我们在此介绍一种用于大规模培养胚胎的改进方案 秀丽隐杆线虫 细胞。胚胎 秀丽隐杆线虫 培养的细胞 体外 使用该方法，似乎能够以细胞特异性的方式分化并重现基因的表达。可对其他组织中特定细胞类型进行直接访问或分离的技术可应用于 秀丽隐杆线虫 培养的细胞
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摘要
摘要
秀丽隐杆线虫 是一个功能强大的模式系统，遗传学和分子生物学技术可轻松应用于该系统。然而直到最近，那些需要直接接触细胞并分离特定细胞类型的技术还无法在该系统中应用 秀丽隐杆线虫这一限制的原因在于组织被封闭在加压的角质层内，而角质层难以通过酶和/或去污剂处理有效消化。该结论基于Laird Bloom、Christensen及其同事的早期开创性工作。 1 建立了一种稳定的细胞培养方法 秀丽隐杆线虫 大规模培养胚胎细胞。通过漂白剂/氢氧化钠处理从产卵成虫中分离卵，随后用几丁质酶处理以去除卵壳。然后通过手动吹打使胚胎细胞解离，并接种至含血清的培养基中、铺于包被基质的玻璃表面。分离后24小时内，细胞开始分化，表现为形态改变及表达特定细胞标志物。 秀丽隐杆线虫 采用该方法培养的细胞可存活长达2周 体外 并已用于电生理学、免疫化学和成像分析，同时也经过分选用于微阵列表达谱分析。
引言
秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种用于研究细胞功能、分化和行为分子基础的强有力模式生物。尽管其基因组、代谢途径和生物合成途径与脊椎动物相似，但其遗传和分子操作的便利性远高于脊椎动物 2其优势包括体型小、解剖结构简单、生命周期短（在25 °C条件下为3天）、寿命短（2周）以及后代数量多（>200）。由于其雌雄同体的特性和较短的生命周期，对其进行分子和遗传操作较为简便 秀丽隐杆线虫，包括转基因动物的制备 3,4 以及基因敲低技术的应用，例如RNA干扰 5. 秀丽隐杆线虫 身体和卵壳是透明的，因此可以使用标准显微镜轻松观察成体和胚胎中的细胞。在过去40年中， 秀丽隐杆线虫 社区已创建了宝贵的资源 秀丽隐杆线虫 包括大量突变体、基因敲除和转基因品系的研究，以及对解剖结构和发育过程的详细描述 6,7，包括 nervous system 的完整重建 8，以及一个基因组已完全测序、注释完善并可向整个科研社区公开获取的基因组（www.wormbase.com).
尽管具有诸多优势，某些实验方法在实施过程中仍面临挑战 秀丽隐杆线虫这些包括需要接触细胞质膜以....
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方案
星号（*）表示与 Christensen et al.1 相比新增或修改的步骤
1. 材料准备
- 细胞培养过程需要从怀卵成虫中分离出大量卵。培养 C. elegans 在接种了NA22的8P琼脂平板上（NA22可通过 秀丽隐杆线虫 基因组联盟 - CGC）细菌以大量分离卵。这些培养基中所用的蛋白胨量是NGM平板常规用量的8倍。较高的蛋白胨浓度能更有效地维持NA22细菌的生长，而与OP50不同，NA22细菌会形成较厚的菌层。
8P 培养基配方：
将3 g NaCl、20 g Bacto-Peptone、25 g琼脂溶解于1 L无菌蒸馏水中，121 °C高压灭菌30 min。待培养基冷却至55 °C后，加入经无菌滤膜过滤的1 ml胆固醇溶液（5 mg/ml，溶于乙醇）、1 ml 1 MgCl2、1 ml MgSO4和25 ml KP缓冲液（储备液500 ml：5 g K2HPO4，30 g KH2PO4，pH 6.00）。将液体琼脂培养基倒入10 cm培养皿中（每皿25 ml）。
- 次日，用....
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结果
C. elegans 培养的细胞发生分化并表达细胞特异性标志物
Christensen 及其同事通过台盼蓝染色证明了 >99%的胚胎 秀丽隐杆线虫 细胞在分离过程中存活。铺板后第9天和第22天，存活率分别为85%和65%。 1分离的胚胎 秀丽隐杆线虫 细胞必须黏附于基质才能分化。未能黏附的细胞会聚集成团，其存活情况尚不明确。细胞的分化在接种后2–3小时开始，持续约24小时。24小时内，细胞呈现出特定的形态，例如神经元会伸出突起。 1,18-20，肌细胞形成类似所见的指状伸长结构 体内 1 以及导管细胞形成管腔 17形态学特征 体外 与那些非常相似 体内例如， 体外 培养的ALM和PLM触觉神经元（通过表达鉴定） Pmec-4::gfp) 仅发育出两条神经突，其中一条长于另一条，与正常情况相同 体内 1,20 (
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讨论
C. elegans 是解析发育、行为和衰老过程中相关遗传通路的强有力模式生物。其便利性主要源于易于进行遗传操作以及具有较短的生命周期。尽管如此，C. elegans 也存在一定的局限性。C. elegans 的细胞体积微小，且被包裹在具有压力的角质层内，这限制了需要直接接触细胞的技术的应用，例如电生理学和药理学技术，或特定细胞类型的分离，如通过微阵列分析获取基因表达谱。C. elegans 的细胞培养方法为克服该模式生物的诸多局限性提供了解决方案。
在本文中，我们描述了一种改进的分离和培养胚胎的方法 C. elegans 基于Christensen及其同事早期工作的大规模细胞培养 1我们还报告了使用多种技术（包括免疫细胞化学、电生理学和钙成像）所获得的已发表的代表性结果，这些技术增进了我们对细胞功能背后生理过程及遗传需求的理解 秀丽隐杆线虫. 目前在培养细胞中已完成的工作 秀丽隐杆线虫 细胞支持它们的分化 体外 正如.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco 琼脂颗粒 | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto 胰蛋白胨 | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| 酵母提取物 | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz L-15 培养基（1×）液体 | Invitrogen | 11415-064 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 16140-063 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333-100ML | |
| 来自灰色链霉菌的几丁质酶 | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 大肠杆菌 | 秀丽隐杆线虫 遗传学中心 | ||
| 花生凝集素 | Sigma | L0881-10MG | |
| 蔗糖 | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | 67528-1KG | |
| 乙二醇双(2-氨基–四乙酸（EGTA） | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| 胆固醇 | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO₄4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| 乙醇 | |||
| 高压灭菌蒸馏 H2O | |||
| 漂白剂 | |||
| <强>仪器设备 | |||
| 101-1000 μ蓝色刻度移液器吸头 | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml 无菌吸管，单独包装 | USA Scentific | 1071-0810 | |
| 人体工学可调体积（100-1000 μl) 带吸头弹出装置的移液器 | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| 便携式移液器辅助器，Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| 无菌移液管 | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml 离心管 | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml 离心管 | USA Scentific | 1500-1811 | |
| 无菌18号针头 | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| 无菌 10 ml 注射器 | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| 康宁塑料注射器滤器 0.20 μm 孔径大小 | 康宁 | 431224 | |
| Acrodic 25 mm 注射器滤器 w/5 μm versapor 膜 | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm 无菌培养皿 | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm 无菌培养皿 | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm 直径玻璃盖玻片 | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| 24孔平底带盖透明细胞培养板 | 托马斯科学 | 6902A09 | |
| Dumont #5 细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 离心机 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| 层流罩 | |||
| 配备10倍物镜的倒置显微镜 | |||
| 环境空气加湿培养箱 |
参考文献
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.
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重印与许可
