胫神经横断——小鼠去神经诱导骨骼肌萎缩的标准模型

摘要

胫神经横断模型是一种耐受性良好、经过验证且可重复的骨骼肌萎缩模型。该模型的手术方案在C57Black6小鼠中进行了描述和演示。 

摘要

胫神经横断模型是一种耐受性良好、经过验证且可重复的啮齿类动物去神经性骨骼肌萎缩模型。尽管该模型最初因大鼠体型较大而开发并广泛应用于大鼠，但小鼠的胫神经也足够粗大，可方便地进行压迫或横断操作，同时保留坐骨神经的腓总神经和腓肠神经分支，从而保护其支配的靶肌肉。因此，该模型相比坐骨神经横断模型具有更低的发病率和对行走功能的干扰更小，并且允许研究者在基因工程小鼠中研究调控肌肉萎缩过程的生理、细胞及分子生物学机制。胫神经支配腓肠肌、比目鱼肌和跖肌，因此其横断可实现对主要由快缩II型肌纤维和/或慢缩I型肌纤维组成的去神经骨骼肌的研究。本文以C57Black6小鼠为例，演示胫神经横断模型的建立。我们通过测量去神经后1、2和4周石蜡包埋组织切片中快缩型肌球蛋白免疫组化染色的肌肉重量及特定肌纤维类型的横截面积，评估腓肠肌（作为代表性肌肉）的萎缩程度。

引言

由于创伤性周围神经损伤、疾病或药物干预导致的骨骼肌失神经支配，会立即造成肌肉自主收缩功能的丧失。肌肉同时开始发生萎缩，若能及时获得高质量的再神经支配，这种萎缩是可逆的^1,2在缺乏再神经支配的情况下，肌纤维萎缩会持续进展，并导致肌肉发生不可逆的生物学改变，包括肌肉纤维化和肌纤维死亡。本文展示了小鼠胫神经横断模型，该模型可模拟去神经支配诱导的骨骼肌萎缩与纤维化。此模型可帮助科研人员研究肌肉萎缩背后的生理学、细胞学及分子生物学机制 体内 在腓肠肌和比目鱼肌中。尽管该模型传统上主要应用于大鼠，但近年来其在基因敲除和转基因小鼠品系中的应用日益增多，使研究人员能够评估特定目标蛋白在肌肉萎缩和纤维化的诱导、发展与维持过程中，或其消退过程中的作用。 体内.

胫神经是啮齿类动物后肢中一条混合性的运动-感觉外周神经，为坐骨神经的三个终末分支之一。切断胫神经可使腓肠肌、比目鱼肌和跖肌（以及包括胫骨后肌、趾长屈肌和拇长屈肌在内的三个小腿深层小屈肌）失神经支配，该模型在大鼠中已得到良好标准化和验证^3,4。在胫神经切断后的不同时间点，可依次解剖获取腓肠肌和比目鱼肌，进行固定并处理以评估肌肉组织学和肌纤维形态计量学指标，或进行速冻以提取肌肉RNA和蛋白质，用于研究例如调控肌肉萎缩的细胞信号通路网络。腓肠肌为混合肌纤维类型肌肉（包含I型和II型纤维，但以II型为主），而比目鱼肌主要由大量I型纤维构成，因此该模型可同时提供快肌和慢肌用于分析评估^5,6。胫神经切断模型适用于研究失神经所诱导的肌肉萎缩过程，既可用于短期（数天）⁷，也可用于长期（数周至数月）的研究^4,8。

与坐骨神经横断模型（啮齿类动物中常用的另一种去神经性肌肉萎缩模型）相比，胫神经横断模型在动物体内引起的病态较轻，因此更具吸引力。坐骨神经横断会导致腿部（膝关节以下）和足部的所有肌肉去神经支配，损害动物的行走能力²，而胫神经横断则保留了坐骨神经的腓总神经和腓肠神经分支，从而保护了这些分支所支配的靶肌肉和感觉区域。小鼠虽无法完成足底屈曲或足内翻动作，但能够轻松行走，且体重可均匀分布于两侧后肢，从而显著降低了该模型的病态程度。已有步态分析研究对大鼠在胫神经和坐骨神经损伤后的行走模式进行了评估，结果表明，胫神经损伤后足印迹和负重功能的保留情况更佳^9,10。此外，在胫神经横断模型中，若研究设计需要，可在后期游离腓总神经并将其转移，作为延迟再神经支配的来源³。相比之下，在坐骨神经横断模型中实现延迟再神经支配则必须使用神经移植物修复坐骨神经缺损，这极大地增加了手术的技术难度，限制了该模型的应用，仅适用于技术熟练的外科医生。

尽管胫神经横断模型要求操作者熟悉动物手术中的无菌操作技术，但胫神经及其支配的小腿肌肉易于接触和辨认，因此即使非外科医师或动物手术经验较少的研究人员也能较快掌握该模型。

方案

在使用此模型之前，研究人员必须获得所在机构动物使用管理机构对手术方案的批准。该模型已通过哈密尔顿健康科学公司麦克马斯特大学研究伦理委员会（AUP # 10-04-24）的批准，并严格遵循加拿大动物护理委员会的建议执行。

1. 小鼠准备

1. 称量小鼠体重。使用5%异氟烷或2%氟烷诱导麻醉。所使用的回路应确保充分回收麻醉气体，以保护手术人员。  2-3 分钟后，动物的呼吸将变慢。确保角膜反射消失，并捏压  通过检查足部趾间区域以确认手术麻醉效果（即 小鼠无反应）。在眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止手术期间角膜干燥。
2. 剃除从坐骨切迹至膝关节的外侧大腿和臀部毛发，并用聚维碘酮消毒。剃除毛发可保持切口部位无毛，以充分暴露手术视野，并尽量减少对坐骨神经分离和横断操作的干扰。通过触诊可确定位于股骨上方及后方的坐骨切迹。

2. 手术操作步骤

1. 将吸入性异氟烷浓度降低至2%（氟烷为1%），并将小鼠侧卧放置（手术侧朝上），置于手术显微镜或解剖显微镜下。也可使用手术放大镜进行操作，因为3.5倍放大倍率对于成年（20–25 g）小鼠已足够满意。
2. 戴上无菌手套。通过触诊确定坐骨切迹。使用手术刀从坐骨切迹至膝关节处沿外侧大腿切开皮肤（约1 cm）。
3. 轻柔地分开皮肤。辨认股二头肌，即位于外侧大腿皮下紧贴皮肤的扁平浅层肌肉。使用精细剪刀沿肌纤维方向切开股二头肌，并用弹簧牵开器将其撑开，以暴露坐骨神经及其分支。
4. 在股二头肌深面辨认坐骨神经。该神经呈特征性的亮白色，直径约为0.8 mm，从坐骨切迹走行至膝关节，在腘窝水平分为胫神经、腓总神经和腓肠神经。
5. 使用超细镊子和弹簧显微解剖剪，轻柔分离胫神经与腓总神经及腓肠神经分支。胫神经是最粗大的分支，通常位于中央位置。在分离分支时，切勿压迫神经。仅用超细镊子夹持神经的外膜层，并保持神经处于松弛状态（非紧绷），可避免神经受压和牵拉损伤。
6. 如需实现完全且持久的去神经支配，应尽可能远端地使用显微解剖剪切断胫神经，注意小心避开腘血管。若需实现暂时性去神经支配（预计2–4周内完全再神经支配），则可用超细镊子夹压胫神经15秒，而不进行横断。（外周神经在损伤后可再生，并重新支配靶肌肉。）
7. 如需完全去神经支配，应用10-0尼龙线将横断的胫神经残端缝合固定于股二头肌前表面，并用5-0 Vicryl线缝合关闭股二头肌，以防止腓肠肌和比目鱼肌发生异常再神经支配。
8. 使用连续缝合法以5-0 Vicryl线缝合皮肤。

3. 术后护理

1. 关闭吸入性麻醉剂，但维持氧气流动。皮下注射布托啡诺（或替代药物）镇痛剂。
2. 在小鼠从麻醉中苏醒时，将其转移至无垫料的清洁笼具中。将小鼠置于笼内的加热毯上，并在直视下持续观察，直至其能够自主活动。
3. 转移后饲养于软底笼具（非金属网底）中，并提供充足的柔软垫料。
4. 每日检查手术肢体，观察手术伤口情况以及足部是否出现压疮性足跟溃疡或啃咬迹象。轻微问题可使用局部抗生素或消毒剂（如聚维酮碘）处理。需要实施安乐死的终点指标包括体重减轻、自我护理能力差（毛发竖立凌乱）以及蜷缩姿势。此外，若动物出现严重伤口裂开，或使用局部抗生素治疗1-2周后溃疡仍未愈合，或表现出疼痛症状，应予以安乐死。

4. 去神经支配的腓肠肌和比目鱼肌收获

1. 在预定的术后时间点，称量小鼠体重，并通过过量 CO₂ 处死小鼠。
2. 剃除手术侧及对侧对照腿内侧的毛发，并用酒精清洁。将小鼠置于手术显微镜或解剖显微镜下，或 alternatively 使用外科放大镜进行放大观察。
3. 在手术侧肢体，使用手术刀从踝关节至膝关节沿小腿内侧切开皮肤，并在踝关节周围环形切开。用镊子轻轻将皮肤从肌肉上剥离并向大腿近端方向牵拉，从而暴露腿部所有肌肉。辨认腓肠肌，该肌肉位于腿部后侧，从膝关节延伸至踝关节，紧贴皮肤下方。辨认股二头肌的远端止点，其位于膝关节内侧、腓肠肌近端处。在远端止点处，股二头肌呈薄而透明的膜状结构，覆盖于腓肠肌最近端部分。使用剪刀和钝性分离技术，轻轻将股二头肌远端止点与腓肠肌分离。
4. 腓肠肌在远端止于跟骨处逐渐变细形成跟腱。辨认呈白色、坚韧状的跟腱。用镊子夹持跟腱，注意避免夹持或压损腓肠肌，然后使用剪刀将跟腱从跟骨止点处切断。
5. 继续保持对跟腱的夹持，从远端止点向膝关节起点方向，轻轻将腓肠肌（浅红色）从深层的比目鱼肌（深红色）上抬起（比目鱼肌可单独取材）。
6. 使用剪刀切断腓肠肌在股骨内、外侧髁的起点，从而将腓肠肌从腿部完全游离。对肌肉施加极轻柔的牵引有助于此过程。注意避免压损肌肉组织。
7. 此时比目鱼肌将清晰可见，位于原腓肠肌下方。从其在跟腱上的止点向其在小腿后侧的起点方向抬起比目鱼肌。若比目鱼肌在取材时被无意带起，应将其从所获标本中轻轻分离。由于颜色差异，所获标本中的腓肠肌（浅红色）和比目鱼肌（深红色）仍可轻易区分。
8. 使用精密天平分别称量肌肉重量。
9. 将肌肉纵向均分，一半用于液氮速冻（以备后续蛋白质和/或RNA提取），另一半根据需要用于组织学分析（i.e. 形态计量评估、免疫组织化学），可选择固定于10%福尔马林中，或采用液氮冷却的异戊烷进行冷冻固定。
10. 在对照侧（未手术侧）重复上述第4.3步操作，以获取对照侧的腓肠肌和比目鱼肌。

结果

胫神经横断会导致小腿的腓肠肌、比目鱼肌和跖肌失神经支配。本研究以腓肠肌作为代表性肌肉，评估其萎缩的发展情况。实验采集了失神经支配1周、2周或4周的2-3月龄C57Black 6小鼠（Jackson Laboratories）的腓肠肌。随着时间推移，肌肉重量逐渐减少（图1），II型快缩肌纤维的横截面积也相应减小（图2）。腓肠肌属于混合纤维类型肌肉（包含I型和II型纤维），但失神经支配会诱导肌纤维类型由I型向II型转变¹¹，因此可用于测量和进行可靠统计分析的I型纤维数量可能不足。

讨论

胫神经横断诱导去神经性骨骼肌萎缩模型是一种在大鼠中常用且经过充分验证的模型。我们已将该模型改进并应用于小鼠，使研究者能够利用基因工程小鼠来研究肌肉萎缩的过程 在体 在缺乏调控肌肉质量关键蛋白质的情况下^7,8腓肠肌和比目鱼肌在此模型中均被去神经支配，可快速、简便地解剖，且操作最少，从而为后续分子分析提供高质量的 mRNA 和蛋白质。同样，由于肌肉体积较大，可将其分割，从而从同一只动物获取用于组织学和形态计量学分析的组织样本。若需进行后肢功能评估，可连续进行步态足迹分析。将小鼠足部浸入墨汁，使其穿过底部铺有纸张的通道。通过可靠测量和评分足迹特征，可反映神经肌肉功能障碍及步态异常的程度，因为足迹特征可体现功能肌群的状态。^13,14. 虽然最初在大鼠中开发并经过验证¹³，也可在小鼠中进行行走轨迹分析¹⁵.

胫神经横断术通常被小鼠耐受得非常好。术后仅需给予一次镇痛药物。只要采用正确的无菌技术，软组织感染极为罕见。尽管胫神经横断确实会引起足底感觉异常性感觉异常，但根据我们的经验，C57bl...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂与材料
10-0 尼龙缝线	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl 缝线	Ethicon	J553G
设备
弹簧式显微解剖剪	Fine Surgical Tools	15021-15
超细镊子	Fine Surgical Tools	11370-40
无锁微持针器（驱动器）	Fine Surgical Tools	12076-12
弹簧牵开器	Fine Surgical Tools	17000-02