本文介绍了一种基于聚马来酸的纳米药物，旨在为适用于癌症的个体化药物合理设计提供范例。文中描述了用于治疗裸鼠体内Her2阳性人乳腺癌的纳米药物的合成方法。
本文内容
摘要
摘要
具有相似分级和形态的肿瘤由于分子谱型的差异，往往对相同治疗方案表现出不同的反应。为应对这种异质性，个性化医学应运而生，旨在沉默与恶性肿瘤相关的基因。纳米药物通过靶向肿瘤并递送反义寡核苷酸以实现基因沉默，满足了这一需求。由于治疗药物通常需要多次给药，因此理想的药物应无毒性且免疫反应可忽略。本文示例中，一种纳米药物通过将反义寡核苷酸和肿瘤靶向分子经可控化学连接，偶联至可生物降解、无毒且无免疫原性的聚马来酸平台而合成。该合成与治疗方法以实验性小鼠模型中的人Her2阳性乳腺癌为例进行说明，此策略亦可拓展应用于其他肿瘤的合成与治疗。
引言
在后基因组时代，随着癌症基因组的逐步解析（National Center for Biotechnology 和 The Cancer Genome Atlas），未来的癌症治疗将充分考虑肿瘤内部的遗传异质性，这种异质性甚至存在于同一肿瘤内1-4。生物信息学与快速、低成本的DNA测序技术使得在个体层面上获取恶性基因或突变信息成为可能2,4,5。一旦确定了相关基因，患者将接受个体化治疗，以调控或沉默这些恶性基因的表达6。针对癌细胞并将其药物有效递送至细胞内的需求，推动了多功能递送系统的研发。显然，纳米药物能够满足这一要求7。
随着一系列新发现的涌现，纳米颗粒已被证实适用于将化疗药物、蛋白质和/或具有基因活性的物质递送至癌细胞。然而，其不良反应仍需解决。其中，由于缺乏生物降解性，可能导致材料在健康组织和器官中沉积，进而引发疾病。为最大限度减少沉积，我们引入了一种无毒且无免疫原性的聚苹果酸，该物质来源于微生物，可生物降解为 H2O 和 CO28。我们利用该聚合物合成一种一体化共价型纳米药物，其中化学连接了替莫唑胺、多柔比星或反义寡核苷酸等化疗药物，以及实现血管外渗、组织靶向和内体裂解递送的功能基团。当药物到达靶向肿瘤细胞后，会从纳米载体上内在地解离，从而恢复其完整的药理活性。
我们介绍了微生物生产聚合物纳米平台的方法，及其纯化过程，以及包含曲妥珠单抗（赫赛汀）用于癌症靶向和反义寡核苷酸用于抑制HER2过量表达的纳米药物的化学合成。在将该纳米药物应用于裸鼠体内异种移植的人Her2阳性乳腺癌时，我们证明了该癌症治疗具有高效性。本文针对聚马来酸纳米药物所提出的肿瘤靶向与基因沉默原理，可应用于其他类型癌症的治疗。
方案
所有实验均符合官方动物管理条例，包括实施的手术和非手术操作 体内 且完全符合IACUC规程。
1. 聚马来酸的生物生产
- 在琼脂上培养孢囊体的种子培养物，并使用25 °C恒温培养箱和基础培养基将原生质转移到100 ml培养液中8,9。
- 在避光条件下培养500 ml重力压紧的微原生质体，以防止产生孢子。
- 在10 L生物反应器中，将80 g CaCO3悬浮于8 L基础培养基中。将500 ml压紧的微原生质体转移至安装好的反应容器中，在25 °C、通入10 L/min过滤空气、使用分段搅拌器以150 rpm搅拌的条件下进行生物过程，持续75小时。
- 当培养液pH降至4.8时终止培养，表明PMLA生产结束，并通过羟肟酸/Fe(III)法测定PMLA含量。
- 将培养液冷却至17 °C，静置使细胞依靠重力沉降。
- 进一步冷却至4 °C，用2 M NaOH调节pH至7.5。将上清液从底部到顶部泵过装有1.5 L DEAE-纤维素的层析柱（粗颗粒DEAE，预先用5 °C的20 mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5平衡）。
- 改变流动方向为从顶部到底部后，用含0.3 M NaCl的缓冲液洗涤3个柱体积，然后在含0.7 M NaCl的条件下洗脱PMLA。
- 加入CaCl2至终浓度0.1 M，用80%冰乙醇沉淀PMLA-钙盐。使用Sephadex G25柱将产物分级为80–300 kDa、50–80 kDa和10–50 kDa的PMLA-钙盐组分，分离时使用不含缓冲液和盐的水作为流动相。
- 将各组分分别通过Amberlite IR 120H+柱，立即用液氮冷冻流出液中的聚苹果酸，并进行冻干。
- 溶于干燥丙酮中。过滤后，在干燥气流中除去溶剂，再进行冻干，并于-20 °C保存。
2. 基于聚马来酸的纳米药物合成
- 通过将116 mg（1 mmol 马来酸单元）PMLA-H 溶于1 ml无水丙酮中，并加入1 mmol N-羟基琥珀酰亚胺和1 mmol 二环己基碳二亚胺溶于2 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，活化PMLA（P）的羧基。在20 °C下搅拌3小时。随后加入0.05 mmol溶于1 ml DMF中的mPEG5000-NH2（占马来酸单元的0.05 mol%）以及0.05 mmol三乙胺（TEA）。
- 将0.4 mmol亮氨酸乙酯（LOEt）（占马来酸单元的40 mol%）、0.1 mmol 2-巯基-1-乙胺（2-MEA）（占马来酸单元的10 mol%）和0.5 mmol TEA分别溶于DMF后逐滴加入。每次添加后反应1小时，并通过茚三酮试验阴性结果（薄层色谱法，TLC）检测反应是否完成。
- 通过磷酸盐缓冲生理盐水（pH 6.8）进行自发水解以去除残留的NHS酯（30分钟）。经PD-10柱脱盐，冷冻干燥获得“预偶联物”白色粉末。于-20 °C干燥保存。
- 将30 mg抗体（mAb, IgG2a-κ）溶于4.5 ml 100 mM磷酸钠、150 mM NaCl、pH 5.5的缓冲液中。
- 用5 mM三（2-羧乙基）膦盐酸盐在20 °C下还原二硫键30分钟，随后经PD-10柱纯化。
- 将Mal-PEG3400-Mal溶于2 ml相同缓冲液中，加入还原后的mAb至终体积为10 ml，在4 °C下搅拌过夜。使用Vivaspin 20浓缩至2.5 ml（截留分子量30 kD），再经Sephadex G75柱纯化。通过sec-HPLC验证产物，并在280 nm波长下光度法测定浓度。
- 将Mal-PEG-Mal-mAb与“预偶联物”中的巯基连接，得到P/PEG5000(5%)/LOEt(40%)/mAb(0.2%)/2-MEA(10%)。具体操作为：将5 ml含200 nmol mAb-PEG3400-Mal的溶液与50 mg（P/mPEG5000/LOEt/2-MEA）在上述pH 5.5缓冲液中混合，调节巯基浓度至2 mM，在20 °C下孵育3小时（产率98%）。
- 将3’-H2N-AON溶于DMF/PBS（pH 7.2）中，与N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯（SPDP）在DMF/甲醇（1:1 v/v）中反应（茚三酮检测），反应产物AON-PDP经Sephadex-LH20柱分别用甲醇和水洗脱后冷冻干燥。
- 将800 nmol活化的AONs溶于pH 5.5缓冲液中，与上述制备的Mal-PEG3400-Mal-mAb-预偶联物在4 °C下孵育过夜，直至二硫键交换反应完成。
- 加入荧光染料Alexa Fluor 680-马来酰亚胺，与聚合物上的2-MEA-SH形成硫醚键。用3-吡啶二硫基丙酸酯（PDP）封闭多余的巯基，经Sephadex G75柱纯化。4 °C保存或在-80 °C速冻，待后续使用。
3. 检测方法与特性
- 通过尺寸排阻高效液相色谱法（sec-HPLC）分析在4 °C和37 °C条件下于PBS和血清中进行纯度和稳定性测试。使用聚苯乙烯磺酸盐作为分子量标准品。测定纳米粒径分布和zeta电位，采用商用系统完成。
- 向320 μl样品中加入160 μl 10% (w/v) 盐酸羟胺溶液和160 μl 10% (w/v) NaOH溶液。反应10–15分钟后，加入160 μl含12% (v/v) HCl的5% (w/v) Fe(III)Cl3溶液，测定羟肟酸/Fe(III)络合物在540 nm处的吸光度（A540）。以1 mg/ml PMLA对应2.5 A540为标准，计算PMLA含量。
- 将纳米药物在2 M HCl中于110 °C水解过夜，通过反相色谱法检测苹果酸，并以添加已知浓度苹果酸标准品的样品作为参照。使用100 mM二硫苏糖醇（DTT）裂解纳米药物，采用定量反相高效液相色谱法（HPLC），参照Morpholino AON标准品测定Morpholino-AON含量。
- 取未经裂解的纳米药物，使用蛋白检测试剂盒测定抗体含量。通过mPEG与硫酸铁铵硫氰酸盐的反应进行mPEG定量，随后用氯仿萃取，并在510 nm波长处测定吸光度10。
- 每孔加入5 μl纳米药物（含1–10 μg单克隆抗体），进行ELISA实验以检测抗体活性和交联能力。分别以0.5 μg/孔的转铁蛋白受体和HER2作为包被抗原，使用辣根过氧化物酶标记的二抗。
- 以苹果酸含量为100%，计算AON、mPEG和mAb的实际得率百分比，并与设计预期的百分比进行比较（参见示例 表1 和 表2）。
4. 体外 测试
- 将纳米药物与培养的癌细胞共同孵育，并通过检测细胞将黄色试剂[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑内盐]（MTS）还原为蓝色染料的活性，随时间测定存活细胞数量，使用光度计读取相对吸光度。请遵循试剂盒供应商提供的操作说明。
- 制备细胞提取物 体外 或 离体 用于蛋白质印迹。使用含有SDS和蛋白酶抑制剂混合物的冰预冷提取缓冲液。通过还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。
- 对样品提取物中目标蛋白进行蛋白质印迹（Western blotting）检测。使用碱性磷酸酶标记的二抗。
- 使用共聚焦显微镜通过荧光标记来展示纳米药物聚合物载体、反义寡核苷酸（AON）与内体在细胞内的摄取及共定位情况。将Alexa Fluor 680标记于纳米偶联载体上，Lissamine标记于AONs作为荧光标签。利用显微镜5X光谱扫描仪和活体癌细胞观察标记分子的分布情况
- 使用Styryl Red荧光染料染色内体膜，并展示内体的共定位或释放。
5. 在体 测试
- 制备人HER2阳性乳腺癌小鼠模型（裸鼠 Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm）。在每只小鼠颈部皮下植入一枚释放17β-雌二醇的缓释丸（0.72 mg，90天释放）。
- 随后在小鼠右侧 flank 区皮下注射 1 × 107 个 BT-474 肿瘤细胞，并让肿瘤生长。
- 当肿瘤体积达到 120 mm3 时开始治疗，通过尾静脉注射 150 μl 纳米偶联物，其中含有 2.5 mg/kg 反义寡核苷酸（AON）和/或每种抗体 4.5 mg/kg。每周给药两次，共给药六次。
- 每周使用游标卡尺测量肿瘤尺寸两次，并采用公式（长 × 深 × 宽）× (π/6) 计算肿瘤体积。末次注射后两周，先用氯胺酮和右美托咪定溶液麻醉动物，随后行颈椎脱臼处死。
- 分离肿瘤组织，制备切片并进行苏木精-伊红（H&E）染色，以进行形态学评估。
- 为在整体动物水平评估药物分布，使用荧光成像系统。注射 Alexa Fluor 680 标记的纳米药物，并在 24 小时和 48 小时进行成像。
- 处死动物后，检测分离并灌注的肿瘤及器官中的荧光信号。
结果
通过沉默HER2受体表达并阻断HER2信号通路抑制人HER2阳性乳腺癌12
策略
在不同类型的人类乳腺癌中，HER2阳性肿瘤的临床预后最差。本文展示了在裸鼠模型中成功治疗人类HER2过表达型乳腺癌的方法。该策略采用一种纳米药物，通过赫赛汀（Herceptin）和特异性靶向HER2的反义寡核苷酸（AON）共同作用，即时沉默HER2信号通路，并阻断依赖HER2 mRNA的受体合成（图1）。主要的纳米偶联物包含赫赛汀和抗HER2 AON，如图3所示，同时设有两种对照组，分别缺失赫赛汀或AON。该主要化合物还含有抗MsTfRmAb，可通过与肿瘤血管内皮细胞上的转铁蛋白受体（TfR）结合，经转胞吞作用实现主动外渗。在缺乏该抗体的情况下，肿瘤摄取显著减少，此现象归因于肿瘤依赖性的EPR效应13。为进行成像研究，合成了含有Alexa Fluor 680的荧光标记纳米偶联物。
图1. AON 递送至 HER2 阳性乳腺癌细胞的机制及肿瘤生长抑制。左上角：纳米偶联物改编自图3。左下角：小鼠肿瘤血管表面表达转铁蛋白受体（TfR）。纳米药物与受体结合后通过穿胞作用进入肿瘤组织。此外，纳米药物还可通过结构紊乱的内皮层进入肿瘤，该过程参与肿瘤依赖性的增强通透性和滞留效应（EPR）13。随后，纳米药物与人源癌细胞表面表达的 HER2 结合，并内化至早期内体中。此结合同时可阻断 HER2 信号通路。随着内体成熟并酸化，纳米药物的内体逃逸机制被激活。进入细胞质的纳米药物通过二硫键间隔基的还原性断裂从纳米载体释放，并与 HER2-mRNA 结合，从而阻断 HER2 的合成。合成受阻进一步延长了 HER2 信号通路的抑制，最终诱导肿瘤生长抑制。
聚苹果酸平台的微生物生产
纳米共轭平台——聚马来酸（PMLA）由多头绒泡菌（Physarum polycephalum）的培养微原质体产生，并按照本方案所述方法从培养液中纯化，如图2所示。PMLA的制备与纯化过程顺利且可重复。控制反应时间、pH值和温度至关重要，以避免聚合物发生自发性裂解。建议对DEAE柱进行仔细的洗涤和洗脱，以去除DNA、碳水化合物、毒素及有色物质。将产物溶于无水丙酮并除去不溶性杂质后，可获得极高纯度的PMLA。每次生产周期可获得PMLA总量为5 ± 1 g。当使用10 L生物反应器时，可重复地获得1.5 ± 0.5 g高纯度PMLA，其分子量（Mw）为80,000–100,000。SEC-HPLC洗脱谱图呈对称峰形。基于粒子数分布的动态光散射分析显示单一峰，对应流体动力学直径为8 ± 1 nm，多分散系数PDI = 0.10 ± 0.02，该值由仪器软件按假设球形颗粒计算得出。Zeta电位为-22 ± 2 mV（pH 7.5）。
图2. 从培养的微型原生质团中生产与纯化聚苹果酸 多头绒泡菌 （改编自 Lee） 等9). 聚马来酸（PMLA）由黏菌体产生 多头绒泡菌 在生物反应器中培养并从培养上清液中通过阴离子交换剂（DEAE）结合收集。洗脱液以乙醇沉淀为钙盐形式。钙盐溶液通过Sephadex G-25进行分子量分级。含PMLA的组分通过Amberlite IR-120H将钙盐转化为酸形式+游离的PMLA最终经冻干得到白色干燥粉末。
先导纳米缀合物的化学合成
P/mPEG5000(5%)/LOEt(40%)/AON(2.5%)/Herceptin(0.2%)/anti-MsTfRmAb(0.2%)
铅纳米药物及两种前体纳米缀合物的示意图结构如图所示 图尿素 3. 该前驱体包含所有组分，而前体设计为缺少AONHER2 或抗体赫赛汀（Herceptin）。除反义寡核苷酸（AON）和单克隆抗体（mAbs）外，化合物还包括聚乙二醇（polyethylene glycol）和甲氧基聚乙二醇（mPEG）5000，以尽量减少与血浆蛋白的结合、网状内皮系统（RES）清除以及酶切降解。反义序列 5’-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3’ 与 Her2 mRNA 并经过严格测试 体外 在多种表达HER2的细胞系上进行测试，以获得高特异性地抑制HER2合成且无脱靶效应的效果。
图3. 用于治疗人HER2阳性乳腺癌的纳米偶联物。主要的纳米药物（顶部结构）包含两种药物（Herceptin、AONHER2）。版本2和版本3仅包含其中一种药物。纳米偶联物1和2被高表达HER2的人肿瘤细胞摄取依赖于Herceptin的结合。不含Herceptin的纳米偶联物3则通过连接抗-HuTfRmAb实现人细胞的内体摄取。与Alexa Fluor 680的偶联可根据成像需要选择性添加。红色条形代表纳米偶联平台PMLA/LOEt(40%)。%表示与指定配体结合时所消耗的苹果酸残基比例（纳米药物中苹果酸残基总量为100%）。
图 4. 纳米偶联物 P/LOEt/AONHER2/anti-MsTfR/Herceptin 的化学合成。从上至下：侧链羧基的 PMLA-N-羟基琥珀酰亚胺酯（PMLA-NHS）合成（化学活化）；通过与 2-巯基-1-氨基乙烷（2-MEA）、甲氧基-PEG5000-胺（mPEG5000-NH2）、三亮氨酸（LLL）或亮氨酸乙酯（LOEt）形成酰胺键取代 NHS。该“前体偶联物”通过硫醚键连接 mAb-Mal-PEG-Mal，并通过可裂解的二硫键连接 AON。剩余的 2-MEA 被封闭，形成氨基乙基-二硫代-丙酸。图中仅显示单个单克隆抗体的连接；多个抗体的连接可通过使用多种单克隆抗体的混合物实现。百分比 % 表示与各种配体结合的羧基所占比例（游离 PMLA 为 100%）。
纳米偶联物的合成方法如以下所述 图尿素 4计算得到的前药偶联物的分子量为719,000。以苹果酸含量计，合成的总产率为45 ± 5%。在100 kDa的PMLA平台平均含有的862个苹果酰基单元（=100%）中，40%携带LOEt，5%携带mPEG，2%携带AON，2%携带Herceptin，0.2%携带抗MsTfR单克隆抗体。每种抗体的含量相当于每个PMLA平台分子平均结合1.7个抗体分子。设计百分比与基团分析实测百分比在±5%范围内一致。一个实例见下文所述情况。 表1 用于计算实验内容中的苹果酸、AON、单克隆抗体和mPEG的含量5000 以及在 表2 显示了与设计含量的对比结果。根据第3节所述标准，通过高反应产率和高效的尺寸排阻分离，实现了高纯度例如 游离单克隆抗体与单克隆抗体-纳米偶联物在亲和高效液相色谱（sec-HPLC）中分离时间为1分钟，并可通过溶剂选择性溶解进行分离。实验表明，单克隆抗体在纳米药物合成过程中始终保持活性，并证实两种抗体成功组装于同一聚合物载体平台。非典型ELISA实验结果如下所示 图尿素 5总体而言，针对苹果酸、AON、蛋白质、PEG以及ELISA的定量组分析检测方法具有良好的稳健性，不仅在所报道的合成样品分析中，而且在其他合成纳米偶联物的分析中，由不同人员使用不同仪器操作时均能获得可重复的结果。
表 1. 以苹果酸含量为参照的纳米药物组分计算。
表2. 实验所得纳米药物组成与设计组成的比较。
图 5. 化学合成后抗体亲和力测定的 ELISA，以及不同抗体多重结合的验证。 该纳米药物包含针对抗原 A 的单克隆抗体 mAb(A) 和针对抗原 B 的单克隆抗体 mAb(B)。ELISA 板上包被抗原(A)。将游离 mAb(A)、游离 mAb(B) 和纳米药物分别加入 ELISA 板中。洗涤后，使用针对 mAb(A) 或 mAb(B) 的辣根过氧化物酶偶联的二抗进行检测，其中仅 mAb(A) 可与抗原(A) 结合。结果显示，游离的 mAb(A) 和纳米药物中偶联的 mAb(A)，以及同一纳米药物分子上间接偶联的 mAb(B) 被保留在板上，而游离的 mAb(B) 则未被保留。浓度依赖性实验显示，游离与偶联的 mAb(A) 具有相似的结合亲和力，表明化学偶联未影响抗体的结合活性。此外，mAb(B) 与 mAb(A) 在同一物理实体（纳米载体）上的共交联导致了 mAb(B) 的检测信号。此处展示的实验结果涉及抗人 TfRmAb (A) 和抗小鼠 TfRmAb (B)。其他测试的抗体组合也获得了类似结果，例如抗 MsTfR mAb 与抗 HER2 mAb（赫赛汀）。
理化性质研究表明，P/mPEG(5%)/LOEt(40%)/AON(2%)/Herceptin(0.2%)/anti-MsTfRmAb(0.2%)（先导制剂，双药版本）的流体动力学直径为22.1 ± 2.3 nm，P/mPEG(5%)/LOEt(40%)/AON(2%)/anti-MsTfRmAb(0.2%)/anti-HuTfRmAb(0.2%)（AON药物版本）为20.1 ± 2.4 nm，P/mPEG(5%)/LOEt(40%)/Herceptin(0.2%)（Herceptin药物版本）为15.1 ± 1.2 nm。在pH 7.5条件下，其相应的Zeta电位分别为-5.2 ± 0.4 mV、-5.7 ± 0.6 mV和-4.1 ± 0.4 mV。需要指出的是，所测得的纳米偶联物的流体动力学直径并不符合游离组分直径的加和性规律。
纳米药物在0小时和3小时后穿过肿瘤细胞膜并释放到细胞质中的递送过程r
纳米药物通过内体摄取穿过细胞膜的过程如图6所示，分别为0小时和3小时的结果。荧光标记分别连接在纳米药物载体（Alexa Fluor 680，绿色）和AON（Lissamine，红色）上。它们的叠加信号显示在D&L图中，与标记的内体（蓝色）荧光共同显示在G&O图中。根据图像计算了0小时和3小时时载体/内体、AON/内体、载体/AON共定位的Pearson相关系数（R(r)）。3小时的图像表明，纳米药物从内体释放至细胞质，并在细胞质中通过谷胱甘肽依赖的二硫键断裂使AON从纳米药物上解离。
图6. 利用共聚焦显微镜观察靶细胞对纳米偶联物的摄取（改编自Ding） 等11)细胞在37℃下孵育30分钟 37 °C 使用纳米药物，该药物在聚合物平台处用Alexa Fluor 680（绿色）双标记，并在反义寡核苷酸（AON）上连接Lissamine（红色）进行标记。此外，内体用FM1-43（蓝色）染色。0小时后的定位情况如图所示 （A） 3小时 （B） 孵育。图示 A，a-b, & B,i-j 仅显示纳米缀合荧光染料的染色及其共定位情况 A，c-d & B，k-l此外，内体的染色显示在各图中 A，e & B，m 纳米偶联物与内体的共定位（如图中各面板所示） A，f-g & B,n-o. 图版 A,h & B, p 显示各图板的相差图像。 (C) 0小时和3小时时平台-内体、AON-内体、平台-AON共定位的Pearson相关系数R(r)。 请点击此处以查看此图的放大版本。
人乳腺癌的抑制 体外 和 体内
体外 与低表达细胞系 MDA-MB-231 相比，HER2 过表达细胞系 BT-474 的生长抑制情况如图所示 图尿素 7抑制程度分别为50%和30%，由先导纳米偶联物P/mPEG/LOEt/AON实现HER2/Herceptin/抗-MsTfRmAb。其他化合物的抑制作用较弱，但在BT-474细胞中的抑制作用高于MDA-MB-231细胞。选择BT-474细胞系用于异种移植性乳腺癌小鼠的治疗。
图7. 体外 HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞和低表达的MDA-MB-231细胞的生长抑制（改编自Inoue） 等12). HER2过表达的乳腺癌细胞系BT-474（左）与HER2低表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231（右）的生长抑制比较。TfR(s) 表示抗-MsTfRmAb，TfR(Hu/Ms) 表示抗-HuTfRmAb & 抗小鼠转铁蛋白受体单克隆抗体。主导性纳米药物，P/mPEG/LOEt/AONHER2/Herceptin/TfR(Ms) 以及不含 Herceptin 或 AON 的纳米药物HER2 与PBS、Herceptin和AON进行比较HER2在缺乏赫赛汀的情况下，抗小鼠转铁蛋白受体单克隆抗体（anti-MsTfRmAb）被偶联以促进肿瘤细胞对内体的摄取。浓度为 40 μg/ml 关于抗体， 4 μM 关于AONHER2， 4 μM 内源性递送剂（AON的应用）。显著性以*表示，P<0.05：**，P<0.02：***，P< 0.003，与PBS相比。
实验结果 体内 治疗在 图8 针对携带 BT-474 Her2 过表达人乳腺癌的小鼠，肿瘤生长受到抑制 >含赫赛汀的铅纳米药物的95% HER2特异性AON组与仅用PBS处理的对照组相比（图尿素 8）。单独使用赫赛汀（Herceptin）、P/mPEG/LOEt/Herceptin 或 P/mPEG/LOEt/AON/anti-MsTfRmAb/anti-HuTfRmAb 时，抑制率均不超过 60%。对肿瘤组织提取物进行的 Western 印迹分析显示，HER2 的合成以及 Akt 的磷酸化均受到抑制，而总 Akt 和管家酶 GAPDH 的水平无明显变化。PARP 出现裂解，提示细胞凋亡水平升高。治疗后肿瘤的大体照片及经 H 染色的组织切片图像&E 展示肿瘤消退的图像如图所示 图尿素 9.
图8. 使用先导化合物和前体纳米药物治疗期间的肿瘤大小及蛋白表达情况（改编自 Inoue et al.12）。A. 不同治疗组的肿瘤大小变化（第21天至第42天，共注射8次）。柱状图误差线表示均值的标准差。与单独使用赫赛汀（Herceptin）或单药纳米偶联物相比，抗-Her2 AON 与赫赛汀联合的先导偶联物效果更优。B. 不同治疗对HER2、磷酸化Akt、总Akt、PARB、裂解型PARB及GAPDH蛋白表达的影响，通过Western blot检测显示。请点击此处查看该图的高清版本。
图9. HER2阳性BT-474人乳腺癌在裸鼠体内的治疗效果。 组织切片中肿瘤的退缩与坏死/凋亡情况（改编自Ionue et al.12）。上图：肿瘤缩小（红色箭头所示）；支持肿瘤生长的雌激素缓释丸位置（蓝色箭头所示）。下图：肿瘤切片的苏木精-伊红（H&E）染色。肿瘤细胞密集排列提示肿瘤增殖活跃；肿瘤细胞被清除的区域则显示为坏死组织。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文介绍了一种利用可生物降解的天然聚合物制备纳米药物的实验路线，该方法可用于个性化药物的合成。描述从多聚马来酸（polymalic acid）的可控制备与纯化开始，该聚合物是纳米药物合成的多功能平台。通过可重复的技术，获得高分子量且极高纯度的聚合物，适用于药物合成。文中描述了一种用于有效治疗HER2阳性乳腺癌的纳米药物的合成方法。该方法可推广应用于合成大多数其他用于癌症治疗的纳米药物。靶向作用通过抗体实现，例如赫赛汀（Herceptin），其可结合肿瘤特异性抗原如HER2蛋白，或其他能够高效内化的肿瘤标志物。该纳米药物可递送一系列反义寡核苷酸和化疗药物，从而有效抑制正在治疗的癌症的生长。在本示例中，赫赛汀与HER2结合，同时特异性反义寡核苷酸与编码HER2的mRNA退火，导致HER2信号通路的持续阻断，并显著减少HER2阳性乳腺癌。基于肿瘤靶向及反义寡核苷酸抑制基因表达的基本原理，迄今为止我们已成功合成了多种其他纳米药物，并在临床前研究中有效抑制了人胶质母细胞瘤和三阴性乳腺癌11,14-18。
合成工作始于高纯度纳米药物平台的制备，该平台为多聚马来酸，来源于多头绒泡菌（Physarum polycephalum，属于“黏菌”家族）的培养上清液。制备过程强调获得高分子量的聚合物，原则上可偶联大量抗体、肽段、寡核苷酸及其他在主动药物递送和肿瘤生长抑制中发挥作用的分子。经过可控的培养与纯化，已能够稳定地以可预测的产率获得质量可重复的聚合物。该聚合物可在常规条件下长期保存。
PMLA 纳米偶联物的合成始于聚合物侧链羧酸盐的化学活化，整个过程包含若干合成步骤。各步骤之间可选择性暂停合成，以便制备任意量的中间产物，从而适用于放大生产。合成进程通过薄层色谱（TLC）和尺寸排阻高效液相色谱（sec-HPLC）进行监测，纳米药物的组成和活性则通过基团特异性的定量化学分析、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及多种物理测量手段加以控制。我们的经验表明，这些合成过程均能顺利、可重复地进行，产率高且纯度优异。通过选择特定的抗体和反义寡核苷酸，可根据个体化医疗的需求，有利地合成各种类型的纳米药物。
成功治疗人HER2阳性乳腺癌的方法是制备小鼠癌症模型、应用纳米药物、成像及肿瘤生长分析的有效范例。相关结果 体外 活力检测有助于在动物实验中选择细胞系和先导药物。 在体 Xenogen 成像验证了纳米药物确实被递送至肿瘤。Western 印迹结果揭示了特定蛋白质水平在癌症治疗期间是否按预期方式发生变化。肿瘤大小的测量反映了治疗的效果。 即 关于抑制、消退或回归。所述实例反映了我们对其他基于聚马来酸的纳米药物的经验，表明其具有高度的可预测性、可重复性以及无明显毒性。近期关于多种靶向聚马来酸缀合物在三阴性乳腺癌治疗中的毒性和疗效结果，有力地支持了这一观点18一个关键特征是，我们的纳米药物能够穿透生物屏障：通过血管外渗进入肿瘤间质以穿透内皮屏障，通过内吞体摄取穿透肿瘤细胞膜，以及通过亮氨酸乙酯或三亮氨酸基团的作用破坏内吞体膜。血管外渗和内吞体摄取通过连接在纳米药物上的特异性抗体可靠实现。抗小鼠转铁蛋白受体抗体通过转胞吞作用介导纳米药物高效进入肿瘤组织，这可能是因为该受体在大多数肿瘤血管中高表达。同一纳米偶联分子上连接的另一种抗体则负责将纳米药物特异性地导向靶向肿瘤细胞。这两种抗体——一种介导转胞吞，另一种介导内吞体摄取——同时存在对于纳米药物的最佳功能至关重要。强烈建议对苹果酸和抗体进行定量分析，以控制纳米药物的最佳组成。最后需要指出的是，这种一体化共价纳米药物以化学连接的形式递送药物 途中 通过宿主血管系统进入受体肿瘤细胞。化学连接使大多数药物在连接至纳米偶联平台时呈失活状态（前体药物），直至在靶向部位通过裂解释放为游离药物后才被重新激活。这一点至关重要，因为药物再激活机制可在递送过程中提供高度安全性，并极大降低引发有害副作用的风险。多功能性、高效性和安全性是优质个体化医疗不可或缺的特征。
披露
作者 Julia Y. Ljubimova、Keith L. Black 和 Eggehard Holler 是 Arrogene Technology Inc. 的股东。
致谢
我们非常感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01 CA123495、U01 CA151815、R01 CA136841项目以及Cedars-Cedars医学中心神经外科和Arrogene Technology Inc.提供的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基-1-乙胺（半胱胺；2MEA） | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Vector Laboratories，加利福尼亚州伯林盖姆 | ||
| 90天释放 17β-雌二醇缓释丸 | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 马来酰亚胺 | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Y-30 抗泡沫乳剂 | Sigma-Aldrich | A5758 | |
| 抗层粘连蛋白-411 链单克隆抗体 | Santa Cruz | SC-59980 | |
| 抗pAkt单克隆抗体 | 细胞信号转导 | 9271S | |
| 抗PARB单克隆抗体 | BD 生物科学 | 556494 | |
| 抗血管性血友病因子抗体 | Abcam | AB6994 | |
| 酵母提取物（Bacto） | Bacto，Dickinson/Sparks，MD | 212720 | |
| β-肌动蛋白 | 细胞信号转导 | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| 碳酸钙 | Alfa Aesar | 36337 | |
| 细胞增殖检测试剂盒 | Promega，美国威斯康星州麦迪逊市 | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| 二环己基碳二亚胺 | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| 伊红 | Cardinal Health | S7439-4 | |
| 加拉ardin（MMP抑制剂） | 圣克鲁斯 | SC-994 | |
| GAPDH | 细胞信号转导 | 2118 | |
| 苏木精 | Cardinal Health | S7439-3 | |
| 来自猪的血红素 | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| 赫赛汀 | Genentech | 15534 | |
| 赫赛汀（Western blotting） | 细胞信号传导 | 2165S | |
| IgG2a-κ 小鼠恶性瘤 | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP 底物试剂盒 | 伯乐（Bio-Rad） | 170-5012 | |
| Immun-Star™ AP 底物试剂盒 | 伯乐（Bio-Rad） | 170-5012 | |
| LAL试剂用水 | 龙沙，马里兰州 | W50-1000 | |
| 层粘连蛋白-411 单克隆抗体 | Abcam | ||
| 亮氨酸乙酯（LOEt） | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| 鲎试剂（LAL）PYROGENT-5000 检测 | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin标记的吗啉代反义寡核苷酸 | 基因工具 | 定制 | |
| L-苹果酸 | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| 苹果酸脱氢酶 | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | 莱桑岛 | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD 生物科学 | 354248 | |
| 脱脂奶粉 | 蛋白质组学 | M203-10G | |
| 吗啉寡核苷酸 | GeneTools | 定制 | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） | ACROS Organics | 15727100 | |
| 茚三酮 | 默克 | 1.06762.0100 | |
| 硝酸纤维素膜滤纸三明治法 | Invitrogen | LC2001 | |
| 硝酸纤维素膜滤纸夹心，0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-甘氨酸转移缓冲液（25x） | Invitrogen | LC3675 | |
| 裸鼠 [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10倍浓缩液 | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1× | Gibco | 70013 | |
| PD-10 脱盐柱 | GE Healthcare | 17-0851 | |
| 多头绒泡菌 M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA 蛋白测定 | 赛默飞世尔科技 | 23225 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | 罗氏 | 1.18362×10¹¹ | |
| 蛋白检测试剂盒 ELISA 试剂盒 | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 超细级 | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | 蛋白化学 | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | 伯乐（Bio-Rad） | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| 薄层色谱，硅胶涂覆的氧化铝板 | 默克，达姆施塔特，德国 | 60F254 | |
| 三亮氨酸（LLL） | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories，加利福尼亚州伯林盖姆 | ||
| 右美托咪定 | 辉瑞 | ||
| 阿替美唑 | 辉瑞 | ||
| 卡洛芬 | 辉瑞 | ||
| 聚维酮碘 | 福斯特和史密斯，威斯康星州 |
参考文献
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