一种用于评估化学物质对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒影响的微孔板检测法：无需使用有机溶剂的三氯生效应研究

摘要

肥大细胞脱颗粒，即过敏介质的释放，在过敏、哮喘和抗寄生虫免疫防御中具有重要作用。本文展示了评估药物和有毒物质对脱颗粒影响的技术方法¹，该方法最近被用于揭示抗菌剂三氯生对脱颗粒的强效抑制作用²。

摘要

肥大细胞在过敏性疾病和抗寄生虫免疫防御中发挥重要作用。一旦被激活（例如 由过敏原激活后，肥大细胞会发生脱颗粒，这一过程导致过敏介质的胞吐。药物和毒物对肥大细胞脱颗粒的调节可能对人类健康产生有益或有害的影响。利用大鼠嗜碱性白血病肥大细胞（RBL-2H3）已对肥大细胞功能进行了深入研究，该细胞系被广泛用作人黏膜肥大细胞的模型^3-5. 颗粒成分及过敏介质 ββ-己糖胺酶，该物质从肥大细胞释放时与组胺呈线性同步释放⁶可通过与荧光底物反应，从而在微孔板检测中产生可测量的荧光强度，该方法易于操作且结果可靠，适用于高通量研究。¹. 最初由 Naal 等人发表 等人¹我们已将该脱颗粒检测法改进用于药物和毒物的筛选，并在此展示其应用。

三氯生是一种广谱抗菌剂，存在于许多消费品中，已被发现可作为人类过敏性皮肤病的治疗辅助手段^7-11，尽管其作用机制尚不明确。本文中，我们展示了一种用于评估三氯生对肥大细胞脱颗粒影响的检测方法。我们近期已证实，三氯生对肥大细胞功能具有显著影响²。为避免使用有机溶剂，三氯生通过加热和搅拌直接溶解于水相缓冲液中，并通过紫外-可见分光光度法（使用 ε₂₈₀ = 4,200 L/M/cm）确认其最终浓度¹²。本方案可适用于多种化学物质，用于评估其对肥大细胞脱颗粒的影响，进而更广泛地评估其致敏潜力。

引言

肥大细胞是富含颗粒的免疫效应细胞，在哮喘、过敏、寄生虫防御及致癌过程中发挥关键的介导作用^13-16。它们存在于几乎所有有血管分布的组织中¹⁵，在细胞质颗粒中安全储存过敏性和炎症性介质，直至被激活而发生脱颗粒。脱颗粒是指膜包被颗粒的胞吐作用，导致组胺、类胰蛋白酶和白三烯等药理活性介质的释放¹⁵。该过程可启动Ⅰ型超敏反应，这在抵御寄生虫感染以及引发过敏、哮喘和致癌反应中具有重要作用¹⁵。

肥大细胞和嗜碱性粒细胞表达 FcεRI 受体，即免疫球蛋白 E（IgE）的高亲和力受体¹⁷。接触过敏原或抗原会导致多个与 IgE 结合的 FcεRI 受体发生聚集¹⁷，这种所谓的“IgE 结合 Fc 受体交联”会启动脱颗粒过程：一系列酪氨酸磷酸化事件、磷脂酶 C 激活、细胞内钙库释放钙离子以及细胞外钙离子内流¹⁸。钙离子内流是脱颗粒所必需的，并进一步触发颗粒与细胞膜融合，最终导致颗粒内容物的胞吐¹⁵。在实验中，可使用钙离子载体将钙离子直接转运穿过细胞膜¹⁹，从而实质上绕过钙内流之前的所有信号转导步骤²⁰，有助于确定毒性物质的作用靶点位于钙信号通路的上游还是下游²⁰。

通过监测细胞上清液中β-己糖胺酶的释....

方案

请注意，所有缓冲液配方均包含在方案文本末尾的表格中。

第1天：

1. 细胞准备

1. 规划96孔板的布局方案，将测试样品置于布局中央，以避免边缘效应。对每个测试的三氯生（TCS）浓度均设置三个重复孔（± 脱颗粒刺激物，如抗原或离子载体），同时设置自发释放组（无脱颗粒刺激物）、最大释放组（含0.2% Triton X-100 [TX] 去垢剂裂解）的三重复孔，以及预留用于背景样品的孔（不含细胞）。每次重复实验日均应采用新的随机化布局安排TCS样品浓度。
2. 将RBL培养基（配方见表格）和胰蛋白酶置于37 °C水浴中预热。
3. 检查T-25培养瓶中的RBL细胞（传代后2-4天内，解冻后不超过3-4个月）的一般健康状态：通过培养基颜色判断pH是否正常，无浑浊现象。将培养瓶置于光学显微镜下观察，确认无污染，且细胞状态良好、融合度适当、大部分贴壁。注意应每约六周检测一次支原体污染²²。

处理	三复孔
刺激，0 µM TCS	A7, B7, C7, F4, G4, H....

结果

在 50 °C 下加热 90 分钟后，三氯生（TCS）的紫外-可见吸收光谱在约 260 至 300 nm 范围内呈现出一条强而平滑的曲线，峰值位于 280 nm，如图 1所示。因此，紫外-可见分光光度法是一种可用于计算浓度的重要工具，因为在 280 nm 处已发表的摩尔吸光系数为 4,200 L/mol/cm¹²。我们发现，在完成 50 °C 加热后，整个脱颗粒实验期间，TCS 不会从溶液中析出（数据未显示）。

采用此加热方法将TCS直接溶解于水相缓冲液后，我们利用基于荧光的检测方法（该方法经Naal et al.¹优化）考察了TCS对肥大细胞脱颗粒的影响。该检测通过测定荧光底物产物的信号，记录肥大细胞在孵育1小时后释放的β-己糖胺酶水平。无论由DNP-BSA抗原（图2）还是钙离子载体A23187（图3）刺激诱导脱颗粒，均可明显观察到TCS对β-己糖胺酶释放（即脱颗粒）产生显著的剂量依赖性抑制作用。

图2 代表了经IgE致敏的RBL细胞的.......

讨论

2004年，Naal et al.¹ 开发了一种用于高通量检测脱颗粒的肥大细胞生物传感器。这是一种稳健的检测方法，我们已将其改进并应用于本视频中展示的TCS研究。在Naal et al.¹ 的方法出现之前，肥大细胞脱颗粒通常通过β-己糖胺酶^59-61进行评估，但这些早期方法使用荧光计，每次只能读取一个样本。重要的是，Naal et al. 确立了其基于微孔板读数仪的高通量方法与早期单样本荧光计读数方法之间结果的一致性。总之，Naal et al.¹ 通过将该检测方法适配至高通量微孔板平台，并对操作流程进行了多项优化，显著提高了检测的速度、效能、简便性和可靠性。在此，我们进一步改进了该方法，用于研究多种待测化学品，特别是广泛使用的药物TCS。本视频详细展示了这一非常实用的检测方法的各个步骤。此外，我们还开发了一种无需有机溶剂、直接将TCS溶于水相缓冲液的方法，并展示了一种简单且低成本的TCS浓度验证流程。这些方法将有助于日益发展的三氯生毒理学研究领域。在本讨论中，我们也详细说明了应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RBL-2H3 细胞	ATCC	CRL-2256	我们所使用的细胞系为馈赠品，但也可从ATCC获取
三氯生/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	应储存在低湿度环境中
胰蛋白酶	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
硫酸庆大霉素	龙沙生物科学	17-518
牛血清白蛋白	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100（Triton X-100；10% 溶液）	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
氯化镁	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-葡萄糖	生物医学	152527 CAS# 50-99-7
氯化钾晶体	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
氯化钙二水合物	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
甘氨酸	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-甲基伞形基-N-乙酰-β4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	用铝箔包裹 – 对光敏感
抗DNP小鼠IgE	Sigma	D8406	试剂浓度为 1 mg/ml。分装 25 µl 将试剂分装至不同的微量离心管中，并用帕拉膜封口。将分装后的试剂在 -20 °C 未使用的需储存，正在使用的分装 aliquot 储存于 2-8 °C 不超过1个月。
DNP-BSA	康奈尔大学 David Holowka 博士和 Barbara Baird 博士惠赠		建议：life technologies DNP-BSA 目录号 A23018
钙离子载体 A23187	Sigma	C75-22-1mg	离子载体由粉末加入 400 µl 将新鲜的100% DMSO加入离子载体小瓶中，并保存于-20 °C 注意：我们已成功使用超过3个月有效期的离子载体
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
乙酸	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
无水碳酸钠	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
氯化钠	西格玛	71376 CAS# 7647-14-5
盐酸	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
参考缓冲液，pH 7	VWR	BDH5046
参考缓冲液，pH 10	VWR	BDH5072
参考缓冲液，pH 4	VWR	BDH5018
pH电极保存液	VWR	14002-828
设备：
DU 7500 分光光度计	Beckmann	不再销售
Synergy 2 酶标仪 使用 Gen5 微孔板数据采集与分析软件	BioTek	模块 S
血细胞计数板	豪斯科学公司	3110
7 × 7 CER HOT/STIR 120 V 组合加热板/磁力搅拌器	VWR	97042-634
离心	Eppendorf	5430
组织培养水浴箱	VWR	型号# 89032-206
组织培养生物安全柜 SafeGARD（TC罩）	The Baker Company	型号# SG403A-HE
组织培养孵育箱	赛默飞世尔科技	型号 3598
Pipetman	VWR		量程：P2-P1000
平衡	Mettler Toledo	型号# AG204
pH计	Symphony/VWR	型号# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip 分配器	Eppendorf	4981 000.019
配方：
乙酸盐缓冲液，pH 4.4	配制 0.12 M 乙酸，并用 10 N NaOH 滴定至 pH 4.4。该溶液为将 5.3 ml 冰乙酸加入 1 L MilliQ 水中制得：(1 L)×(0.12 mol/L)×(60 g/mol)×(ml/1.37 g) = 5.3 ml，因冰乙酸密度为 1.37 g/ml	无菌过滤至已灭菌的玻璃瓶中
底物（4-MU）	Sigma M-2133，250 mg，C18H21否8，分子量 379.4，CAS (37067-30-4)，储存于 -20°C 储备液：0.12 M DMSO 溶液（1 ml DMSO 中含 46 mg），升温至 37 °C，涡旋，将样品置于温水浴超声仪中进行10分钟超声处理，再次涡旋	每次实验均需在乙酸盐缓冲液中新鲜配制底物溶液（100倍稀释），终浓度为1.2 mM。
甘氨酸碳酸盐缓冲液，pH 10	26.7 g 甘氨酸，47.1 g 无水碳酸钠，加去离子水至 1 L，调节 pH 至 10	无菌过滤后转入已灭菌的玻璃瓶
Tyrodes 溶液（2 L），pH 7.4	135 mM NaCl：15.78 g（或 270 ml 的 1 M 溶液） 5 mM KCl：10 ml 的 1 M 储存液 1.8 mM CaCl₂20.5 M 原液 7.20 ml 配制 1 mM MgCl2：0.5 M 储液 4.00 ml 5.6 mM 葡萄糖：2.02 g（11.2 ml 的 1 M 溶液） 20 mM HEPES：1 M 储液 40 ml 使用浓盐酸将 pH 从约 9.7 调至 7.4	无菌过滤后转入已灭菌的玻璃瓶
RBL 细胞培养基	解冻胎牛血清（FBS，储存于 -20 °C约 4 小时 37 °C 水浴，遵循标准无菌操作技术，取出含L-谷氨酰胺的最低必需培养基（MEM）1升（含Earle's）’s 盐溶液）倒出部分 MEM，保留 800 ml MEM，加入 200 ml 预热的 FBS。用无菌移液管向 1 L 培养基中加入 1 ml 硫酸庆大霉素抗生素。仅使用经过高压灭菌并标记为仅用于细胞培养的培养基瓶。	无菌滤器（0.2 mm）过滤至已灭菌玻璃瓶中
使用的塑料材料：
200 µl 带刻度的一次性无菌移液器吸头，置于96孔架中	VWR	53509-009	聚丙烯
1,000 µl 带高回收率的无菌气溶胶吸头	VWR	89003-420	聚乙烯
10 µl 微孔尖端 低吸附 无菌	VWR	14217-704	聚丙烯
用于高离心力的一次性/锥形微量离心管	VWR	20170-038	聚丙烯
一次性/带刻度/锥形/无菌 50 ml 带螺口盖的离心管	VWR	21008-178	聚丙烯
一次性/带刻度/锥形/无菌 15 ml 带螺口盖的离心管	VWR	21008-103	聚丙烯
CELLSTAR 细胞培养处理 T-25 培养瓶，带滤膜瓶盖	Greiner Bio-One	690175	聚苯乙烯
CELLSTAR 细胞培养处理 T-75 培养瓶，带滤膜瓶盖	Greiner Bio One	658175	聚苯乙烯
CELLSTAR 10 ml 纸/塑料包裹的血清学移液管	Greiner Bio One	607180	聚苯乙烯
CELLSTAR 2 ml 纸/塑料包装血清学移液管	Greiner Bio One	710180	聚苯乙烯
CELLSTAR 5 ml 纸/塑料包裹的血清学移液管	Greiner Bio One	606180	聚苯乙烯
CELLSTAR 25 ml 纸/塑料包裹的血清学移液管	Greiner Bio-One	760180	聚苯乙烯
1 cm 比色皿	N/A	N/A	聚苯乙烯
CELLSTAR，96孔微孔板，经组织培养处理，黑色，带盖 96孔板	Greiner Bio One	655086	聚苯乙烯
Combitips	Eppendorf	022266501	聚丙烯/ 聚乙烯