通过玻璃体下注射透明质酸钠建立啮齿类动物视网膜脱离模型

摘要

建立具有可重复且持续性隆起高度、且不伴有视网膜下出血的实验性视网膜脱离模型，对于研究视网膜疾病中光感受器细胞丢失的病理生理机制以及评估潜在治疗干预措施具有重要意义。本文详细报道了这一方法。

摘要

玻璃酸钠视网膜下注射是一种广泛接受的诱导视网膜脱离（RD）的方法。然而，视网膜脱离的高度和持续时间，或视网膜下出血的发生，可能影响脱离视网膜中光感受器细胞的死亡。因此，建立不伴有视网膜下出血且可重复的视网膜脱离模型，有利于评估光感受器细胞死亡。我们改进了一种既往报道的方法，可在可重复的部位产生大泡性且持久的视网膜脱离，同时极少发生视网膜下出血。该改良方法的关键步骤是制作自封闭的巩膜切口，从而防止玻璃酸钠注入视网膜下腔后发生渗漏。为制作自封闭的巩膜切口，需先建立巩膜隧道，然后使用30 G针头穿透巩膜进入脉络膜。尽管此步骤中可能发生脉络膜出血，但使用手术矛头进行压迫可降低脉络膜出血的发生率。该方法可为涉及视网膜脱离的疾病（如裂孔源性视网膜脱离、早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、中心性浆液性脉络膜视网膜病变以及年龄相关性黄斑变性（AMD））中的光感受器细胞死亡提供更可重复且可靠的模型。

引言

当感光细胞与下方的视网膜色素上皮层分离时，会导致感光细胞死亡并随之出现视力下降。这种感光细胞的物理性分离可见于多种视网膜疾病，包括年龄相关性黄斑变性（AMD）、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变，以及裂孔源性（即 由视网膜破裂引起）的视网膜脱离（RD）。通过向视网膜下腔注射透明质酸钠是一种被广泛接受的建立RD模型的方法，可诱导感光细胞死亡，从而有助于深入了解感光细胞变性的病理生理机制^1-15。

由2001年首次提出的玻璃体下注射透明质酸钠诱导的感光细胞变性模型⁷，具有较为合理的病程时间（数天至数周）。然而，由于影响视网膜脱离（RD）后感光细胞死亡的两个主要因素，该方法在不同动物之间可能导致感光细胞丢失程度存在显著差异：1）RD的高度和持续时间；2）玻璃体下出血的发生。该技术本身存在较高的学习难度，而这两种因素均受操作技术熟练程度的影响。随着RD高度的增加，视网膜色素上皮（RPE）层与感光细胞之间的距离增大，感光细胞变性也随之加重^16-17。与这些报道一致，我们先前的实验结果显示，隆起性RD中的感光细胞死亡程度高于浅层RD。此外，已有研究报道玻璃体下出血对感光细胞具有毒性作用，并影响感光细胞的死亡过程^18-21。同样，我们在伴有玻璃体下出血的RD中观察到的感光细胞死亡也多于无玻璃体下出血的RD。因此，为减少实验变异性，相关技术应着重于实现稳定可控的RD高度，同时避免发生玻璃体下出血。

我们改进的诱导视网膜脱离（RD）的方法可在眼球的相同位置产生可重复、水疱样且持久的视网膜脱离，且较少发生视网膜下出血。我们采用颞侧入路进行手术，因为与其他部位相比，该入路更易于获得较宽的手术视野。在结膜切开后，使用30 G针头制作自闭合的巩膜切口。随后建立巩膜隧道，并穿透巩膜进入脉络膜。如果此步骤中发生脉络膜出血，血液将通过巩膜伤口流出眼外，此时可通过手术尖头器械压迫止血。接着从角膜处进行前房穿刺，以降低眼内压。这一步骤至关重要，因为仅进行视网膜下注射会导致眼内压升高，进而引起视网膜动脉阻塞及视网膜内层缺血。随后将连接至Hamilton 10 μl注射器的33 G针头插入视网膜下腔，缓慢注入3.5 μl透明质酸钠，使神经感觉层视网膜与下方的视网膜色素上皮（RPE）分离。与在眼底观察下进行的其他诱导RD方法不同，本技术是在直视下操作。由于巩膜切口具有自闭合特性，注射后透明质酸钠不会外漏。最后，在巩膜切口处涂抹粘合剂，并将结膜复位至原始位置。这些最后的操作步骤也有助于降低透明质酸钠泄漏的风险。注射3.5 μl透明质酸钠可在8周龄小鼠眼中产生可重复的视网膜脱离（范围达视网膜面积的50%）。在我们改进的手术流程中，制作自闭合巩膜切口是最关键的步骤，因为它可防止注射的透明质酸钠从眼内泄漏，从而实现可重复、水疱样且持久的视网膜脱离。

方案

所有动物实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用研究协会声明以及马萨诸塞州眼耳医院动物护理委员会制定的指南和规定进行。

1. 预处理

1. 通过腹腔注射 60 mg/kg 氯胺酮和 6 mg/kg 赛拉嗪的混合物，麻醉一只 8 周龄的小鼠。
2. 剪除胡须。因为胡须会妨碍视野观察和器械放置。
3. 使用 5% 去氧肾上腺素和 0.5% 托吡卡胺散瞳。
4. 剪除眼睫毛。因为眼睫毛同样会妨碍视野观察和器械放置。
5. 应用局部麻醉药（0.5% 盐酸丙帕他卡因滴眼液）。

2. 显微镜下的手术操作

1. 将小鼠置于侧卧位，鼻部朝向术者。通过夹捏脚趾确认麻醉效果，并在开始手术前戴上无菌手套。
2. 在角膜缘后部切开结膜，并将结膜与巩膜分离，注意避免穿透巩膜。此步骤完成后，用镊子夹住角膜缘处的结膜以固定眼球。
3. 使用30 G针头的尖端（斜面朝上）制作自闭合的巩膜切口，经巩膜形成隧道并穿透至脉络膜（图1），注意避免穿透视网膜。若发生脉络膜出血并自巩膜伤口溢出，应用手术尖头棉签压迫止血直至出血停止。该巩膜伤口将依靠眼内压实现自闭合。
4. 用30 G针头穿刺角膜以降低眼内压。进针时保持针头与虹膜平行，避免进入前房时损伤虹膜和晶状体。眼内压将促使伤口自行闭合。
5. 将连接Hamilton 10 μl注射器的33 G针头（斜面朝下，即朝向眼内）插入视网膜下腔，缓慢注入3.5 μl透明质酸钠，使神经感觉层视网膜与下方的视网膜色素上皮（RPE）分离。注意避免用33 G针头穿透视网膜，否则透明质酸钠将进入玻璃体腔而非视网膜下腔。同时避免快速注射，以防造成视网膜裂孔，导致透明质酸钠泄漏至前房。
6. 用镊子按压角膜穿刺口周围区域，使房水自角膜穿刺口流出，以调节眼内压。
7. 使用手术尖头棉签确认巩膜切口无渗漏。
8. 为降低透明质酸钠泄漏的风险，可在巩膜切口处涂抹氰基丙烯酸酯外科粘合剂。
9. 使用氰基丙烯酸酯外科粘合剂将结膜复位于原始位置，进一步降低透明质酸钠泄漏的风险。
10. 使用盖玻片检查眼底，确认成功形成水泡样视网膜脱离（RD），且无视网膜下出血。

3. 治疗后

1. 在眼部涂抹杆菌肽抗生素软膏，以降低感染风险。
2. 将小鼠置于加热垫上，防止麻醉剂（氯胺酮和赛拉嗪的混合物）因引起低血压而导致体温过低。
3. 待小鼠从麻醉状态苏醒后，将其放回动物饲养笼。每日监测小鼠是否出现并发症。若出现任何并发症，按以下所述实施安乐死。

4. 处死

1. 在腹腔注射 100 mg/kg 戊巴比妥钠后，通过颈椎脱位处死小鼠，并在每项实验的适当时间点摘除眼球（未示出）。摘除眼球时应避免对眼球施加压力，以防透明质酸钠泄漏。隆起性视网膜脱离（Bullous RDs）应持续至少 14 天。

结果

为了评估本方案所诱导的视网膜脱离（RD）的持续性，在诱导 RD 后第 3、7 和 14 天制备了冷冻切片。每个时间点使用六只眼睛。采用苏木精和伊红（HE）染色法对切片进行观察。所有切片均显示出现接近晶状体的水泡样视网膜脱离（图 2）。一只眼睛在第 7 天出现视网膜下出血。未发现任何眼睛存在感染或晶状体损伤的迹象。

图1. 创建自闭合巩膜切口。 本示意图显示了正常小鼠眼球的横截面图像。红线表示自闭合巩膜切口。使用30 G针头先在巩膜上制作隧道，再穿透巩膜进入脉络膜，从而形成自闭合巩膜切口。该巩膜伤口将在眼内压作用下自行闭合，可防止注射透明质酸钠至视网膜下腔后发生渗漏，并实现持续性水泡样视网膜脱离。

图2. 视网膜脱离的时间进程。 该眼底照片显示术后即刻无脉络膜下出血的水泡样视网膜脱离。苏木精-伊红（HE）染色的冰冻切片显示，至少至第14天仍持续存在无脉络膜下出血的水泡样视网膜脱离。

讨论

已有多种在啮齿类动物眼睛中建立视网膜脱离（RD）模型的方法被报道^{3-15, 22}。其中大多数方法采用透明质酸钠进行视网膜下注射，因为透明质酸钠是一种在人类眼内手术中常用的黏性物质，且未发现具有任何已知的眼部毒性^1-15。与生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）相比，使用透明质酸钠可延长视网膜脱离的持续时间。

透明质酸钠的视网膜下注射方法有两种：经玻璃体途径^3-6 或经巩膜途径^7-15。两种方法均在观察眼底的情况下进行。在经玻璃体途径中，将视网膜下注射针导入玻璃体腔，在周边视网膜上制造视网膜切开，随后将透明质酸钠注入视网膜下腔。该方法需制造两处视网膜裂孔，从而增加了视网膜出血进入视网膜下腔的风险。此外，在制造视网膜切开时还存在晶状体损伤的风险。经巩膜途径有多种改良方法。在大多数此类方法中^7-12，首先通过前房穿刺降低眼内压，然后将连接装有透明质酸钠注射器的30 G针头直接穿过结膜、巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮（RPE）进入视网膜下腔，并将透明质酸钠注入视网膜下腔。采用这种经巩膜方法发生视网膜裂孔和晶状体损伤的风险低于经玻璃体途径。然而，30 G针头在巩膜上造成的穿刺孔较大，尤其是对小鼠眼球而言，注入视网膜下腔的透明质酸钠容易经巩膜伤口渗出眼外。这会导致视网膜脱离（RD）程度较低、持续时间较短，且光感受器细胞死亡程度更具变异性。此外，若在巩膜穿通步骤中发生脉络膜出血，由于在视网膜下注射透明质酸钠之前眼内压已被降低，出血将扩散至视网膜下腔。

多种因素可能影响视网膜脱离（RD）对脱离视网膜的作用，包括视网膜下出血以及RD的高度和持续时间^16-21。随着RD高度的增加，感光细胞死亡也随之增加^{16, 17}；与浅层RD相比，较高的RD会阻碍脉络膜毛细血管向感光细胞扩散氧气和必需营养物质，从而可能导致更广泛的感光细胞损伤。视网膜下出血对感光细胞也具有毒性作用^18-21；其在脱离视网膜中可能的毒性机制包括：视网膜下出血作为扩散屏障所导致的缺氧和代谢紊乱，以及血液成分（如铁）引起的直接神经毒性。晶状体损伤虽有研究报道其对视网膜神经节细胞具有保护作用²³，但也可能影响RD诱导后的感光细胞死亡。此外，若穿刺入口未封闭，在眼球摘除过程中进行眼部操作时透明质酸钠可能渗漏。这可能导致将实际的RD错误分类为浅层脱离，进而影响实验结果的解读。

我们改进了经巩膜法进行透明质酸钠的视网膜下注射，以提高视网膜脱离（RD）模型的可重复性，并降低视网膜下出血的发生率。本方案的关键步骤是使用30 G针头制作自闭合的巩膜切口，以防止注射后透明质酸钠泄漏。与以往方法不同，本方案无需观察眼底，因此更需关注巩膜切口的处理。使用粘合剂也可防止透明质酸钠从眼球中漏出。根据我们的经验，采用本方案的视网膜下出血发生率明显低于其他方案。若在巩膜切口步骤中发生脉络膜出血，由于此步骤在降低眼内压之前进行，血液将通过巩膜切口流出眼外；而若在降低眼内压及神经感觉层视网膜脱离后发生脉络膜出血，则血液将进入视网膜下间隙。我们发现该情况的发生率约为5%，而其他技术约为10–20%。出现此类情况的动物应从分析中剔除。

该技术还可用于以载体介导的基因转移对光感受器细胞或视网膜色素上皮（RPE）细胞进行视网膜下注射^{24, 25}。由于这些注射常用的载体（PBS、生理盐水）的黏度显著低于透明质酸钠，常规技术常出现较多渗漏。本文所述技术通过降低这一风险，使载体转移实验更具可重复性和可靠性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮注射液	Phoenix	2010025
阿托塞德	LLOYD	4004821
5% 去氧肾上腺素 / 0.5% 托吡卡胺	马萨诸塞眼耳药房
0.5% 盐酸丙帕卡因滴眼液	AKORN	17478-263-12
普维克斯	Alcon	8065183085
韦伯胶	Patterson Veterinary	07-8566128
显微镜	Leica	MG90
30G1/2 精密滑动针头	BD	305106
韦克-塞尔眼科探针	Beaver-Visitec	0008685
10 微升注射器	Hamilton	7635-01
33 号规格，0.5 英寸针头	Hamilton	7803-05
18x18 毫米盖玻片	Fisher Scientific	18-548A