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方法文章

一种培养胚胎期 C. elegans 细胞的方法

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⸱

DOI：

10.3791/50649

⸱

2013年9月21日

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

本文内容

摘要

我们在此介绍一种用于大规模培养胚胎的改进方案 秀丽隐杆线虫 细胞。胚胎 秀丽隐杆线虫 培养的细胞 体外 使用该方法，似乎能够以细胞特异性的方式分化并重现基因的表达。可对其他组织中特定细胞类型进行直接访问或分离的技术可应用于 秀丽隐杆线虫 培养的细胞

摘要

秀丽隐杆线虫 是一个功能强大的模式系统，遗传学和分子生物学技术可轻松应用于该系统。然而直到最近，那些需要直接接触细胞并分离特定细胞类型的技术还无法在该系统中应用 秀丽隐杆线虫这一限制的原因在于组织被封闭在加压的角质层内，而角质层难以通过酶和/或去污剂处理有效消化。该结论基于Laird Bloom、Christensen及其同事的早期开创性工作。 1 建立了一种稳定的细胞培养方法 秀丽隐杆线虫 大规模培养胚胎细胞。通过漂白剂/氢氧化钠处理从产卵成虫中分离卵，随后用几丁质酶处理以去除卵壳。然后通过手动吹打使胚胎细胞解离，并接种至含血清的培养基中、铺于包被基质的玻璃表面。分离后24小时内，细胞开始分化，表现为形态改变及表达特定细胞标志物。 秀丽隐杆线虫 采用该方法培养的细胞可存活长达2周 体外 并已用于电生理学、免疫化学和成像分析，同时也经过分选用于微阵列表达谱分析。

引言

秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种用于研究细胞功能、分化和行为分子基础的强有力模式生物。尽管其基因组、代谢途径和生物合成途径与脊椎动物相似，但其遗传和分子操作的便利性远高于脊椎动物 2其优势包括体型小、解剖结构简单、生命周期短（在25 °C条件下为3天）、寿命短（2周）以及后代数量多（>200）。由于其雌雄同体的特性和较短的生命周期，对其进行分子和遗传操作较为简便 秀丽隐杆线虫，包括转基因动物的制备 3,4 以及基因敲低技术的应用，例如RNA干扰 5. 秀丽隐杆线虫 身体和卵壳是透明的，因此可以使用标准显微镜轻松观察成体和胚胎中的细胞。在过去40年中， 秀丽隐杆线虫 社区已创建了宝贵的资源 秀丽隐杆线虫 包括大量突变体、基因敲除和转基因品系的研究，以及对解剖结构和发育过程的详细描述 6,7，包括 nervous system 的完整重建 8，以及一个基因组已完全测序、注释完善并可向整个科研社区公开获取的基因组（www.wormbase.com).

尽管具有诸多优势，某些实验方法在实施过程中仍面临挑战 秀丽隐杆线虫这些包括需要接触细胞质膜以及分离组织或特定细胞类型的方法。确实 C . elegans 组织被限制在其加压的流体静力骨架内，这种结构不易被酶处理或去污剂消化。20世纪90年代末，Miriam Goodman 和 Janet Richmond 率先建立了对线虫进行电生理记录的方法。 秀丽隐杆线虫 神经元和肌细胞 原位 9,10. 尽管这些方法使我们对神经元和肌肉功能获得了重要的认识 体内，它们具有挑战性且通量较低。研究细胞功能的替代方法 体内 已经开发出来，尤其是 体内 使用基因编码钙离子传感器（如 GCamP 和 cameleon）进行钙成像 11-13然而，这些方法无法使用药理学工具，因为它们应用于完整的活体动物。

首次尝试培养 秀丽隐杆线虫 细胞 体外 由Laird Bloom在其博士论文准备期间大规模制备 14遗憾的是，由于细胞与基质黏附性差、细胞分化和存活率低等问题，该早期方案未能成为一种可靠的细胞培养方法。1995年，Edgar 及同事发表了一种通过分离和培养单个细胞来研究细胞分裂和形态发生的方案 C. elegans 胚胎 15通过酶消化与手动解离相结合的方法消化卵壳获得的胚胎细胞继续增殖，可产生多达约500个细胞 15随后，Leung 及其同事培养了少量的卵裂球以研究肠道形态发生。他们证明，其中一个 体外 分离的E卵裂球通过顶端黏附连接相互作用，形成了极化的肠细胞，并构建出类似于肠腔的结构 16Buechner 及其同事还报道了一种类似的培养方法 C. elegans 胚胎细胞 体外 17.

基于早期研究，Christensen 及其同事开发出一种稳定的胚胎培养方案 C. elegans 细胞 体外 1他们表明，分离的 C. elegans 细胞可分化为多种细胞类型，并维持其原有的特性 在体内 包括细胞特异性标志物的表达。多种具有挑战性的技术 体内，可应用于分离的 秀丽隐杆线虫 胚胎细胞。这些包括电生理学 1,18 19成像和免疫化学技术 20,21以及通过荧光激活细胞分选（FACS）分离特定细胞类型，用于构建细胞特异性cDNA文库 22,23基因敲低技术（如RNA干扰，RNAi）可用于培养的 秀丽隐杆线虫 细胞 1 一种利用叠氮糖作为糖蛋白发现工具的新型代谢标记方法 recently developed for 体外 培养的 秀丽隐杆线虫 细胞 24.

总之，细胞培养方法拓展了可应用于该领域的技术范围 C. elegans 在活体生物背景下解析基因功能的模型。本文描述了培养的方案 秀丽隐杆线虫 胚胎细胞 体外，该方法主要基于Christiansen及其同事首次描述的实验方案 1.

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方案

星号（*）表示与 Christensen et al.1 相比新增或修改的步骤

1. 材料准备

  1. 细胞培养过程需要从怀卵成虫中分离出大量卵。培养 C. elegans 在接种了NA22的8P琼脂平板上（NA22可通过 秀丽隐杆线虫 基因组联盟 - CGC）细菌以大量分离卵。这些培养基中所用的蛋白胨量是NGM平板常规用量的8倍。较高的蛋白胨浓度能更有效地维持NA22细菌的生长，而与OP50不同，NA22细菌会形成较厚的菌层。

8P 培养基配方：

将3 g NaCl、20 g Bacto-Peptone、25 g琼脂溶解于1 L无菌蒸馏水中，121 °C高压灭菌30 min。待培养基冷却至55 °C后，加入经无菌滤膜过滤的1 ml胆固醇溶液（5 mg/ml，溶于乙醇）、1 ml 1 MgCl2、1 ml MgSO4和25 ml KP缓冲液（储备液500 ml：5 g K2HPO4，30 g KH2PO4，pH 6.00）。将液体琼脂培养基倒入10 cm培养皿中（每皿25 ml）。

  1. 次日，用 1 ml 在 2XYT 培养基（每升无菌水中含 16 g 胰蛋白胨、10 g 酵母提取物、5 g NaCl，pH 7.0）中于 37 °C 过夜培养的 NA22 大肠杆菌（E. coli）均匀涂布于每块富集的蛋白胨琼脂平板表面。这些细菌将作为丰富的食物来源，形成致密菌层，支持大量成年 gravid 线虫的生长。将接种后的平板在室温下放置过夜，以允许细菌生长；也可在 37 °C 培养 4–5 小时以加快该过程。
  2. 将饥饿状态的线虫转移至接种好的 8P 平板。用 5–6 ml M9 缓冲液或水从饥饿的 NGM 平板上冲洗下线虫，并将 1–2 ml 此悬浮液加至每个 8P 平板中。
  3. 让线虫在平板上生长并繁殖，直至平板上布满成年 gravid 线虫。
  4. 使用 5–6 ml 裂解液，从成年 gravid 线虫中分离出用于制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎细胞所需的卵。

裂解液配方

5 ml 新鲜漂白剂、1.25 ml 10 N NaOH 和 18.5 ml 无菌 H2O。该混合液必须在每次使用前新鲜配制。

  1. 使用卵缓冲液清洗从怀卵成虫中分离的卵：

卵缓冲液配方

118 mM NaCl，48 mM KCl，2 mM CaCl2，2 mM MgCl2，25 mM Hepes，pH 7.3，渗透压 340 mOsm。

  1. 用几丁质酶处理去除包裹卵的卵壳。几丁质酶是一种在酸性pH条件下活性最高的酶25。将几丁质酶（Sigma，货号 C6137）溶解于pH 6.5的卵缓冲液中，终浓度为2 mg/ml。将几丁质酶储存液以1 ml分装于无菌15 ml锥形管中，于-20 °C保存。分装液可在-20 °C下保存数月。
  2. 在覆盖花生凝集素的已灭菌盖玻片（直径12 mm）上培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养细胞。将花生凝集素溶于无菌水（0.5 mg/ml）。花生凝集素溶液不应过滤或高压灭菌，也无需进行紫外照射处理。将2 ml分装液于-20 °C保存，可保存长达6个月。
  3. 完全细胞培养基（500 ml）包含500 ml Gibco公司的L-15培养基、50 ml胎牛血清（热灭活）、7.7 g蔗糖（45 mOsm）、5 ml青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）（2%）。将完全培养基用0.20 μm孔径滤膜过滤。

请注意，卵缓冲液和培养基的渗透压分别为 340 和 345 mOsm。事实上，与哺乳动物细胞不同，C. elegans 细胞具有相对较高的渗透压，在配制与细胞质膜直接接触的溶液时必须予以考虑。这些试剂的配方已调整至目标渗透压，并使用渗透压计进行测定1。如果严格按照本配方配制试剂，并在操作过程中保持谨慎，则无需使用渗透压计。然而，若需配制本文或其他使用 C. elegans 培养细胞的文献中未列出的其他溶液，则应使用渗透压计进行测定。

2. 卵的分离

  1. 建议至少从四个 8P 培养板开始，以收集足够的卵用于 12 孔培养细胞（置于 24 孔板中）。
  2. 开始操作前，解冻一管花生凝集素储备液。将灭菌的盖玻片放入 24 孔板的孔底，每孔加入 200 μl 花生凝集素溶液。孵育 1 小时，或直至细胞准备接种。彻底去除花生凝集素溶液，并用 1 ml 无菌灭菌水洗涤各孔一次。必须完全去除盖玻片上的花生凝集素，以避免细胞成团。
  3. 用无菌灭菌水将产卵成虫从琼脂平板上冲洗下来。将悬浮液收集至两个无菌的 50 ml 锥形管中。将管子置于冰上最多 5 分钟，使线虫沉淀至管底（*）。用移液塑料吸管吸去上清液，并替换为新鲜的无菌灭菌水。在台式离心机中以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟，使线虫沉淀（*）。重复此步骤至少 3 次。
  4. 将线虫转移至一个无菌的 15 ml 锥形管中，并以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟（*）。不要使用更高的离心速度，以免同时沉淀细菌。有时离心后线虫未能完全沉淀。每次洗涤后、去除上清液前，将管子在冰上放置 5 分钟。低温下线虫会沉淀至管底。
  5. 去除上清液，加入 5–6 ml 裂解液（见材料准备）。轻轻摇动悬浮液 5–10 分钟，然后每隔 2–3 分钟在体视显微镜下观察线虫裂解情况。也可将一滴悬浮液置于盖玻片上以便更清晰地观察。孵育时间因次氯酸钠的新鲜程度而异；建议购买小瓶装次氯酸钠，并每月更换新瓶。
  6. 当约 70–80% 的线虫已裂解（自孵育开始约 10 分钟后），加入 9 ml pH 7.3 的卵缓冲液终止裂解反应（见材料准备）。将悬浮液以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟。自此步骤起，在实验台开启本生灯，以防止卵再次污染（*）。
  7. 使用无菌塑料移液吸管小心去除上清液，并用卵缓冲液洗涤沉淀物 3–4 次，直至溶液澄清。每次洗涤时务必充分混匀沉淀物与卵缓冲液。
  8. 使用 30% 蔗糖溶液将卵与动物残体分离。将沉淀物重悬于 2 ml 无菌卵缓冲液中，加入 2 ml 60% 蔗糖溶液（以无菌卵缓冲液配制的储备液）。充分混匀后，在 200 × g（约 1,200 rpm）下离心 20 分钟（*）。
  9. 小心从离心机中取出管子。卵将漂浮在溶液上层。使用 P1000 移液器和无菌吸头，将所有卵转移至一个新的无菌 15 ml 锥形管中。
  10. 向管中加入 10 ml 无菌卵缓冲液，并以 200 × g（约 1,200 rpm）离心 10 分钟。重复洗涤 3 次。每次洗涤时务必确保卵在卵缓冲液中完全重悬。

3. 胚胎细胞解离

在超净工作台中进行无菌操作，完成后续实验步骤。当动物在含有细菌的培养基上生长时，洗涤及含漂白剂的裂解液处理应能消除大部分（即使非全部）细菌。因此，在该实验阶段使用超净工作台可防止卵悬液受到新的污染。

  1. 将沉淀的卵重悬于1 ml含2 mg/ml溶菌酶（溶于pH 6.5的卵缓冲液中的储存液（*））中，并转移至新的无菌15 ml锥形管中。室温下轻轻摇动孵育10–30分钟。确切的孵育时间取决于酶的新鲜程度和室温，因此每次制备时应单独确定。建议在孵育10分钟后，使用倒置细胞培养显微镜观察卵的消化情况。注意：根据我们的经验，较低的pH值可提高溶菌酶的酶活性。因此，我们使用pH 6.5的卵缓冲液溶解溶菌酶（配方见上文，其中使用NaOH将pH调节至6.5）。
  2. 当约80%的卵壳被溶菌酶消化后（图1 A-B），在900 × g（约2,500 rpm）下离心3分钟收集卵（*）。使用P1000移液器和无菌吸头小心吸除上清液，并加入3 ml L-15培养基（*）。
  3. 将卵转移至直径6 cm的培养皿中，使用配备18 G针头的10 ml无菌注射器轻轻吹打以解离细胞。取一滴细胞悬液置于新的塑料培养皿中，在显微镜下观察解离程度。此过程中切勿吸入空气，以免损伤细胞。持续解离直至约80%的细胞被分散。
  4. 使用无菌5 μm Millipore滤膜过滤细胞悬液。必须进行过滤以去除细胞团块、未消化的卵和已孵化的幼虫。再用4–5 ml新鲜L-15培养基冲洗滤膜，以回收所有细胞。过滤过程中避免施加过大压力，以防损坏滤膜或细胞。

4. 细胞培养

  1. 将解离的细胞在900 × g（约2,500 rpm）条件下离心3分钟（*），使细胞沉淀。使用P1000移液器和无菌吸头小心吸除全部上清液。将沉淀的细胞重悬于完全L-15培养基中，并接种至每孔1 ml。所加培养基的量取决于使用的8P板数量、板上蠕虫的汇合度以及后续实验的类型。细胞密度可通过血细胞计数板测定。进行膜片钳记录时，接种密度约为230,000个细胞/cm2为最佳。
  2. 将24孔板置于塑料保鲜盒中，并在盒内放置湿润的纸巾以防止培养基蒸发。将容器置于20 °C、空气环境的湿化培养箱中保存。
  3. 通常在接种后24小时内，细胞即可用于实验，此时形态学分化及GFP标记物的表达已基本完成。细胞可在培养条件下维持长达2周，但通常在接种后7–9天内状态最佳。为维持细胞健康，需每天更换一次培养基。

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结果

C. elegans 培养的细胞发生分化并表达细胞特异性标志物

Christensen 及其同事通过台盼蓝染色证明了 >99%的胚胎 秀丽隐杆线虫 细胞在分离过程中存活。铺板后第9天和第22天，存活率分别为85%和65%。 1分离的胚胎 秀丽隐杆线虫 细胞必须黏附于基质才能分化。未能黏附的细胞会聚集成团，其存活情况尚不明确。细胞的分化在接种后2–3小时开始，持续约24小时。24小时内，细胞呈现出特定的形态，例如神经元会伸出突起。 1,18-20，肌细胞形成类似所见的指状伸长结构 体内 1 以及导管细胞形成管腔 17形态学特征 体外 与那些非常相似 体内例如， 体外 培养的ALM和PLM触觉神经元（通过表达鉴定） Pmec-4::gfp) 仅发育出两条神经突，其中一条长于另一条，与正常情况相同 体内 1,20 (

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讨论

C. elegans 是解析发育、行为和衰老过程中相关遗传通路的强有力模式生物。其便利性主要源于易于进行遗传操作以及具有较短的生命周期。尽管如此，C. elegans 也存在一定的局限性。C. elegans 的细胞体积微小，且被包裹在具有压力的角质层内，这限制了需要直接接触细胞的技术的应用，例如电生理学和药理学技术，或特定细胞类型的分离，如通过微阵列分析获取基因表达谱。C. elegans 的细胞培养方法为克服该模式生物的诸多局限性提供了解决方案。

在本文中，我们描述了一种改进的分离和培养胚胎的方法 C. elegans 基于Christensen及其同事早期工作的大规模细胞培养 1我们还报告了使用多种技术（包括免疫细胞化学、电生理学和钙成像）所获得的已发表的代表性结果，这些技术增进了我们对细胞功能背后生理过程及遗传需求的理解 秀丽隐杆线虫. 目前在培养细胞中已完成的工作 秀丽隐杆线虫 细胞支持它们的分化 体外 正如...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco 琼脂颗粒VWR International Inc.90000-784
Bacto 胰蛋白胨VWR International Inc.90000-284
酵母提取物VWR International Inc.90000-724
Leibovitz L-15 培养基（1×）液体Invitrogen11415-064
胎牛血清Invitrogen16140-063
青霉素-链霉素SigmaP4333-100ML
来自灰色链霉菌的几丁质酶SigmaC6137-25UN
NA22 大肠杆菌秀丽隐杆线虫 遗传学中心
花生凝集素SigmaL0881-10MG
蔗糖Sigma57903-1KG
D-(+)-葡萄糖Sigma67528-1KG
乙二醇双(2-氨基–四乙酸（EGTA）SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
胆固醇
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO₄4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
乙醇
高压灭菌蒸馏 H2O
漂白剂
<强>仪器设备
101-1000 μ蓝色刻度移液器吸头USA Scentific1111-2821
10 ml 无菌吸管，单独包装USA Scentific1071-0810
人体工学可调体积（100-1000 μl) 带吸头弹出装置的移液器VWR International Inc.89079-974
便携式移液器辅助器，DrummondVWR International Inc.53498-103
无菌移液管VWR International Inc.14670-114
15 ml 离心管 USA Scentific1475-1611
50 ml 离心管USA Scentific1500-1811
无菌18号针头Becton, Dickinson and Co.305196
无菌 10 ml 注射器Becton, Dickinson and Co.305482
康宁塑料注射器滤器 0.20 μm 孔径大小 康宁431224
Acrodic 25 mm 注射器滤器 w/5 μm versapor 膜VWR International Inc.28144-095
60x15 mm 无菌培养皿VWR International Inc.82050-548
100x15 mm 无菌培养皿VWR International Inc.82050-912
12 mm 直径玻璃盖玻片VWR International Inc.48300-560
24孔平底带盖透明细胞培养板 托马斯科学6902A09
Dumont #5 细镊子 Fine Science Tools11254-20
离心机 5702Eppendorf022629883
层流罩
配备10倍物镜的倒置显微镜
环境空气加湿培养箱

参考文献

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