在 C. Elegans 中使用"冷冻裂解"进行抗体染色

摘要

演示了一种称为“冻裂”的方法，该方法可用于暴露线虫 C. elegans 的内部组织，使其与抗体结合，从而进行蛋白质定位。

摘要

为了使用抗体对C. elegans进行染色，必须通过化学或机械方法绕过其相对不易渗透的角质层。“冻裂法”是一种通过物理方式将线虫角质层剥离的方法，其操作包括将线虫夹在两张粘附性载玻片之间，冷冻后将载玻片强行分开。冻裂法无需化学处理即可快速简便地暴露组织，并可与多种固定剂联合使用。然而，该方法会导致大量样本丢失，且施加的压力会机械性地扭曲样本形态。需要经过一定练习才能最大限度地回收形态良好的样本。冻裂法可根据特定的固定条件、样本回收率或降低非特异性染色进行优化，但无法同时兼顾所有参数。对于需要强烈固定条件、并能耐受用于化学通透角质层的化学处理的抗体，优先选择在溶液中直接处理完整线虫的方法。如果抗体需要较温和的固定条件，或最佳固定条件尚不明确，冻裂法则是一种非常有效的快速检测抗体的方法，可提供目标抗原的特异性亚细胞和细胞定位信息。

引言

为了确定蛋白质的细胞和亚细胞定位，科学家传统上会使用特异性识别特定蛋白质的抗体对组织进行标记¹某些模式生物中，例如 秀丽隐杆线虫，抗体染色常被分子遗传学技术所取代，因为后者能更快地获得结果。这些技术包括将含有目的基因启动子与编码区与绿色荧光蛋白基因融合的构建体转化到生物体中。然而，分子技术也存在多种人为假象问题，例如难以确定真正的启动子，以及高拷贝数构建体（通常采用的技术）在表达水平上的改变 秀丽隐杆线虫)^2,3因此，利用抗体进行染色仍是许多研究蛋白质功能的科学家追求的目标 体内.

使用抗体对组织进行染色可能较为困难，因为抗体通常仅能识别特定构象的抗原¹。例如，某些抗体可能仅识别以特定方式固定的变性或完整抗原，而无法识别原位（in situ）的抗原。在线虫中，抗体染色的问题更为突出，原因是线虫的角质层形成了一层相对不透性的屏障，阻碍了抗体进入组织。

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，抗体染色有多种不同的方法（详见我们之前的工作综述⁴）。为了对完整的“线虫”进行染色，研究人员开发了在相对较强的固定剂（甲醛或戊二醛）中进行冷冻和解冻的方法；冷冻-解冻循环有助于使角质层产生裂纹，从而促进固定剂快速渗透⁵。固定后，还需对角质....

方案

注意：多个实验步骤根据实验的具体条件提供了不同的设置和准备选项。在这些情况下，替代步骤以 A、B、C 的形式列出。 等等。 包含替代步骤的方案概述如下 图1.

1. 多聚赖氨酸包被载玻片的制备

根据制备难易程度、相对黏附性以及抗体非特异性结合之间的权衡需求，可选择使用三种不同类型的载玻片。以下步骤1A-1C按黏附性及复杂性递增的顺序，介绍了载玻片制备方法的不同选择。通过这些不同方法制备的载玻片可在同一实验中联合使用。

1A. 无需载玻片制备

市售的多聚赖氨酸包被载玻片具有低黏附性和低背景。

1B. 甲醇-丙酮固定法的最佳载玻片制备

中等黏附性且背景值低。

1. 准备用于浸泡载玻片的多聚赖氨酸溶液：将400 mg高分子量（150,000 - 300,000 D）的聚-L-赖氨酸加入200 ml双蒸水中。加入2 ml 10%叠氮化钠储备液（终浓度0.1%）作为防腐剂。注意：干燥的叠氮化钠具有反应性，所有形态均有毒性。配制10%储备液称量粉末时需佩戴口罩和手套。
2. 用无绒布擦拭单面磨砂玻璃载玻片，去除污渍和颗粒。即使购买的载玻片标有....

结果

当线虫被适当压片、冻裂并轻微固定后，几乎整个线虫均可被抗体染色所覆盖（见图2）。DAPI染色所显示的细胞核位置可指示线虫的哪些部分保持完整。当使用更强的固定剂（如甲醛）时，线虫的形态可能发生扭曲（如图3A-D中肌肉呈现不自然的波浪状外观所示）。另一个常见问题是特定组织的固定不均或试剂渗透不充分。这一点在图3E-H中有所体现：尽管其他染色（包括DNA染色）的存在表明线虫部分身体结构仍然存在（即在冻裂过程中未被完全去除），但肌肉仅在部分区域被染色。通过练习，可以很容易识别出这种部分染色的模式，从而即使单个线虫表现出染色不均，仍可确定染色的整体分布情况。

使用任何固定条件进行冰裂法时常见的问题如最终图示（图4）所示。最常见的问题是由于压缩过程中两张载玻片之间发生相对移动，导致样品扭曲。通过染色组织的形态可以观察到，线虫咽部后方的虫体部分出现扭曲。该图像还显示了背景染色的问题，这是由于抗体与载玻片上包被的多聚赖氨酸发生非特异性结合所致。但.......

讨论

冻裂法是用于C. elegans抗体染色的多种方法之一。该方法提供了一种相对简单的线虫染色途径，但需要特定试剂并经过练习才能获得最佳结果。关键步骤（如图1所示）包括：1）载玻片的制备（见步骤1和 2）线虫的手动压片（见步骤2和3）以及快速固定（见步骤3）。首先，为了最大程度地增强线虫在载玻片上的黏附性，最好使用高分子量（长链聚合物）多聚赖氨酸自行制备载玻片，而不是依赖市售的预处理载玻片。商业载玻片虽涂有多聚赖氨酸以促进细胞黏附，但冻裂法所用载玻片的设计目的是使整条线虫的角质层牢固附着。其次，在冷冻前将线虫正确地夹在两张载玻片之间进行压片的步骤至关重要。此操作需要稳定的手法和反复练习，以掌握适当的加压力度，使单个线虫与两张载玻片充分接触，同时不破坏其形态结构。压力过大或过小均会导致固定过程中线虫丢失增加。此外，需特别小心地将载玻片转移至干冰冷却的表面进行冷冻，且在此过程中必须保持两张载玻片之间的相对位置不变。任何相对移动都可能导致线虫撕裂或扭曲。第三，与所有固定技术一样，冷冻后的线虫必须在解冻前直接投入固定液中。否则，抗原可能发生扩散，从而导致亚细胞定位信息的误判。如果上述所有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚-L-赖氨酸载玻片（ESCO 品牌）	Fisher	12-545-78	Sigma 品牌载玻片同样适用
多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P1524	重要提示： 多聚赖氨酸的品牌和高分子量至关重要
单侧磨砂载玻片	Fisher	48312-002	其他品牌亦适用
叠氮化钠	Sigma	S2002-25G	有毒，称量粉末配制 10% 储存液时需佩戴手套和口罩。移液储存液时也需戴手套
考普林染色缸	VWR	47751-792	其他品牌亦适用
5 片装载玻片邮寄盒	Electron Microscopy Science	71549-01	多种小型载玻片架品牌之一，适用于染色操作
多聚甲醛	VWR	MK262159	重要提示： 普通福尔马林溶液（37% 甲醛）不适用。可选择：1）将结晶多聚甲醛溶解于磷酸盐缓冲液中，分装后冷冻保存；或 2）购买电子显微镜级多聚甲醛分装品。有毒——操作时需戴手套；多余废液应随水流冲入下水道处理。
戊二醛溶液，25% 水溶液	Sigma	G 5882	重要提示： 应购买电子显微镜级、安瓿封装的戊二醛；有毒——操作时需戴手套；多余废液应随水流冲入下水道处理。
Triton X-100	VWR	EM-9410	其他品牌亦适用
牛血清白蛋白	Fisher	ICN820451	其他品牌亦适用
冻干驴血清	Jackson Immunoresearch	017-000-121	其他品牌亦适用
Cy3 标记驴抗小鼠 IgG 多重标记抗体	Jackson Immunoresearch	715-165-150	推荐该公司提供高质量多重标记（亲和力耗竭）抗体。请根据一抗来源动物选择合适的荧光染料和抗原匹配。
正丙基棓酸酯	Fisher	ICN10274750	其他品牌亦适用
DAPI，4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	Sigma	D 9542	有毒。操作时需戴手套，并分装为小份量后冷冻保存，以减少暴露风险
Whatman #1 滤纸，直径 15 cm	Fisher	09805G
盖玻片 #1 1/2，矩形，24 × 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 厚度在光学性能上最佳
显微镜载玻片保存夹	VWR	48429-092	其他品牌亦适用