可或推荐。Loretta Müller 获得瑞士国家科学基金会个人资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 鼻窥器 | Welch Allyn | Model 22009 | 9 mm，可重复使用的聚丙烯 |
| 使用耳镜 | Welch Allyn | Model 21700 | |
| 鼻腔探针细胞比色皿 | Arlington Scientific | SY-96-092 | 稍微多弯曲一下比色皿的头部 |
| 12孔培养板 | Corning | 3512 | |
| Transwell 膜细胞培养小室 | Corning | 3460 | |
| 组织培养瓶 | Corning | 430639 和 430641 | T25 和 T75 透气培养瓶 |
| RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | Gibco | 11875 | |
| 支气管/气管上皮细胞生长培养基 | 细胞应用 | 511-500 | |
| BEGM 支气管上皮细胞生长培养基 | Lonza | CC-3170 | 这包含一套试剂盒，内有一瓶培养基和若干瓶补充剂。 |
| 7.5% 碳酸氢钠溶液 | Gibco | 25080 | 按原样使用。 |
| NuSerum | BD Biosciences | 355104 | 照常使用。 |
| BAMBANKER 冻存培养基 | BAMBANKER | 302-14681 | 照原样使用。 |
| CoolCell | Biocision | HTBCS-136 | （CryoPrep 无酒精细胞冻存容器） |
| PureCol | AdvancedBioMatrix | 5005-B | 用无菌水按1:100稀释（浓度约为0.03 mg/ml），使用500 μ12 孔板每孔 |
| 含钙的HBSS2 和 Mg2+ | Gibco | 14025 | |
| DNA酶1 | Sigma | DN25 | 溶解至 1.5 mg/ml，即 100 倍溶液，加入 10 μ每毫升培养基中加入 l |
| 胰蛋白酶，0.25%，1×，含酚红 | Gibco | 25200-056 | 按原样使用 |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI） | Sigma | T6522 | 使用 HBSS 溶解，浓度为 1 mg/ml |
| 视黄酸 | Sigma | R7632 | 补足至 100 μM 储备液（见下文），稀释至 10 μM 用无水乙醇，取 5 μl 的此溶液加入 1 ml BEGM 培养基中（配制成工作液）。 全反式视黄醇在乙醇中于325 nm处的消光系数为52,480。将25 mg溶于50 ml无水乙醇中。需进行系列稀释：取50 ml储备液加入450 ml无水乙醇中，取其中50 ml再加入450 ml无水乙醇中，再取50 ml加入450 ml无水乙醇中，再次取50 ml加入450 ml无水乙醇中，然后取100 ml加入900 ml无水乙醇中，在分光光度计中于325 nm处测定吸光度，所得数值乘以其’ 稀释倍数，再除以消光系数 52,480，即可得到以 mM 为单位的数值。配制 100 mM 原液（于 -20 ℃ 保存） °C）并由此储备液配制10 mM的等分试样，则每日所需的视黄酸为将5 ml该10 mM等分试样加入995 ml ALI培养基中。示例：325 nm处的读数为1.15。计算：1.15 × 10,000（稀释倍数）/ 52,480 = 0.219 = 219 mM，用无水乙醇将此溶液配制成100 mM的储备液。 |
| DMEM高糖（1倍浓度），液体，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠 | Gibco | 11995 | |
| 牛垂体提取物 | Gibco | 13028-014 | 用于 BEGM ALI 培养基。 |
| 制霉菌素 | Sigma | N4014-50 mg | 配制 3.3 mg/ml 的溶液。 |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | BP1600-100 | 在超纯水中配制 10 mg/ml 的溶液。 |
| PneumaCult-ALI 培养基 | 干细胞 | 5001 | 这包含一套试剂盒，内含一瓶培养基和若干瓶补充剂。详情见下文。 |
| 氢化可的松 | 干细胞 | 7904 | 将 2.4 mg 氢化可的松溶解于 1 ml ddH₂O 中2O（用于配制200倍浓度氢化可的松储备液） |
| PBS 中的肝素钠盐（2 mg/ml） | 干细胞 | 7980 | 照原样使用。 |
| 滤器瓶（500 ml） | Corning | 431097 | 0.22 μm 孔径 |
| 滤管（50 ml） | Millipore | SCGP00525 | Steriflip，0.22 μm 孔径 |
| 移液器吸头 - ART Barrier Tips | 分子生物制品 | 2139RI, 2069RI, 2179RI | |
| 锥形管，无菌，15 ml 和 50 ml | |||
| ddH2O，绝对乙醇，冰 | |||
| CO2 培养箱 | |||
| 冷藏离心机 | |||
| 生物安全柜 | |||
| 移液器（P2、P200、P1000），9英寸玻璃移液管 | |||
| 手套 | |||
| 袖口收窄的实验服 | |||
| <表格 边框="1"> | |||
| 使用的培养基和溶液： | 配方 | 用于 | |
| 一般注意事项：始终将培养基预热至室温 | |||
| BEGM 培养基 |
| （将两者等体积混合并过滤） | |
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| BEGM+ 培养基 |
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| BEGM++ 培养基 |
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| BEGM ALI 培养基 |
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| 200倍氢化可的松储备液（96 μl/ml 溶液 |
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| 通过0.22 μm滤膜过滤溶液 μm 滤器过滤，分装溶液并于 -20 保存 °C，避免额外的冻融循环 | |||
| PneumaCult-ALI 完全基础培养基 |
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| （此溶液在2-8℃下可稳定保存2周） °C 或在 -20°C 下保存长达 6 个月 °C) | |||
| PneumaCult-ALI 维持培养基 | 每 1 ml PneumaCult-ALI 完全基础培养基中添加： | 插入式培养小室中的气液界面培养 | |
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参考文献
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