斑马鱼先天免疫健康的呼吸爆发反应定量检测

摘要

先天免疫反应可保护生物体免受病原体感染。先天免疫反应的关键组分——吞噬细胞呼吸爆发——能够产生活性氧物质，从而杀灭入侵的微生物。本文介绍一种呼吸爆发检测方法，用于定量测定化学诱导先天免疫反应时所产生的活性氧物质。

摘要

吞噬细胞呼吸爆发是机体对病原体感染先天免疫反应的一部分，涉及活性氧（ROS）的产生。ROS具有毒性，可杀灭被吞噬的微生物。体内定量检测吞噬细胞来源的ROS能够提供有关生物体启动有效先天免疫反应能力的信息。本文介绍一种在化学诱导吞噬细胞呼吸爆发后，对完整斑马鱼胚胎中ROS进行定量和比较的实验方案。该方法利用一种非荧光化合物，该化合物在被ROS氧化后会转变为荧光物质。将单个斑马鱼胚胎移液至微孔板的孔中，并在有或无呼吸爆发化学诱导剂的条件下，与这种荧光原性底物共同孵育。使用微孔板读数仪在预定时间点测定各孔的荧光强度。通过校正以消除背景荧光后，采用非配对t检验进行荧光读数的比较。该方法可用于比较不同发育阶段斑马鱼胚胎的呼吸爆发潜能，以及在实验干预（如蛋白敲低、过表达或药物处理）后的反应变化。该方法也可用于监测成年斑马鱼及其他一些鱼类完整解剖所得肾脏组织或肾源性细胞制备物中的呼吸爆发反应。我们认为，本方案相对简便且具有良好的适应性，可作为现有方法的补充，有助于希望深入理解先天免疫反应的研究人员开展相关研究。

引言

免疫系统由两个分支组成：先天性免疫和适应性免疫。与适应性免疫相比，先天性免疫在进化上更为古老。目前认为无脊椎动物仅具有先天性免疫，而脊椎动物则同时具备先天性和适应性免疫两个分支。适应性免疫可对特定病原体产生特异且持久的免疫反应，而先天性免疫则是对入侵的细菌、病毒和真菌所作出的即时反应。先天性免疫反应的一个关键环节是释放细胞因子和趋化因子，从而引发炎症反应，并募集吞噬细胞（例如 巨噬细胞、中性粒细胞）来吞噬并清除外来病原体。

成功的先天免疫反应包括：（1）识别入侵的微生物；（2）激活相应的信号级联反应（例如 细胞因子和趋化因子的释放）；（3）吞噬细胞的正常发育/足够数量；（4）吞噬细胞向感染部位的迁移；（5）病原体的吞噬；以及（6）被吞噬微生物的清除。上述任一环节的缺陷都可能导致宿主无法抵御感染而死亡。强大的先天免疫反应对生物体的健康至关重要，因为它是所有植物和动物抵抗病原体的第一道防线。在脊椎动物中，它还能增强适应性免疫反应¹。因此，能够全面评估先天免疫反应的各个方面，对于深入理解该反应并优化其功能具有重要意义。

许多模式生物被用于研究先天免疫，范围从拟南芥（Arabidopsis）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、黑腹果蝇（Drosophila）、小鼠到培养的人类细胞。使用斑马鱼（Danio r....

方案

1. 斑马鱼的饲养与维护

1. 饲养：如前所述方法对成年斑马鱼进行大规模产卵¹³。如前所述方法收集产出的胚胎¹⁴。
2. 显微注射（如需要）：如前所述方法，对1-4细胞期的斑马鱼胚胎注射吗啉代寡核苷酸以敲低基因产物，或注射mRNA以过表达基因产物¹⁵。
   1. 需维持足够数量的对照组胚胎（至少需要48条存活的假注射对照鱼和48条存活的实验处理鱼，以填满一块96孔微孔板）。
3. 胚胎培养：将胚胎置于深型培养皿中，在28 °C的卵水中（蒸馏水中加入60 μg/ml Instant Ocean海盐，经高压灭菌）培养至所需发育阶段（使用本方案无法在受精后2天以内的斑马鱼胚胎中检测到呼吸爆发反应¹²）。注意：观察发现，通过使用1-苯基-2-硫脲（PTU）或golden/slc24a5突变型斑马鱼来抑制胚胎色素沉积，不会显著影响PMA诱导的荧光信号（未发表数据，实验测试时间为受精后48、72和96小时）。
   1. 每天使用塑料移液管清除死亡胚胎。
   2. 小心倾去旧的卵水，并每天补充新鲜卵水。
4. 去绒毛膜：在实验当天，若胚胎仍带有绒毛膜，则如前所述使用两把精细镊子去除绒毛膜¹⁴（本呼吸爆发检测法也可用于成年斑马鱼解剖所得的肾脏组织¹²

结果

本研究提供了野生型AB品系斑马鱼胚胎在受精后48小时和72小时（hpf）呼吸爆发反应的比较数据。48 hpf胚胎作为对照组，72 hpf胚胎作为实验组。每个发育阶段使用24个未诱导胚胎和24个佛波酯（PMA）诱导胚胎。在加入PMA后4小时读取微孔板，获得原始荧光值（相对荧光单位，RFU）。原始荧光值见表1。除一个72 hpf胚胎外，48 hpf未诱导胚胎的原始荧光值普遍高于72 hpf未诱导胚胎（均值：48 hpf = 758 RFU，72 hpf = 230 RFU）。这两个样本组内的变异程度大致相等（标准差：48 hpf = ±549 RFU，72 hpf = ±513 RFU），但72 hpf组相对于均值的变异更大（标准差占均值的百分比：48 hpf = 72%，72 hpf = 223%）。在PMA诱导组中，72 hpf群体的原始荧光值大多高于48 hpf群体（均值：48 hpf PMA = 3798 RFU，72 hpf PMA = 5825 RFU）。72 hpf PMA诱导组的变异程度高于48 hpf PMA诱导组（标准差：48 hpf PMA = 831 RFU，72 hpf PMA =.......

讨论

吞噬细胞的主要功能是识别、吞噬并清除病原体。吞噬细胞产生充分的呼吸爆发能力对实现这一功能至关重要。因此，定量检测呼吸爆发反应是用于比较不同个体组之间或实验干预条件下先天免疫总体健康状况与功能的一种方法。本文描述了一种诱导、定量并比较斑马鱼胚胎个体组之间呼吸爆发反应的实验方案。简言之，佛波酯（PMA）可激活NADPH氧化酶，从而产生活性氧（ROS）。这些活性氧作用于一种非荧光性染料，将其氧化为荧光化合物。使用微孔板读数仪检测各孔中的相对荧光强度。PMA诱导后产生的荧光信号反映了斑马鱼胚胎的呼吸爆发潜能及其先天免疫的整体健康状态。通过非配对t检验比较经PMA诱导后各组间标准化荧光水平，可判断斑马鱼组间呼吸爆发潜能是否存在显著差异。导致呼吸爆发反应出现显著差异的实验干预，有助于揭示先天免疫的作用机制，e.g. 吞噬细胞呼吸爆发所必需的基因产物、增强或抑制呼吸爆发反应的药物等。

用于检测斑马鱼模型中先天免疫反应不同方面的实验方案已有开发（参见引言）。其中，能够测量活性氧（ROS）产生的技术相对较少。本文详细介绍了一种在佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）刺激.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Instant Ocean 海盐	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 克
DMEM/F-12，无酚红	Life Technologies	11039-021
深型培养皿	VWR	89107-632
塑料移液管	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont 镊子	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml 微型离心管	Axygen	10011-724
15 ml 锥形离心管	VWR	21008-918
5 ml 血清移液管	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 多功能微孔板读板仪	BioTek	联系 BioTek
黑色 96 孔微孔板	VWR	82050-728
25 ml 无菌储液槽	VistaLab	3054-2003
P200 移液器	Gilson	F123601
多通道移液器	VWR	89079-948
移液器吸头	VWR	89079-478