斑马鱼先天免疫健康的呼吸爆发反应定量检测

摘要

先天免疫反应可保护生物体免受病原体感染。先天免疫反应的关键组分——吞噬细胞呼吸爆发——能够产生活性氧物质，从而杀灭入侵的微生物。本文介绍一种呼吸爆发检测方法，用于定量测定化学诱导先天免疫反应时所产生的活性氧物质。

摘要

吞噬细胞呼吸爆发是机体对病原体感染先天免疫反应的一部分，涉及活性氧（ROS）的产生。ROS具有毒性，可杀灭被吞噬的微生物。体内定量检测吞噬细胞来源的ROS能够提供有关生物体启动有效先天免疫反应能力的信息。本文介绍一种在化学诱导吞噬细胞呼吸爆发后，对完整斑马鱼胚胎中ROS进行定量和比较的实验方案。该方法利用一种非荧光化合物，该化合物在被ROS氧化后会转变为荧光物质。将单个斑马鱼胚胎移液至微孔板的孔中，并在有或无呼吸爆发化学诱导剂的条件下，与这种荧光原性底物共同孵育。使用微孔板读数仪在预定时间点测定各孔的荧光强度。通过校正以消除背景荧光后，采用非配对t检验进行荧光读数的比较。该方法可用于比较不同发育阶段斑马鱼胚胎的呼吸爆发潜能，以及在实验干预（如蛋白敲低、过表达或药物处理）后的反应变化。该方法也可用于监测成年斑马鱼及其他一些鱼类完整解剖所得肾脏组织或肾源性细胞制备物中的呼吸爆发反应。我们认为，本方案相对简便且具有良好的适应性，可作为现有方法的补充，有助于希望深入理解先天免疫反应的研究人员开展相关研究。

引言

免疫系统由两个分支组成：先天性免疫和适应性免疫。与适应性免疫相比，先天性免疫在进化上更为古老。目前认为无脊椎动物仅具有先天性免疫，而脊椎动物则同时具备先天性和适应性免疫两个分支。适应性免疫可对特定病原体产生特异且持久的免疫反应，而先天性免疫则是对入侵的细菌、病毒和真菌所作出的即时反应。先天性免疫反应的一个关键环节是释放细胞因子和趋化因子，从而引发炎症反应，并募集吞噬细胞（例如 巨噬细胞、中性粒细胞）来吞噬并清除外来病原体。

成功的先天免疫反应包括：（1）识别入侵的微生物；（2）激活相应的信号级联反应（例如 细胞因子和趋化因子的释放）；（3）吞噬细胞的正常发育/足够数量；（4）吞噬细胞向感染部位的迁移；（5）病原体的吞噬；以及（6）被吞噬微生物的清除。上述任一环节的缺陷都可能导致宿主无法抵御感染而死亡。强大的先天免疫反应对生物体的健康至关重要，因为它是所有植物和动物抵抗病原体的第一道防线。在脊椎动物中，它还能增强适应性免疫反应¹。因此，能够全面评估先天免疫反应的各个方面，对于深入理解该反应并优化其功能具有重要意义。

许多模式生物被用于研究先天免疫，范围从拟南芥（Arabidopsis）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、黑腹果蝇（Drosophila）、小鼠到培养的人类细胞。使用斑马鱼（Danio rerio）模型系统研究先天免疫的一个优势在于，斑马鱼是一种具有先天免疫和适应性免疫的脊椎动物，但其先天免疫与适应性免疫在发育时间上是分离的。斑马鱼在受精后约4至6周适应性免疫完全建立之前，完全依赖先天免疫来抵御感染²。除了具备遗传操作工具、光学通透性以及快速的体外发育等优点外，斑马鱼胚胎以先天免疫作为主要防御机制的特点，为在活体（in vivo）条件下研究先天免疫应答的复杂性提供了一个简化的模型系统。

已开发出多种实验方案，用于评估斑马鱼胚胎先天免疫反应的不同方面。微阵列和RNA测序技术已证实，斑马鱼先天免疫反应所诱导的细胞因子谱与人类相似，同时也提示了一些意想不到的基因在先天免疫中的作用^3,4。斑马鱼胚胎具有透明特性，结合荧光标记的病原体和转基因斑马鱼品系，可在活体（in vivo）中实时观察宿主与病原体之间的动态相互作用。通过构建在中性粒细胞特异性myeloperoxidase启动子控制下表达GFP的转基因斑马鱼胚胎^5,6，或在巨噬细胞特异性mpeg1启动子驱动下表达GFP的胚胎⁷，研究人员能够可视化并定量分析吞噬细胞向局部感染部位的迁移过程⁸，同时也能观察吞噬细胞对荧光标记病原体的吞噬与清除过程^8,9。此外，斑马鱼胚胎适用于建立高通量检测方法和化学筛选体系。因此，近年来已相继开发出感染后转录组分析的高通量方法¹⁰，以及检测吞噬细胞向化学诱导损伤部位迁移的高通量技术¹¹。

上述技术中，没有一种能够对吞噬细胞杀灭病原体的最终阶段进行定量评估。该最终阶段涉及呼吸爆发（即活性氧（ROS）及其他有毒化合物的产生），从而杀死被吞噬的病原体。NADPH氧化酶是吞噬细胞中ROS的主要来源。NADPH氧化酶各亚基的组装导致电子转移至氧气，生成超氧阴离子。通过后续的酶促反应，超氧阴离子可进一步转化为过氧化氢和次氯酸（图1A）。正是吞噬细胞的呼吸爆发杀死了病原体，因此对斑马鱼胚胎呼吸爆发潜能的定量检测可反映其整体先天免疫健康状况。我们开发了一种基于荧光的方法，用于定量检测多组个体斑马鱼胚胎中的呼吸爆发¹²。该方法利用一种 commercially available、可穿透细胞膜的非荧光还原型染料。该染料2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）在被氧化后转化为荧光化合物2',7'-二氯荧光素（DCF）。吞噬细胞呼吸爆发过程中产生的多种ROS可氧化H2DCFDA，从而产生荧光信号²⁴。荧光的出现可用于定量并比较不同组别斑马鱼胚胎之间的呼吸爆发反应。蛋白激酶C激动剂佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）被用于化学诱导NADPH氧化酶产生ROS，从而提高荧光读数（图1B）。本文提供了该斑马鱼胚胎呼吸爆发检测方法的改进与优化版本的详细实验方案。该方法可用于随时间动态比较不同组别个体斑马鱼胚胎之间的呼吸爆发水平，或评估其对实验干预（例如通过吗啉寡核苷酸介导的蛋白敲低）的响应。结合其他斑马鱼先天免疫检测方法使用该技术，将有助于更全面地揭示复杂而关键的先天免疫应答过程。

方案

1. 斑马鱼的饲养与维护

1. 饲养：如前所述方法对成年斑马鱼进行大规模产卵¹³。如前所述方法收集产出的胚胎¹⁴。
2. 显微注射（如需要）：如前所述方法，对1-4细胞期的斑马鱼胚胎注射吗啉代寡核苷酸以敲低基因产物，或注射mRNA以过表达基因产物¹⁵。
   1. 需维持足够数量的对照组胚胎（至少需要48条存活的假注射对照鱼和48条存活的实验处理鱼，以填满一块96孔微孔板）。
3. 胚胎培养：将胚胎置于深型培养皿中，在28 °C的卵水中（蒸馏水中加入60 μg/ml Instant Ocean海盐，经高压灭菌）培养至所需发育阶段（使用本方案无法在受精后2天以内的斑马鱼胚胎中检测到呼吸爆发反应¹²）。注意：观察发现，通过使用1-苯基-2-硫脲（PTU）或golden/slc24a5突变型斑马鱼来抑制胚胎色素沉积，不会显著影响PMA诱导的荧光信号（未发表数据，实验测试时间为受精后48、72和96小时）。
   1. 每天使用塑料移液管清除死亡胚胎。
   2. 小心倾去旧的卵水，并每天补充新鲜卵水。
4. 去绒毛膜：在实验当天，若胚胎仍带有绒毛膜，则如前所述使用两把精细镊子去除绒毛膜¹⁴（本呼吸爆发检测法也可用于成年斑马鱼解剖所得的肾脏组织¹²，且已有文献详细描述成年斑马鱼肾脏解剖的操作流程^16,17）。

2. 溶液配制

1. 配制H2DCFDA储备液：称取1 mg H2DCFDA。
   1. 将1 mg H2DCFDA溶解于1 ml二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1 mg/ml的储存液。
   2. 在1.7 ml 微量离心管中分装22 μl该贮存液。
   3. 用铝箔包裹H2DCFDA储备液的分装样品，并尽可能避光保存，因为H2DCFDA对光敏感。
   4. 将 H2DCFDA 分装样品于 -20 °C 保存，可稳定存放长达 3 个月。
2. 注意——配制佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）储备液：使用适当的个人防护装备称取1 mg PMA即 手套、护目镜和口罩
   1. 将PMA溶于1 ml DMSO中，配制成1 mg/ml的储存液。
   2. 在1.7 ml 微型离心管中分装成每份11 μl。
   3. 将PMA储存液分装后于-80 °C保存，可稳定存放长达3个月。
3. 制备H2DCFDA工作液：在实验当天，通过将1份H2DCFDA储备液与1份DMSO混合，配制H2DCFDA工作液（最终浓度为500 μg/ml）。例如，取20 μl H2DCFDA储备液和20 μl DMSO，加入铝箔包裹的1.7 ml微量离心管中。
4. 制备PMA工作液：在实验当天，将1份PMA储备液与49份无核酸酶水混合，配制成PMA工作液（终浓度为20 μg/ml）。例如，在1.7 ml微量离心管中，将10 μl PMA储备液加入490 μl无核酸酶水中进行稀释。
5. 制备H2DCFDA给药溶液：在实验当天，用卵水配制终浓度为1 μg/ml的H2DCFDA给药溶液。可根据需要调整给药溶液的配制体积，但须确保试剂的终浓度保持不变。对于肾脏样本，使用等体积的Dulbecco改良Eagle培养基/F-12（50% DMEM，50% F-12，不含酚红）代替卵水。配制5 ml H2DCFDA给药溶液时，使用5 ml血清移液管将5 ml卵水（或DMEM/F-12）转移至一支用铝箔包裹并标记为“H”的15 ml锥形离心管中。
   1. 从标记为“H”的15 ml离心管中移除10 μl卵水（或DMEM/F-12），并弃去。
   2. 向标记为“H”的15 ml锥形管中加入10 μl H2DCFDA工作液，涡旋混匀（此体积适用于48个胚胎或肾脏样本（相当于一个完整的96孔微孔板的一半），这些孔将用于测定背景荧光水平）。
6. 配制 H2DCFDA + PMA 给药溶液：在实验当天，配制含有终浓度为 H2DCFDA - 1 μg/ml 和 PMA - 400 ng/ml 的 H2DCFDA + PMA 给药溶液。配制 5 ml H2DCFDA + PMA 给药溶液时，使用 5 ml 血清移液管将 5 ml 卵水（或 DMEM/F-12）转移至新标记为“H + P”的 15 ml 圆锥形离心管中。
   1. 从标记为“H + P”的15 ml离心管中移除110 μl卵水（或DMEM/F-12），弃去。
   2. 向标记为“H + P”的15 ml锥形管中加入10 μl H2DCFDA工作液，然后加入100 μl PMA工作液，涡旋混匀（此体积适用于48个样品或一块96孔微孔板的另一半）。
7. 将给药溶液置于冰上保存。

3. 酶标仪程序设置

1. 准备仪器：打开酶标仪电源。
   1. 预热光源。
   2. 设置荧光读数程序：例如 激发波长：485 nm；发射波长：528 nm；光学位置：顶部 510 nm；灵敏度：65，读数前进行 5 秒振板。

4. 96孔微孔板设置（参见图2）

1. 准备实验用品：获取去壳胚胎培养皿、黑色96孔微孔板、P200移液器及吸头、装有H2DCFDA和H2DCFDA + PMA给药溶液的冰桶、多通道P200移液器、两个无菌储液槽、铝箔和剪刀。
2. 将一个胚胎转移至96孔微孔板的每一孔中：使用剪刀剪去移液器吸头的尖端，使胚胎或肾脏能够通过开口。
   1. 将P200移液器设定为100 μl，将一个胚胎连同卵水（或DMEM/F-12）转移至黑色96孔微孔板中所需数量的孔中（在同一实验条件下，每次转移不同胚胎样本时无需更换吸头，但在不同实验条件之间可能需要更换吸头）。务必避免转移残留的卵壳，因为这些残留物可能导致所收集数据产生偏差。对于肾脏的转移，可使用较大体积的移液器（设定为100 μl），并在必要时剪切吸头以获得更大的孔径。根据需要，可在微孔板中设置不含胚胎或肾脏样本但含有给药溶液的孔，以用于控制某些实验操作。
3. 加入给药溶液：将H2DCFDA给药溶液倒入一个无菌的25 ml储液槽中。
   1. 使用多通道P200移液器和八个吸头，同时向96孔微孔板的一列中加入100 μl的H2DCFDA给药溶液（H2DCFDA的终浓度为500 ng/ml）。
   2. 重复此步骤（无需更换吸头），直至完成所需列数（通常为六列或48孔，若填满整个96孔板）。将该溶液加入一半的对照组胚胎样本和一半的实验处理胚胎样本中（示例96孔板设置见图2，这些孔（橙色标记）将提供未用PMA诱导样本的背景荧光数据）。
   3. 将H2DCFDA + PMA给药溶液倒入一个新的无菌25 ml储液槽中。
   4. 使用多通道P200移液器和八个吸头，同时向96孔微孔板剩余的列（图2中红色标记）中加入100 μl的H2DCFDA + PMA给药溶液（无需更换吸头，H2DCFDA终浓度为500 ng/ml，PMA终浓度为200 ng/ml）。
4. 用铝箔覆盖微孔板。
5. 在150 rpm条件下轻轻震荡微孔板约20秒，以使各孔中的溶液充分混匀。
6. 当不进行检测时，将微孔板在28 °C条件下孵育。

5. 荧光定量

1. 在加入PMA后0小时，使用步骤3.1.2中所述参数读取微孔板。
   1. 在所需的时间间隔内，每隔几分钟继续进行测量；或者将用铝箔包裹的微孔板在28 °C下孵育至预定时间点，然后在所需时间（例如 加入PMA后4小时）进行终点测量。
2. 使用塑料移液管从孔中取出胚胎。
3. 根据动物护理与使用规程对胚胎实施安乐死，例如 浸入三卡因MS222（tricaine MS222）中。
4. 将微孔板及其他一次性材料丢弃至生物危害废物容器中。

6. 数据分析

1. 确定您希望比较荧光值的时间点（例如 PMA 添加后 4 小时 表1).
2. 从各个PMA诱导对照组的荧光值中减去未诱导对照组的平均荧光值。
3. 对实验组分别在有PMA和无PMA的条件下重复此步骤。
4. 将这些标准化的荧光值存储在两列中：对照 + PMA 组和实验 + PMA 组（表 2).
5. 计算对照 + PMA 组和实验 + PMA 组的归一化荧光值的均值和标准差。
6. 使用非配对 t 检验比较归一化荧光值，以确定统计学显著性（表 2).
7. 绘制对照 + PMA 组与实验 + PMA 组的均值图，误差线表示相应的标准差。
8. 在图表及图注中注明显著性水平图2).

结果

本研究提供了野生型AB品系斑马鱼胚胎在受精后48小时和72小时（hpf）呼吸爆发反应的比较数据。48 hpf胚胎作为对照组，72 hpf胚胎作为实验组。每个发育阶段使用24个未诱导胚胎和24个佛波酯（PMA）诱导胚胎。在加入PMA后4小时读取微孔板，获得原始荧光值（相对荧光单位，RFU）。原始荧光值见表1。除一个72 hpf胚胎外，48 hpf未诱导胚胎的原始荧光值普遍高于72 hpf未诱导胚胎（均值：48 hpf = 758 RFU，72 hpf = 230 RFU）。这两个样本组内的变异程度大致相等（标准差：48 hpf = ±549 RFU，72 hpf = ±513 RFU），但72 hpf组相对于均值的变异更大（标准差占均值的百分比：48 hpf = 72%，72 hpf = 223%）。在PMA诱导组中，72 hpf群体的原始荧光值大多高于48 hpf群体（均值：48 hpf PMA = 3798 RFU，72 hpf PMA = 5825 RFU）。72 hpf PMA诱导组的变异程度高于48 hpf PMA诱导组（标准差：48 hpf PMA = 831 RFU，72 hpf PMA =...

讨论

吞噬细胞的主要功能是识别、吞噬并清除病原体。吞噬细胞产生充分的呼吸爆发能力对实现这一功能至关重要。因此，定量检测呼吸爆发反应是用于比较不同个体组之间或实验干预条件下先天免疫总体健康状况与功能的一种方法。本文描述了一种诱导、定量并比较斑马鱼胚胎个体组之间呼吸爆发反应的实验方案。简言之，佛波酯（PMA）可激活NADPH氧化酶，从而产生活性氧（ROS）。这些活性氧作用于一种非荧光性染料，将其氧化为荧光化合物。使用微孔板读数仪检测各孔中的相对荧光强度。PMA诱导后产生的荧光信号反映了斑马鱼胚胎的呼吸爆发潜能及其先天免疫的整体健康状态。通过非配对t检验比较经PMA诱导后各组间标准化荧光水平，可判断斑马鱼组间呼吸爆发潜能是否存在显著差异。导致呼吸爆发反应出现显著差异的实验干预，有助于揭示先天免疫的作用机制，e.g. 吞噬细胞呼吸爆发所必需的基因产物、增强或抑制呼吸爆发反应的药物等。

用于检测斑马鱼模型中先天免疫反应不同方面的实验方案已有开发（参见引言）。其中，能够测量活性氧（ROS）产生的技术相对较少。本文详细介绍了一种在佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）刺激...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Instant Ocean 海盐	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 克
DMEM/F-12，无酚红	Life Technologies	11039-021
深型培养皿	VWR	89107-632
塑料移液管	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont 镊子	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml 微型离心管	Axygen	10011-724
15 ml 锥形离心管	VWR	21008-918
5 ml 血清移液管	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 多功能微孔板读板仪	BioTek	联系 BioTek
黑色 96 孔微孔板	VWR	82050-728
25 ml 无菌储液槽	VistaLab	3054-2003
P200 移液器	Gilson	F123601
多通道移液器	VWR	89079-948
移液器吸头	VWR	89079-478