从外周靶向通过伪狂犬病病毒进行跨突触示踪，继而进行霍乱毒素与生物素化葡聚糖胺双标记

摘要

跨突触示踪已成为一种强大的工具，用于通过多突触环路分析调控外周靶标的中枢传出通路。本文介绍了一种利用跨突触伪狂犬病病毒识别并定位功能性脑环路的实验方案，随后结合经典示踪技术，验证该环路中已鉴定神经元群之间的特定连接。

摘要

跨突触示踪已成为一种强大的工具，用于分析通过多突触环路调控外周靶点的中枢传出通路。该方法在脑科学研究中应用最为广泛，通常利用猪源性病原体伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）¹。PRV不会感染包括人类在内的大型猿类，因此主要应用于小型哺乳动物，尤其是啮齿类动物的研究中。伪狂犬病病毒株PRV152表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因，且仅能从感染位点出发，逆向跨过功能性的突触，沿突触连接的层级序列进行传播^2,3。其他PRV毒株具有不同的微生物学特性，可能在两个方向上传播（如PRV-Becker和PRV-Kaplan）^4,5 . 本实验方案将仅针对PRV152。通过在外周部位（例如肌肉）注射该病毒，可限制病毒通过特定神经元群进入脑内。随后在整个脑组织中观察到的eGFP信号分布模式，即可揭示与最初被感染细胞相连接的神经元。由于伪狂犬病病毒介导的跨突触示踪具有广泛的分布特性，使得在已识别网络中解析特定连接关系变得困难。因此，我们提出一种灵敏且可靠的方法，结合使用生物素标记的葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTb），以验证通过PRV152鉴定出的细胞之间的连接关系。选择辣根过氧化物酶联合DAB（3,3'-二氨基联苯胺）对BDA和CTb进行免疫化学检测，是因为该方法能够有效显示包括远端树突在内的细胞突起结构^6-11。

引言

跨突触示踪 已成为一种强大的工具，用于分析通过多突触环路调控外周靶点的中枢传出通路。该方法在啮齿类动物脑中应用最为广泛，通常利用猪源性病原伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV），尤其是1961年首次报道的减毒株PRV-Bartha¹²。本文介绍一种利用表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的重组伪狂犬病毒株（PRV152）来鉴定特定肌肉或肌群的运动皮层表征的实验方案²。该方法利用嗜神经病毒的特性，即病毒可产生具有感染性的子代病毒，跨过突触感染功能环路中的其他神经元^3,4,13。PRV152与PRV-Bartha为同源株，仅能从感染位点开始，沿突触连接的层级结构逆向跨突触传播^3,5。通过精确控制外周感染位点，可限制病毒仅通过特定亚群的运动神经元进入中枢神经系统。随着病毒依次感染相互连接的神经元链，全脑中eGFP信号的分布模式将揭示出与最初感染细胞相连接的神经元网络。

使用病毒进行神经示踪的另一个优势在于感染细胞内报告蛋白（本例中为 eGFP）的信号放大。这种信号放大提供了较高的灵敏度，使得即使是非常稀疏的投射也能被检测到。例如，在大鼠中利用病毒表达的绿色荧光蛋白发现了一条从须部运动皮层到控制胡须的面神经运动神经元的稀疏投射¹⁴；而以往的研究使用传统的示踪剂但无报告基因扩增系统时，未能发现该投射^11,15。然而，许多病毒示踪载体（包括上述研究中使用的载体）不能跨突触传播，因此限制了其在多突触环路示踪中的应用。

尽管PRV-152的跨突触示踪在识别参与运动环路的细胞网络方面具有显著优势，但其分布特性使得对环路内特定连接的解释变得困难。因此，我们提出一种简单的方法，通过使用生物素化葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTb）进行双重标记，以验证利用PRV-152鉴定出的环路中的特定连接。联合使用BDA和CTb是一种已被广泛认可的方法，用于示踪特定神经元群之间的连接^6-8,11。当两者联合使用时，可通过双色DAB（3,3'-二氨基联苯胺）法在同一组织切片中同时显示两种示踪剂¹⁶。本方案选用高分子量BDA（BDA10kDa），因其可对神经元突起实现精细标记^6,7,9。BDA10kDa的其他优势包括：主要沿顺行方向运输^6-8；可通过离子电泳或压力注射方式递送^6-8；可通过简单的亲和素-生物素化辣根过氧化物酶（ABC）法进行显色检测¹⁷；并可用于光镜或电镜成像^6,7,18。我们选择用辣根过氧化物酶结合DAB对CTb进行免疫化学检测，用于运动神经元的逆行标记，因其能有效显示包括远端树突在内的细胞突起结构^10,19。我们近期应用该方法鉴定了小鼠的发声运动通路，并揭示了从初级运动皮层到喉部运动神经元的稀疏连接，而该连接此前被认为并不存在²⁰。

方案

注意：所有动物实验程序均已通过杜克大学机构动物护理与使用委员会的审查和批准。 & 使用委员会。

1. 伪狂犬病病毒的保存

1. 我们在普林斯顿大学Lynn Enquist博士的实验室获得活病毒（PRV152），滴度为1 × 10⁹ pfu/mL。该病毒的制备方案已有文献报道²。
2. 在BSL-2生物安全柜内将病毒分装为每管20 µl，并在适当的生物安全条件下于-80 °C保存。
3. 在注射前立即解冻一份PRV分装样品。

2. 肌肉注射的手术准备

1. 通过肌肉注射氯胺酮-赛拉嗪（100 mg/kg 氯胺酮；10 mg/kg 赛拉嗪）诱导全身麻醉，并使用异氟烷维持适当的麻醉深度。
2. 使用眼用软膏保护角膜。
3. 按照无菌技术准备手术区域：剪除毛发，并使用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭消毒手术部位（至少3个循环）。 务必使用无菌巾覆盖手术区域。在整个操作过程中须严格遵守无菌技术。
4. 做皮肤切口，暴露目标肌肉。例如，要暴露环甲膜喉肌，需先移除覆盖其上方的胸骨舌骨肌部分组织。
5. 使用VetBond组织粘合剂封闭任何被切断的肌肉。

3. 将PRV注射至肌肉

1. 使用解冻后的PRV溶液填充10 µl NanoFil微量注射器系统，安装34 G不锈钢针头，并小心将其固定在立体定位仪上。
2. 缓慢清除死腔，并确认溶液从微量注射器尖端流出。将废液作为生物危害废物丢弃。
3. 使用立体定位微操作装置，将微量注射器针尖小心插入目标肌肉，并缓慢注射至肌肉出现轻微肿胀。注射速度需根据肌肉大小和注射体积进行调整。例如，分五次注射，每次200 nl （1 µl 以4 nl/sec的速度注射（总量）两次，每次间隔1分钟，注射位置相同，以填充环甲肌。将注射器移至下一个目标肌肉（本例中为侧环杓关节肌），重复注射操作。每块肌肉仅穿刺一次。
4. 五分钟后收回微量注射器。
5. 使用VetBond组织粘合剂封闭筋膜的切口。
6. 所有注射完成后，使用 VetBond 组织粘合剂闭合伤口。根据您所在机构的动物使用指南，也可使用缝线或伤口夹闭合。 
7. 监测动物直至其恢复胸卧位，并根据机构动物使用指南的要求提供镇痛、食物、水和护理。
8. 在实验确定的存活时间后（本实验中为90小时，用于标记2^nd 通过戊巴比妥过量处死动物，随后经心脏灌注0.9%生理盐水，接着灌注0.1 M PBS中的4%甲醛溶液。
9. 取出脑组织，用4%甲醛固定24小时。
10. 在含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液中对脑组织进行冷冻保护，时间至少48小时。

4. eGFP 的免疫化学检测

1. 使用滑动式切片机将组织切成40 µm厚的切片，并将漂浮切片保存于0.1 M PBS中。当对贴片切片进行染色时，可使用较薄的切片（例如30 µm）。
2. 将切片置于含0.3% H₂O₂的PBS中避光孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。
3. 用VECTASTAIN Elite试剂盒（VE试剂盒）中的正常山羊血清，在含0.3% Tween 20的PBS中室温孵育30分钟，以封闭切片中的非特异性抗原位点。
4. 将封闭后的切片在室温下与兔抗eGFP一抗（1:1,000稀释）孵育3.5小时。
5. 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在室温下与VE试剂盒中的山羊抗兔二抗孵育1小时。
6. 根据生产商说明书，配制VE试剂盒中的ABC溶液。
7. 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在室温下与VE试剂盒提供的ABC溶液反应1小时。
8. 用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟，随后在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.05% DAB（3,3'-二氨基联苯胺）和0.015% H₂O₂，显色反应8分钟。
9. 将切片贴附于SuperFrost Plus载玻片上，并依次通过梯度乙醇（70%、95%、100%、100%，各5分钟）脱水。
10. 用二甲苯清洗两次（每次5分钟），然后使用Permount封片介质封片。
11. 在显微镜下观察贴片后的切片。细胞内的DAB反应产物应呈棕色。数字化图像可进行颜色反转处理，以突出显示细微结构。

5. 通过PRV示踪发现脑区后进行示踪剂注射的手术准备

1. 通过肌内注射氯胺酮-赛拉嗪（100 mg/kg 氯胺酮；10 mg/kg 赛拉嗪）诱导全身麻醉，并使用异氟烷维持适当的麻醉深度。
2. 使用眼用软膏保护角膜。
3. 将头部固定在合适的立体定位仪上。
4. 按照无菌技术准备手术区域，修剪毛发，并用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭消毒（至少3个循环）。
5. 做头皮切口，并将皮肤向后牵拉，暴露目标脑区。
6. 在相应的立体定位坐标处进行小范围开颅。例如，在成年小鼠中通过PRV示踪确定的与喉部相连的运动皮层坐标为前囟外侧1.2 mm、前囟头侧0.2 mm。

6. 向脑内注射生物素化葡聚糖胺

1. 通过将25 mg BDA（10,000 MW）溶解于333 µl无菌生理盐水中，制备7.5%的生物素化葡聚糖胺（BDA）溶液。
2. 向Nanoject II微量注射系统中加入足量的BDA溶液，以满足计划中的注射需求。
3. 缓慢排空死腔，并确认溶液正从微量移液管尖端流出。
4. 使用立体定位微操装置，小心地将微量移液管尖端插入目标脑区，并缓慢注射BDA。根据待标记区域的大小调整注射速率。例如，为覆盖成年小鼠与喉部相连的运动皮层，应在四个不同位置（前后方向相距0.2 mm）进行共12次、每次4.6 nl 的注射。最终注射体积应根据目标脑区的大小进行调整，需注意标记物可能通过脑组织扩散或沿标记神经元的突起传播而从注射核心区域扩散开来。
5. 使用牙科水泥封闭颅骨开窗部位，并用VetBond组织粘合剂闭合头皮切口。
6. 持续监测动物直至其恢复胸卧位，并根据所在机构的动物使用指南要求提供镇痛、食物、水及其他护理。

7. 霍乱毒素B亚基向肌肉的注射

1. 通过将 1 mg 霍乱毒素亚基 b（CTb）溶解于 100 µl 无菌生理盐水中，制备 1% 的 CTb 溶液。
2. 在向脑内注射 BDA 后第六天，按照上述 PRV 注射至肌肉的方法进行手术准备。
3. 用 CTb 溶液填充 10 µl NanoFil 微量注射系统，安装 34 G 不锈钢针头，并小心地将其固定在立体定位仪上。
4. 按照先前 PRV 注射所述方法，对目标肌肉进行微量注射。
5. 监测动物直至其恢复胸卧位，并根据所在机构的动物使用指南提供镇痛、食物、水及其他必要护理。
6. CTb 注射后第三天，通过过量戊巴比妥麻醉处死动物，随后经心脏灌注 0.9% 生理盐水，接着灌注 0.1 M PBS 中的 4% 甲醛溶液。
7. 取出脑组织，并在 4% 甲醛溶液中后固定 24 小时。
8. 将脑组织置于含 30% 蔗糖的磷酸盐缓冲液中，进行冷冻保护，时间不少于 48 小时。

8. 同一组织切片中 BDA 与 CTb 的检测

1. 使用切片机将组织切成40 µm厚的切片，并将漂浮切片保存于0.1 M PBS中。
2. 将切片置于含0.3% H₂O₂的PBS中避光孵育30分钟以淬灭内源性过氧化物酶活性。
3. 根据VE试剂盒说明书配制ABC溶液。
4. 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在ABC溶液中室温孵育1小时。
5. 用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟，随后在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中显色8分钟，缓冲液中含0.05% DAB（3,3'-二氨基联苯胺）、0.015% H₂O₂和0.05%氯化镍。细胞内的DAB反应产物应呈黑色。
6. 将切片在含0.3% Tween 20和VECTASTAIN Elite试剂盒中提供的正常兔血清的PBS中封闭30分钟。
7. 将封闭后的切片与山羊抗CTb抗体（1:10,000稀释）在室温下孵育2小时。
8. 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在室温下与VE试剂盒中的兔抗山羊二抗孵育1小时。
9. 根据VE试剂盒说明书配制ABC溶液。
10. 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在ABC溶液中室温反应30分钟。
11. 用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟，随后在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中显色最多8分钟，缓冲液中含0.05% DAB（3,3'-二氨基联苯胺）和0.015% H₂O₂。细胞内的DAB反应产物应呈棕色。
12. 将切片贴附于SuperFrost Plus载玻片上，并依次通过梯度乙醇（70%、95%、100%、100%，各5分钟）脱水。
13. 用二甲苯清洗两次（每次5分钟）以透明化切片，然后使用Permount封片介质封片。
14. 在显微镜下观察封片后的切片。

结果

在将PRV152注射至肌肉后约72小时，初级运动神经元中应开始出现微弱的eGFP荧光信号。病毒的复制及跨突触运输具有滴度和时间依赖性⁴注射后约90小时，eGFP染色将显示出强烈的信号^nd 延长感染细胞的存活时间将揭示 3^rd 以及更高级的细胞，但PRV在接种后约5天具有致死性，限制了存活时间。

图1a 显示了在将PRV152注射到七块喉肌中的两块肌肉后94小时，支配喉部的疑核中表达eGFP的PRV152感染神经元。由于病毒通过支配受感染肌肉的神经元进入脑内，其他发声运动神经元群，如舌下神经核，不表达eGFP（图1b）。

图2 显示病毒向2的逆行运输^nd 在初次感染后，脑干神经元按顺序被感染，累及疑核。注射为单侧进行，脑干中呈现的标记模式显示同侧疑核和孤束核被感染。图2a）。网状中间神经元也被感染，并对eGF...

讨论

在设计使用PRV152的实验时，必须考虑若干问题^4,21。最重要的是，伪狂犬病病毒具有致死性。如前所述，包括人类在内的灵长类动物对感染不敏感，但仍需采取适当措施以保护其他动物。成年小鼠在接种减毒PRV152毒株后通常可存活5至7天。因此，PRV152不适用于需要超过一周存活时间的实验。此外，感染动物在存活期间通常会表现出疾病症状，从而限制了PRV152在需要观察正常行为实验中的应用。

此外，PRV152 可触发细胞毒性免疫反应²²由于病毒的复制和传播具有滴度和时间依赖性⁴，通过免疫化学方法检测病毒蛋白或eGFP报告基因所揭示的神经元分布模式，会随着细胞感染进程在存活期间内发生动态变化。接种后5天，肌肉中^rd 或 4^th 次级神经元可能被检测到，但最早感染的神经元可能已发生凋亡。因此，每项研究都应通过实验确定最佳存活时间。建议进行时间序列分析，以确定感染在神经环路中的传播进程，并确定标记特定目标神经元的最佳时间点，同时避免细胞或动物死亡的风险。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/材料名称	公司	目录编号	备注
NanoFil 显微注射系统	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G 选项
立体定位仪	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II 自动纳升级注射器	Drummond Scientific Company	3-000-204
滑动式切片机	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
异氟烷（Forane）	Baxter	1001936060
碘伏棉签棒	Cardinal Health	2130-01	200 根装
Permount 封片介质	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
生物素化葡聚糖胺	Invitrogen	D-1956	分子量 10,000
伪狂犬病病毒	普林斯顿大学 Lynn Enquist 博士实验室	PRV152	滴度 >1 × 107
抗霍乱毒素 B 亚基（山羊来源）	List Biological Laboratories	703
霍乱毒素 B 亚基	List Biological Laboratories	103B
抗 eGFP 抗体	Open Biosystems	ABS4528
3,3'-二氨基联苯胺	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg 片剂
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	200 证明
甲醛	Sigma-Aldrich	F8775	稀释至 4%
过氧化氢	Sigma-Aldrich	H3410	30%
盐酸氯胺酮 & 盐酸赛拉嗪	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
氯化镍	Sigma-Aldrich	339350
磷酸缓冲液	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M；pH 7.4
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P5493	10×；pH 7.4
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml 剂量
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
吐温 20	Sigma-Aldrich	P1379
二甲苯	Sigma-Aldrich	534056	组织学级
VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒	Vector Laboratories	PK-6101（兔）；PK-6105（山羊）
Optixcare 眼科软膏	Vet Depot	1017992