本文介绍了一种利用Illumina Infinium检测技术进行大规模基因分型的实验方案。该技术可在三天内对数百个DNA样本中的数百万个单核苷酸多态性（SNP）位点进行可靠地基因分型。所获得的基因型数据可用于分析其与多种不同疾病或表型之间的关联性。
本文内容
摘要
摘要
对人类基因组中的基因型变异进行分型已被证明是识别基因与表型关联的有效方法。变异在家族或人群中的分布有助于发现疾病的遗传因素。Illumina 的基因分型 BeadChip 芯片组合使研究人员能够对大量 DNA 样本中的数千至数百万个单核苷酸多态性（SNP）或其他基因组变异（如拷贝数变异）进行分型分析。这些 SNP 可分布于全基因组范围，也可集中于特定区域，以最大化潜在的发现能力。Infinium 检测技术经过优化，能够快速获得高质量且准确的结果。在适当的操作条件下，单名技术人员每周可处理数百至一千多个 DNA 样本，具体数量取决于所使用的芯片类型。该检测流程引导用户完成从基因组 DNA 起始直至芯片扫描的每一个步骤。利用专有试剂，样本经过扩增、片段化、沉淀、重悬、与芯片杂交、单碱基延伸、染色，最后在 iScan 或 Hi Scan 高分辨率光学成像系统上进行扫描。DNA 扩增需要一个过夜步骤，该过程通过全基因组等温扩增实现，DNA 先行变性，因此无需 PCR。样本与芯片的杂交在第二个过夜步骤中完成。到第三天，样本即可进行扫描和分析。扩增后的 DNA 可大量储存，使得 bead 芯片可在每周每一天进行处理，从而最大化通量。
引言
单核苷酸多态性（SNP）分型是识别与疾病相关风险变异的关键方法。传统上，基因分型实验的规模受限于可用技术。基于凝胶电泳的基因分型方法在样本通量和SNP通量方面均存在局限性。[1]开发这些检测方法通常费时费力，其优化过程依赖于变异位点周围区域的组成和结构[1]TaqMan基因分型检测由Life Technologies开发，能够快速处理大量样本，且所需技术人员操作较少[2]，但单核苷酸多态性（SNP）多重检测的限制仍使得每日可完成的基因型分析总数远低于一百万[3,4]Sequenom 的 iPlex 平台也可同时运行多个样本，但由于每次多重检测的 SNP 数量少于一百个，整体通量相对较低[5]贝克曼库尔特的SNP stream技术理论上每天可产生超过三百万个基因型，但该技术将每个反应的检测范围限制在最多仅48个SNP[4,6]尽管GoldenGate检测方法每天可处理近两百个DNA样本，且每个样本可检测数百至数千个SNP位点，但在一次性分型超过三千个SNP时，其每基因型检测成本与先进的超高通量技术相比缺乏竞争力。[4,7]为了每天处理数百万个基因型（达到大规模全基因组关联研究所需的规模），芯片杂交检测已成为市场上最具成本效益的选择。
Affymetrix 的杂交芯片系列和 Illumina 基于 Infinium 技术的芯片系列可实现并行检测数百个样本，每个样本涵盖数十万至数百万个单核苷酸多态性（SNP）位点[4,8]。这些 SNP 可分布于整个基因组，也可定位于特定兴趣区域（如外显子组），或根据用户需求进行定制。此类芯片不仅能够对每个样本同时准确地进行多达一百万个 SNP 的基因分型，还可用于检测拷贝数变异，从而可能揭示染色体异常。目前，基于 Infinium 技术的 OMNI BeadChip 芯片每天可对近一百个样本进行检测，每个样本最多可完成近五百万个标记的基因分型，其中包括五十万个自定义位点。
由于大多数疾病都具有遗传成分，这些大规模实验在发现与疾病相关的基因方面可能至关重要。高通量基因分型能够高效地生成足够大样本集的基因型数据，从而有力地检测到低次要等位基因频率下的遗传关联。全基因组基因分型项目可用于定位在病例组与对照组之间具有统计学显著性差异的等位基因频率或拷贝数变异区域[9,10,11]根据美国国家人类基因组研究所的数据，在2008年11月25日至2013年1月25日期间，全基因组关联研究（genome-wide association studies）共促成了1,490篇独立发表的论文，这些研究源于发现了8,283个p值小于1 × 10⁻⁸的单核苷酸多态性（SNPs）。-5 (参见 http://www.genome.gov/gwastudies/). 这些研究涵盖了从身高到睾丸癌等多种性状和疾病，得益于全基因组分析所提供的广泛研究视角。在这些案例中，如果分型范围过于局限，某些重要的基因组区域可能会被遗漏。因此，在大规模关联分析中，全基因组分型技术是首选方法。
存在多种不同版本的Infinium检测方法，每种均专用于特定类型的芯片阵列。下文将详细讨论的InfiniumUltra检测适用于多种含12或24个样本的芯片阵列。这些芯片通常可对每个DNA样本进行十余万个单核苷酸多态性（SNP）位点的基因分型，并聚焦于特定靶向区域，例如外显子组或定制面板。对于其他类型的芯片，例如全基因组基因分型芯片，则可能需要使用其他版本的检测方法。然而，由于所有Infinium检测均基于共同的技术原理，通常仅在试剂名称、试剂体积或确切的染色试剂操作步骤上有所差异，因此在某一检测版本中优化完善的技术通常可普遍适用于其他版本。此外，其他类型的阵列（如甲基化芯片阵列）也可能采用几乎完全相同的实验流程。必须注意，仅可使用与当前所用芯片类型相匹配的检测版本。某些特定类型的检测，例如用于测定基因表达水平的检测，可能需要采用非Infinium的实验方案。
样本必须分批处理。例如，使用InfiniumUltra检测时，预杂交试剂管中的体积仅够运行96个样本，且试剂管不能再次冷冻。因此，样本必须每次以96个为一批进行处理。样本将在第一天进行扩增。经过约1小时的台面操作后，样本需在对流烘箱中加热20-24小时。第二天，大约需要4小时完成样本的片段化、沉淀和重悬操作，此后样本可选择冷冻保存以备后续使用，或直接杂交至芯片上。加载芯片过程耗时近2小时，随后样本将在芯片上杂交过夜，持续16-24小时。第三天，染色和延伸步骤耗时约4小时。之后还需约1小时完成芯片的洗涤、包被和干燥。最后，对芯片进行扫描，扫描时间根据所用芯片类型的不同，每张芯片可能需要15-60分钟。
标准实验室安全与清洁预防措施适用。尽管扩增过程不基于PCR，但仍需设置独立的工作站用于扩增前操作 扩增前和扩增后的操作步骤均需严格执行，以尽量降低污染风险。所有试剂盒提供的试剂在使用时，其识别编号必须记录在追踪表上。试剂应在使用前立即解冻，并在分装前轻轻颠倒混匀数次。待分型的DNA必须为高质量的基因组DNA（A260/A280吸光度比值为1.6–2.0，A260/A230吸光度比值低于3.0），通过标准方法提取，并使用荧光计进行定量。DNA降解常是导致检测结果质量低下的重要因素。通常需要200 ng DNA，但具体用量可能因芯片类型而异。Tecan液体处理机器人可自动化完成本实验方案中的多个步骤，从而最大限度减少人为误差。
方案
第一天
1. 准备
- 将 200 ng DNA 加入深孔 96 样本板中。必须至少处理 96 个样本（整板）以确保不浪费试剂。使用试剂盒提供的条形码贴纸标记板子，并进行离心。
- 为使体积均一，将样本置于抽屉或通风橱中过夜，使液体蒸发。用盖子或纸巾 loosely 覆盖板子，以防灰尘进入。
2. 扩增
警告：除非第二天有4小时可用于片段化、沉淀和重悬步骤，否则样品不应进行扩增。
- 从-20 °C冰箱中取出公司提供的标有"Pre"的盒子或管子套装（每96个样本使用一支MA1、一支MA2和一支MSM即足够）。将MA2和MSM管置于实验台上解冻。打开已校准的烘箱并设定温度为37 °C。
- 使用试剂槽和10 µl八通道移液器，向每个孔中加入4 µl DNA重悬缓冲液以重新水合样本。若操作小心避免接触液体，则每次移液无需更换吸头。
- 使用八通道移液器，向板的每个孔中加入20 µl MA1。每更换一种试剂时，使用新的试剂槽。用可重复使用的密封膜封板，短暂离心后在微孔板振荡器上以1,600 rpm涡旋振荡1 min 。
- 2.4) 在室温下孵育至少30分钟。
- 向板的每个孔中加入4 µl 0.1 N NaOH。用可重复使用的密封膜封板，短暂离心后在1,600 rpm下涡旋振荡1 min 。
- 在室温下孵育10分钟。
- 向板的每个孔中加入34 µl MA2。
- 向板的每个孔中加入38 µl MSM。用可重复使用的密封膜封板，短暂离心后在1,600 rpm下涡旋振荡1 min 。
- 将板放入烘箱中孵育20–24小时。
第二天
3. 片段化
- 从 "Post-1" -20 °C 冰箱中取出 FMS 管（每 96 个样本使用一管即可）。在实验台或室温水浴中解冻。将 MIDI-板插件放入台式微样品孵育系统后，打开加热模块并设置温度为 37 °C。
- 待 FMS 管完全解冻后，从烘箱中取出样本板并瞬时离心。向 DNA 板的每个孔中加入 25 µl FMS。盖上盖子，瞬时离心，然后在 1,600 rpm 条件下涡旋振荡 1 分钟。
- 将板置于加热模块中孵育 1 小时。
4. 沉淀
- 从 "3期后" 4 °C 冷藏或保温运输，并恢复至室温（每 96 个样本使用一管即可）。从加热块中取出反应板，瞬时离心。
- 向板的每个孔中加入 50 µl PM1。盖上盖子，短暂离心，然后在 1,600 rpm 条件下涡旋振荡 1 分钟。
- 将培养板置于加热块中孵育5分钟。
- 从热块上取下反应板，关闭热块，并丢弃板盖。向每孔中加入155 µl 100%异丙醇。用新的盖子盖紧，并手动反复倒置反应板以混匀。
- 将培养皿置于 4 °C 环境中至少 30 分钟。开启冷冻离心机并设置为 4 °C 预冷。
- 将平板平衡后，于 4 °C 离心 20 分钟 在 3,000 × g 条件下。
- 检查培养板底部，不要倒置，确认样本已沉淀为蓝色沉淀物。若未见沉淀物，则再次离心。准备纸巾。
- 弃去盖子，将培养板迅速倒置，用力在铺有纸巾的实验台面上敲击，以去除液体。倒置培养板后，只要仍有液体存在，就需注意避免将其重新正放。反复敲击培养板直至所有液体完全去除。
- 将培养板倒置放在试管架上晾干，在室温下孵育1小时。
5. 重悬
- 从 "Post-2" -20 °C 冰箱中取出 RA1，在室温水浴中解冻。打开烘箱并将其温度设置为 48 °C。
- 解冻后，将 23 µl RA1 分装至样品板的每个孔中。不要将整瓶 RA1 倒入容器中；保留 30 ml 以备后续使用。如果样品将在当天稍后进行芯片杂交，则将 RA1 置于 4 °C 冷却容器中；如果样品将在以后日期使用，请标记瓶身并将 RA1 重新冷冻保存。
- 使用新的密封盖对板进行热封。短暂离心板后，将其放入烘箱中孵育 1 小时。
- 从烘箱中取出板，以 1,800 rpm 涡旋振荡 1 分钟。
样品在此阶段可安全保存长达一周时间。可根据需要批量储存板或重新排列样品，为 bead chip 应用做准备。若继续后续操作，请将板置于室温并打开加热模块；否则，将板储存在 -20 °C 环境中。
6. 杂交
警告：除非第二天有 5.5 小时可用于染色和洗涤步骤，否则样品不应进行杂交。
- 打开加热模块并将其温度设置为 95 °C。打开烘箱并将其温度设置为 48 °C。
- 待温度稳定后，将反应板置于加热模块上孵育 20 分钟。
- 在反应板变性的同时，从 4 °C 取出珠芯片盒并放置于实验台。取一瓶 XC4（来自室温试剂盒），加入 330 ml 的 100% 乙醇，充分震荡混匀，并在室温下孵育过夜。配制甲酰胺/EDTA 混合液（95% 甲酰胺，0.2% EDTA（0.5 M），4.8% H2O，按体积计），分装至 15 ml 离心管中并冷冻保存。多余的甲酰胺可储存备用。
- 从加热模块上取出样本板，在室温下孵育 30 分钟。
- 在反应板冷却期间，准备杂交室。每处理四张珠芯片需准备一个杂交室。
将橡胶垫放置在杂交室底座顶部，使较厚的孔与底座前端对齐。底座上蚀刻的条形码符号应保持可见（见图 2）。 - 使用 1,000 µl 移液器，向底座上八个加湿储液槽中各加入 400 µl PB2。PB2 可在"Post-3"盒或包装中找到。将杂交室盖子盖到底座上，并先关闭对角线两侧的两个卡扣以固定两端。
- 从各自的盒子中取出单个银色包装的珠芯片，但为尽量减少芯片暴露于空气和光照，暂不打开包装。仔细扫描芯片的条形码，并在追踪表上记录其加载顺序以及对应的盒子编号。必须清楚了解每个单独的 DNA 样本将在珠芯片上的具体位置进行点样。
- 从各自的盒子中取出单个银色包装的珠芯片，但为尽量减少芯片暴露于空气和光照，暂不打开包装。仔细扫描芯片的条形码，并在追踪表上记录其加载顺序以及对应的盒子编号。必须清楚了解每个单独的 DNA 样本将在珠芯片上的具体位置进行点样。
- 在 30 分钟 冷却即将结束前，打开银色珠芯片包装。将芯片从透明塑料护套中取出。在不接触微珠的前提下，将每张珠芯片放置于杂交室插件上，使芯片上的条形码与插件顶面蚀刻的条形码符号对齐。
- 撕下并丢弃样本板的密封盖。从样本板中吸取 15 µl 样本，缓慢加入芯片阵列的进样口（见图 3）。必须格外注意确保将正确的样本以正确的顺序点样至对应的珠芯片上，与先前记录的芯片顺序一致。可使用多通道移液器向芯片加样，但需预先规划，仅吸取能够安全加载至珠芯片上的样本数量，因为样本板的行数并不总与芯片的行数匹配。
- 当所有样本均已被点样至相应阵列后，目视检查芯片是否存在气泡或未被液体覆盖的区域。若发现问题，可轻轻摇动插件。如有必要，可向阵列补充液体，注意必须添加正确的 DNA 样本。
- 打开杂交室，将插件放置在加湿储液槽上方。芯片的条形码应与杂交室底座上蚀刻的条形码对齐。盖上杂交室盖子，并先关闭对角线两侧的两个卡扣，再关闭其余两个卡扣。
- 将杂交室放入烘箱中孵育 16–24 小时。移动杂交室时需注意避免倾斜。
- 若需处理多个样本板，请返回步骤 6.2。为降低处理大量耗材或芯片时出现人为错误的风险，并减少后续步骤中芯片暴露于空气的时间，建议每日处理的珠芯片数量不超过 24 张。一瓶 XC4 足以用于最多 24 张珠芯片的处理。
第三天
7. 染色准备
- 从烘箱中取出杂交室，在室温下孵育25分钟。若同时处理两个以上的杂交室，应每隔10分钟分批取出两个。为防止芯片干燥，暂勿打开杂交室。
- 当杂交室冷却时，从 "Post-1" -20 °C冰箱中取出并置于实验台解冻。从 "Post-2" 置于 -20 °C（若为前一日使用过的试剂则置于 4 °C）保存，并在室温下解冻 水浴。同时解冻一管95%的甲酰胺。每处理8个微珠芯片，需准备每种试剂各两管，即10 ml RA1和15 ml 需要甲酰胺和150 ml XC3（存放于室温条件下公司提供的盒中）。
- 每处理一个芯片，需要准备一片玻璃载片、一个塑料流槽支架、两个金属夹子和一个塑料间隔片。塑料间隔片须使用透明的，将不透明的间隔片分离并丢弃。此外，还需要两个微珠芯片清洗皿和一个微珠芯片托盘，以及一个液体组装站和一个塑料组装条。
- 用乙醇喷洒玻璃载玻片，然后擦拭至干燥。
- 打开连接至流通室支架的热水浴装置，并将其温度设置为 44 °C。轻轻摇动室支架，以去除任何气泡。
- 当杂交室冷却25分钟后，用PB1填充洗涤皿（约200 ml）。PB1可在 "Post-4" 室温箱
- 打开一个杂交腔室。用手捏住微珠芯片封条的一角，沿对角线方向轻轻剥离封条（参见 图4)。一旦移除密封，立即将芯片放入微珠芯片托盘中，并浸入PB1溶液，注意不要触碰微珠。重复此步骤直至托盘装满微珠芯片，注意避免任何芯片干燥。
- 轻轻振荡托盘以去除气泡，并使芯片浸没1分钟。用PB1填充第二个洗涤皿。再次振荡托盘。
- 将珠芯片托盘移入第二个洗涤皿中。轻轻振荡后静置浸泡1分钟，然后再次振荡。
- 在液体流经式组装站中，将四个黑色塑料流经式支架放入凹槽内。加入 PB1 缓冲液，直至液面接近八个组装支架的高度（约 150 ml）。
- 从托盘中取出一个微珠芯片，将其放入塑料流通支架的组装工位中。芯片上的条形码应与组装工位上刻蚀的条形码符号对齐。对可容纳于该组装工位的其余三个芯片重复此操作。
- 在珠芯片上放置一个透明塑料垫片，垫片的外边缘应包围组装站内的支架。对浸没在PB1中的其他芯片重复此步骤。
- 将塑料组装条放入组装工位，使其卡入凹槽中。将一张载玻片轻轻放置在塑料间隔片上方，先将载玻片后端抵住组装条，再缓慢将前端向下放入液体中。载玻片顶部的凹槽应朝下，正对芯片条形码上方，使珠芯片与载玻片在条形码端之间留有间隙。对PB1中浸泡的其他芯片重复此操作。完整的流通式组装示意图参见 图5.
- 检查芯片与载玻片之间是否有气泡。若出现气泡，可轻轻抬起条形码端的载玻片，重新操作。若气泡持续存在，可用实验室纸巾（Kimwipe）从玻璃表面轻轻擦拭去除。
- 在玻璃载片周围卡上两个金属夹，一个靠近条形码端，另一个靠近尾端。夹子的边缘应夹住芯片下方的塑料流通支架。对浸没在PB1中的每张芯片重复此操作。
- 移除已完成的流穿组件，并水平放置在实验台上。注意不要将组件垂直倾斜，以免载玻片下方的液体逸出。如果清洗托盘中还有待处理的芯片，可在同一PB1下继续组装。若其他芯片仍位于其原始杂交腔中，则弃去装配站及清洗皿中的所有液体，并返回步骤7.6。
- 将所有珠芯片装入其流路组件后，取一把外科剪刀，尽可能靠近玻璃载片处，剪掉两端的间隔物。
8. 染色与延伸
- 使用温度探针在多个位置确认流通室支架已达到 44 °C。如果温度偏差超过 0.5 °C，应调节水浴温度。
- 将珠芯片流通组件滑下并钩住顶部支架，放置到室架上。珠芯片的背面应紧贴室架，玻璃片应朝外，顶部凹槽形成试剂储液槽。对每个珠芯片组件重复此操作。
- 使用 200 µl 移液器，将 150 µl RA1 加入流通组件的玻璃储液槽中。孵育 30 秒。重复 5 次。
- 使用 1,000 µl 移液器，将 450 µl XC1 加入流通组件的玻璃储液槽中。孵育 10 分钟。
- 将 450 µl XC2 加入流通组件的玻璃储液槽中。孵育 10 分钟。
- 将 200 µl TEM 加入流通组件的玻璃储液槽中。孵育 15 分钟。
- 将 450 µl 95% 甲酰胺/EDTA 混合液加入流通组件的玻璃储液槽中。孵育 1 分钟。重复 1 次。
- 将流通组件孵育 5 分钟。
- 将热水浴温度设置为 STM 管上标注的温度（若无标注则设为 37 °C）。确保每支 STM 管标注的温度相同。
- 向流通组件中加入 450 µl XC3，加入玻璃储液槽中。孵育 1 分钟。重复 1 次。
- 当热水浴温度达到设定温度后，向流通组件中加入 250 µl STM，加入玻璃储液槽中。孵育 10 分钟。
- 向流通组件中加入 450 µl XC3，加入玻璃储液槽中。孵育 1 分钟。重复 1 次。
- 将流通组件孵育 5 分钟。
- 向流通组件中加入 250 µl ATM，加入玻璃储液槽中。孵育 10 分钟。
- 向流通组件中加入 450 µl XC3，加入玻璃储液槽中。孵育 1 分钟。重复 1 次。
- 将流通组件孵育 5 分钟。
- 向流通组件中加入 250 µl STM，加入玻璃储液槽中。孵育 10 分钟。
- 向流通组件中加入 450 µl XC3，加入玻璃储液槽中。孵育 1 分钟。重复 1 次。
- 将流通组件孵育 5 分钟。
- 重复步骤 8.14 至 8.19 一次。
- 从室架上取下流通组件，并关闭水浴。
9. 清洗与封固
- 用PB1填充染色珠芯片清洗皿（约315 ml）。需要两个垂直清洗皿和一个垂直珠芯片托盘，以及至少一个真空 manifold。
- 通过将细金属棒插入夹具与支撑架之间并旋转，拆卸流式组件。取下玻璃载片并取出珠芯片。立即将珠芯片放入垂直珠芯片托盘中，并浸入PB1中。对每个流式组件重复此操作，注意使所有珠芯片朝向一致，并尽量减少其暴露于空气中的时间。
- 轻轻振荡珠芯片托盘以去除气泡。将浸没的珠芯片在PB1中孵育5分钟。用前一天配制的XC4填充第二个垂直清洗皿。再次振荡珠芯片托盘。
- 将珠芯片托盘转移至盛有XC4的清洗皿中。轻轻振荡托盘以去除气泡。孵育5分钟 ，再次振荡。
- 以连贯的动作将珠芯片托盘从清洗皿中取出，放置于试管架上，确保每张珠芯片上的微珠面朝上。使用自锁镊子将一张珠芯片从托盘中滑出，并置于试管架上。对每张珠芯片重复此操作。
- 小心将装有芯片的试管架转移至真空干燥器中。关闭并启动真空，确保密封良好。孵育50–55分钟。如有需要，可在孵育期间预热扫描仪。
10. 扫描
- 关闭真空泵，缓慢恢复压力至大气压。检查微珠芯片是否干燥。如有必要，用纸巾擦拭芯片的边缘和底部，以去除任何液体或碎屑。
- 启动扫描软件，将微珠芯片移至扫描托盘。通过启动解码文件客户端软件，并输入目标微珠芯片的条形码及其对应的盒子编号，下载芯片的解码文件（dmaps）。未扫描的微珠芯片可在干燥、避光环境中安全保存最多72小时。
- 待芯片正确放置于托盘中且软件已识别解码文件后，开始扫描。
结果
经过正确处理的微珠芯片在扫描时应显示出明亮且清晰的红色和绿色激光光强信号。图6中，iScan 扫描软件显示了一个标准基因组 DNA 样本成功杂交至定制面板 SNP 分型芯片的结果。在延伸和染色步骤中连接上的标记核苷酸，在两种激光照射下会产生荧光。由于这些核苷酸会选择性地延伸与片段化 DNA 链杂交的微珠上寡核苷酸链，且寡核苷酸链设计为在变异位点处终止，因此可通过检测产生的信号颜色和强度来确定 SNP 位点处存在的等位基因。
为了将扫描仪输出文件导入GenomeStudio分析软件，需要一份用户生成的样本表，该表将样本编号和临床信息与芯片编号（chipID）及位置相对应，同时还需要直接从公司获得的特定芯片的SNP注释文件。示例样本表可在该公司网站上找到。一旦建立GenomeStudio项目，即可从软件自动生成的强度聚类结果中获取基因型。尽管存在多种显示选项，但默认视图（Norm-R（标准化强度值）相对于Norm-Theta（等位基因强度比值））通常是区分三个独立聚类最直观的图谱。大多数SNP应显示一个、两个或三个聚类，具体数量取决于其次要等位基因频率。
这三个聚类代表表现出AA、AB或BB等位基因的样本（见图7）。这些聚类可通过直接从公司导入标准聚类位置模板、在软件的分析工具栏中选择“对所有SNP进行聚类”，或通过在强度图上点击并拖动彩色圆圈手动编辑分型结果来分配基因型。样本在强度图上的颜色（红色、紫色或蓝色）分别表示分型结果为AA、AB或BB；黑色表示无分型结果。通过滚动软件全数据窗格中列出的SNP，可查看或重新调用每个SNP的聚类情况。一旦聚类获得满意的分型结果，软件的全数据窗格将列出每个特定SNP位点上各个样本的基因型。表格上方的“列选择器”选项可切换不同的数据格式。
数据可以通过分析工具栏或直接从完整数据表中导出，以进行深入分析。
图 1. 概述——Infinium 检测方案。 点击此处查看大图。
图 2. 完整的杂交室底座与垫片，以及盖子。[12] 点击此处查看大图。
图3. 加载BeadChip — 将样品加入入口孔中。[12] 点击此处查看大图。
图 4. 移除 Beadchip 封片——抓住封片一角，沿对角线方向轻轻剥离。[12] 点击此处查看大图。
图 5. 完整的微珠芯片流通式组装结构 – 微珠芯片通过垫片与玻璃载片分离，并用夹具固定。 点击此处查看高清图像。
图6. 成功的BeadChip扫描 – A) 使用红色和绿色激光对BeadChip进行扫描；扫描软件同时显示两种信号。在左侧BeadChip图像中，通过强度质控的区域将显示为绿色，未通过强度质控的区域则显示为红色。B) 扫描完成后，软件将红色和绿色信号图像叠加显示，图中为放大后的图像。每个微珠的颜色和信号强度代表其所携带的等位基因。点击此处查看大图。
图7. SNP NORM-R 与 NORM-THETA 聚类图谱 – A) 一个有效的SNP，具有三个明显不同的聚类，分别代表AA、AB和BB基因型，颜色分别为红色、紫色和蓝色。B) 一个需要编辑的SNP。中间本应为纯合子AB的聚类未被调用，而BB聚类被错误地识别为AB。C) 一个表现不佳的SNP。从该强度图中无法获得任何基因型，因为不存在明显的聚类。点击此处查看大图。
讨论
大规模基因分型技术已被用于深入理解多种人类疾病的遗传机制。通过全基因组关联分析发现的任何显著变异均可提示一个候选区域以供进一步研究。此外，基因型数据是测序项目中质量控制的有效工具。
为最大限度提高样本通量，可同时扩增多块样本板，并以片段化后重悬的状态储存。单日内可完成八块板的扩增，通过将多个批次的前24小时实验步骤合并进行，可获得足够支持约2至8天芯片处理的材料。若提前储备已扩增的样本板，并在前一批次扫描开始后立即对新样本进行芯片杂交，则整个处理流程可连续运行，无需因额外的样本制备而暂停。因此，尽管每个样本完成全部检测需三天时间，但每天均可产生新的数据。假设每天处理24块芯片，则在5天工作周内，可在每块含12个样本的微珠芯片上运行超过1,000个DNA样本。然而，若任一操作步骤或试剂出现失败，可能在采取纠正措施前，多个批次均面临性能不佳的风险。错误可能直至芯片扫描或数据分析阶段才会被发现；因此，当通量最大化时，一旦发现问题，可能已有数百个处于不同实验阶段的样本接受了相同的缺陷处理。由于损耗的试剂和数据无法挽回，操作者必须权衡这些风险与加快工作流程的需求之间的利弊。
GenomeStudio 分析软件是首次真正评估基因分型过程成功与否的机会。如果 Norm-R 与 Norm-Theta 强度图能够实现良好的聚类，样本的平均检出率（成功分型的 SNP 总数百分比）应接近 99%，尽管该数值会因芯片类型略有差异。任何检出率低于 85–90% 的样本数据均不可靠，应予以剔除。出于质量控制目的，应尽可能将结果与已知的先前基因型数据进行比对。若无此类数据，有意设置样本重复是验证芯片或板上样本位置的有效手段。这些重复样本对应放置于不同的芯片、板、批次或项目中，并在生成后核对其基因型。尽管具体的质量控制限制条件因研究者偏好而异，常见的 SNP 质控标准通常基于样本检出成功率、哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）或病例组与对照组之间的数据缺失情况，而常见的样本质控标准则通常基于检出率、孟德尔遗传不一致性和 X 染色体杂合性与临床性别数据的交叉比对[13]。
如果出现问题，可将分析套件中的控制面板提交给公司以确定原因。这些对照通常能够将问题缩小至最有可能出错的步骤或试剂。如果通过Infinium基因分型实验发现了任何感兴趣的SNP，应在GenomeStudio中重新检查其强度图谱是否存在聚类错误，然后再进行后续研究。
Infinium 基因分型实验失败通常源于人为操作误差或输入 DNA 质量不佳。样品定量必须准确且精确。为获得最佳结果，添加至任何样品或芯片的所有试剂均须按照方案规定的体积进行分配。移液器必须经过正确校准。试剂不得在过期后使用，且除 RA1 试剂外，解冻后的试剂不得再次冷冻。为尽量减少可能的染色和延伸错误，甲酰胺/EDTA 混合液应每月新鲜配制。所有 -20 °C 保存的试剂仅应存放于手动除霜冰箱中。在染色、延伸和洗涤步骤中使用的所有实验器皿，一旦停用应立即用清水和温和洗涤剂彻底冲洗。杂交舱内的加湿储液槽应使用试管刷和温和洗涤剂刷洗。玻璃载片应按照其用户手册的说明，每周使用 10% 漂白剂清洗一次。
披露
本文作者无任何竞争性财务利益需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）P20 GM103456、NIH RC2 AR058959 和 NIH R56 AI063274 项目的资助
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 耗材或设备 | 制造商 | 货号 | 96个样本所需的最低数量 |
| 0.8 ml 深孔板 | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| 板密封膜 | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| 试剂槽 | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| 热封膜 | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| 流通式间隔器 | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| 移液器吸头 - 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| 移液器吸头 - 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| 移液器吸头 - 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA悬浮缓冲液 | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| 异丙醇（HPLC级） | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| 乙醇（200-proof） | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| 甲酰胺（100%） | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA（0.5 M） | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8通道移液器 | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8通道移液器 | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl 单通道移液器 | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| 微孔板振荡器 | VWR | 13500-890 | 1 |
| 制冷型微孔板离心机 | VWR | BK369434 | 1 |
| 杂交炉 | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex 微量样品孵育器 | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI 加热块插件 | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| 热封仪 | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| 杂交室（含插件和垫片） | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| 手术剪 | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| 流通式组件 | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| 洗涤架和托盘 | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint 染色室架 | Tecan | 760-800 | 1 |
| 温度探头 | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| 染色架和托盘 | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| 自闭合镊子 | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| 真空 manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan 或 HiScan | Illumina | - | 1 |
参考文献
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