快速制备电转感受态Escherichia coli和Vibrio cholerae的实验方案

摘要

电穿孔是一种常用于将DNA导入细菌的转化方法。制备电转感受态细胞的传统方案耗时且劳动强度大。本文介绍了一种替代性的、快速且高效的电转感受态细胞制备方法，目前已被部分实验室采用。

摘要

电穿孔已成为一种广泛应用的方法，可快速高效地将外源DNA导入多种细胞中。对于非天然感受态的原核生物，电转化已成为导入DNA的首选方法。电穿孔是一种快速、高效且流程简化的转化技术，除了需要纯化的DNA和感受态细菌外，还需 commercially available gene pulse controller 和电转杯。与电脉冲步骤相比，制备电感受态细胞的过程耗时较长且劳动强度大，涉及将处于对数中期生长的大体积培养物用无菌冷水或低离子强度缓冲液进行多轮离心和洗涤，且洗涤液体积逐次减少。可通过商业渠道购买电感受态细胞以节省时间和工作量，但可选菌株仅限于常用的E. coli实验室菌株。本文旨在公开一种快速高效的E. coli电感受态细胞制备方法，该方法已在细菌学实验室中使用了一段时间，并可适用于V. cholerae及其他原核生物。尽管我们无法确定该原始技术的发明者，但现将其提供给科学界使用。

引言

自20世纪80年代初问世以来¹，电穿孔已成为分子生物学中一项不可或缺的技术，很可能是将环状或线性核酸转入活细胞的最常用方法。该技术最初用于真核细胞的转染¹，随后被改进用于大肠杆菌（E. coli）的转化^{2, 3}。在细菌学领域，电穿孔已成为实验室标准方法，并已被优化用于转化多种细菌，包括革兰氏阴性菌如假单胞菌属（Pseudomonas）⁴、沙门氏菌属（Salmonellae）⁵、弧菌属（Vibrios）⁶、沙雷氏菌属（Serratiae）和志贺氏菌属（Shigellae）⁷；以及革兰氏阳性菌如梭菌属（Clostridia）⁸、芽孢杆菌属（Bacilli）⁹、乳杆菌属（Lactobacilli）¹⁰和肠球菌属（Enterococci）¹¹。甚至某些古细菌也已被成功通过电穿孔转化，包括甲烷球菌属（Methanococci）¹²和硫化叶菌属（Sulfolobus）物种¹³。有关全面综述，请参见Aune与Aachmann的研究¹⁴。据报道，电穿孔转化效率比化学感受态法或热激法高出10至20倍²。然而，与20世纪80年代由Douglas Hanahan优化的化学感受态细菌制备类似¹⁵，细胞也必须经过特定处理以获得电感受态。

电穿孔是一种快速且高效的细菌转化方法，需要使用电转化感受态细菌、纯化的DNA、提供电脉冲的脉冲控制模块，以及可容纳一次性比色杯的腔室，该比色杯起到电极的作用。简而言之，将冰冷的感受态细菌与质粒DNA混合后，置于比色杯中接受高压电脉冲处理，随后重悬于培养基中，在30–37 °C下孵育30–45分钟，最后接种到含有适当选择性抗生素的半固体培养基（营养琼脂平板）上。

与电穿孔步骤不同，制备电转感受态E. coli仍是一个多步骤过程，传统上需在较大体积中进行。简言之，将过夜培养的细菌接种至锥形瓶中，加入100 ml至1 L的LB（Luria Broth）培养基，培养至对数生长中期（OD₆₀₀ <1.0），随后在4 °C条件下，用无菌非离子缓冲液或双蒸水（ddH₂O）依次以递减体积进行多次洗涤。整个操作过程中必须严格保持细胞处于低温状态，并防止污染。该过程需要使用经高压灭菌的离心管、非离子缓冲液或ddH₂O、摇床培养箱、大容量高速冷冻离心机以及配套转子。最后，将细菌重悬于含10%甘油的小体积缓冲液中，分装为约40 μl每份，储存于-80 °C待用。长期低温保存常因细胞活力随时间下降而导致转化效率降低。

电转感受态细菌细胞也可从多种商业来源获得，但仅限于少数常用作宿主以扩增多种质粒的（通常是重组缺陷型）E. coli 菌株。因此，研究人员依赖于实验室自制方法来制备自身所需的菌株或突变体用于转化。

一种替代的、快速且高效的制备电转化感受态E. coli的方案已被少数分子细菌学实验室使用了一段时间，并已在我们的实验中扩展应用于其他革兰氏阴性菌，如V. cholerae。由于该方案在长期使用中经多位研究人员不断优化，其最初发明者已无法确定。本方法在我们的实验室中已应用近二十年，我们希望与同行分享这一实用的实验方案。

方案

1. 细菌培养物、工具和试剂的准备（第1天，下午）

1. 在傍晚时分，取少量细菌（E. coli 或 V. cholerae）接种于1-5 ml已高压灭菌的LB液体培养基中，接种至无菌的（例如100 x 13 mm）硼硅酸盐玻璃试管内。
2. 将接种后的试管放入置于37 °C环境（恒温房间或培养箱）中的旋转滚筒内，开启滚筒并调至高速，过夜培养（O/N）。
3. 使用玻璃棒制备呈“曲棍球棒”形状的涂布棒：将玻璃棒中部置于本生灯火焰中加热至软化，用镊子或钳子轻轻将其弯成135°角；再次在玻璃棒末端与第一个弯折点之间的中点加热，并向内（与第一个弯折方向相反）弯成45°角。
4. 制备不含抗生素的LB琼脂培养基，倒入培养皿中，用于后续电转化感受态细胞实验；另制备含有适当抗生素的LB琼脂平板（根据待电转化载体上的抗性标记选择抗生素），于4 °C保存。
5. 为 V. cholerae 准备经滤膜除菌的2 mM CaCl₂ 溶液，或为 E. coli 高压灭菌ddH₂O，并于4 °C保存。

2. 电转感受态细菌的培养（第2天上午）

1. 将100 μl过夜培养的细菌培养物接种至每块LB琼脂平板上；也可使用冻存的甘油菌种，并直接将其接种到平板上。
2. 将L形细胞涂布棒浸入100%乙醇中，短暂沥干后灼烧以去除残留乙醇，从而在使用前对涂布棒进行灭菌。用无菌的玻璃涂布棒将100 μl过夜培养的细菌培养物均匀涂布，注意避免破坏（划破）琼脂表面。
3. 将平板在37 °C下培养4–6小时，或直至出现可辨识的薄层细菌菌苔。细胞在活跃生长期时最具感受态。

3. 电转感受态细菌细胞的制备（第2天，下午）

1. 用无菌接种环收集细菌，注意不要刺破或损坏琼脂表面。一个直径为2 mm的细菌团块足以用于一次转化。通常需要将接种环在薄菌苔表面刮取两到三次。可从同一块平板上收集多个样品（通常为4至6个）。
2. 将细菌团块重悬于1 ml预冷的2 mM CaCl₂溶液（用于V. cholerae）或无菌ddH₂O（用于E. coli）中，充分混匀直至无可见团块，并置于冰上保存。
3. 将每份细菌悬液在预冷至4 °C的冷冻微量离心机中，或在放置于4 °C冷室内的微量离心机中，以5,000 × g离心5分钟。
4. 弃去上清液，将菌体沉淀用相同体积的预冷2 mM CaCl₂溶液或无菌ddH₂O重悬，重复离心步骤，共洗涤三次。
5. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬后，再用40 μl预冷的2 mM CaCl₂溶液或无菌ddH₂O充分混匀分散，并置于冰上保存。

4. 电转感受态细菌的转化（第2天，下午）

1. 将最多1 μg的质粒DNA（溶于最多1 μl的水或Tris-EDTA缓冲液中）加入40 μl细菌悬液，混匀后转移至预冷的无菌0.2 cm电击杯中。DNA样品中的盐浓度必须较低^a，否则会在下一步电击过程中导致电弧产生。
2. 将电击杯插入脉冲控制模块的电穿孔腔室中，在1.8 kV、25 μF条件下进行电穿孔。时间常数应约为5.0 msec，且不应出现电弧现象。
3. 迅速将细胞悬液转移至1 ml LB液体培养基中重悬，并转入预先高压灭菌的硼硅酸盐玻璃试管中。
4. 将细胞在37 °C、有氧培养条件（如摇床）下孵育30分钟，使其恢复生长，此阶段无需添加抗生素进行筛选。
5. 将细菌涂布于预先制备好的含相应选择剂（抗生素）的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。若细菌转化了高浓度的纯化载体（0.1–1 μg超螺旋质粒），取10 μl菌液滴加至LB琼脂平板边缘，并用无菌接种环采用四区划线法划线以获得单菌落；若转化的是连接反应混合物，则每块琼脂平板上加100 μl菌液，并用灭菌的玻璃涂布棒均匀涂布。

^a 如果时间常数较短（低于 3.5 毫秒），或脉冲过程中出现电弧现象，则需重新沉淀 DNA 样品，用 70% 乙醇洗涤两次以去除盐分，然后干燥并重新溶解于 TE 缓冲液中。

结果

我们对 E. coli 和 V. cholerae 进行了一系列转化实验，以比较我们快速方法与Dower 等²最初描述的（传统）方法在制备电转感受态细菌方面的转化效率。为进行传统的感受态细胞制备，将500 μl过夜培养的E. coli DH5α或V. cholerae O395菌液接种于2 L锥形瓶中的500 ml LB培养基中，在摇床中（37 °C，215 rpm）培养，并在OD₆₀₀达到0.5–1.0时收获菌体。将锥形瓶置于冰上冷却，然后在预冷的转子中以4,000 × g、4 °C离心10分钟。将菌体沉淀用500 ml冰预冷的2 mM CaCl₂（用于V. cholerae）或ddH₂O（用于E. coli）充分重悬，再以相同条件离心。随后在逐渐减少的体积（200 ml和100 ml）中重复重悬与离心操作，确保菌液始终维持在4 °C低温环境。最后，用10 ml含10%甘油的溶液进行一次重悬和离心。将最终沉淀重悬于2 ml 10%甘油溶液中，分装为每份40 μl，于-80 °C冻存，并在电转化前保存不超过一周。

电穿孔条件（包括脉冲参数和比色皿规格）在两种细菌的电穿孔实验中均保持一致，无论感受态细胞的制备方法如何。唯一的区别在于，E. coli 使用预冷的去离子水（ddH₂O）进行洗涤，而 V. cholerae 则使用预冷的 2 mM CaCl₂ 溶液洗涤。表 1 显示了采用相同电穿孔条件转化的细菌结果，但感受态细胞分别通过快速方案或传统方法制备。本研究中选用 O395 和 DH5α 菌株作为 V. cholerae 和 E. coli 的常用代表性菌株；其他同种菌株也可获得类似结果（尽管并非每一种菌株都经过测试），且该方法可能适用于其他革兰氏阴性菌，甚至更广泛的细菌种类。

为了确保每批电穿孔样品中含有相等数量的细胞，在快速法所制备的电转化感受态细菌收集后即进行混合，保持均匀悬浮状态，并在电穿孔前立即分装成每份40 μl。采用传统方法制备的电转化感受态细菌在冷冻前也以类似方式处理，分装为40 μl每份。电脉冲完成后，将每批40 μl的电穿孔细菌悬浮于400 μl LB培养基中，并进行10倍系列稀释。取各稀释液100 μl，接种于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，使用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，于37 °C过夜培养。为了定量每次转化所用细菌的总数，将每批制备的电转化感受态细菌各取40 μl进行系列稀释，并平行接种于不含抗生素的LB琼脂平板上。每批处理相同的细菌中另取一份，加入1 μl Tris-EDTA（TE）缓冲液（不含DNA）进行电穿孔（模拟转化），随后进行系列稀释并接种于不含抗生素的LB琼脂平板，以评估电脉冲处理导致的细胞损失数量。最后，实验还增加了一项额外变量，以确定电穿孔后在1 ml LB培养基中于37 °C孵育30分钟（接种于LB琼脂平板前）是否会影响转化细胞的恢复。次日计数菌落形成单位（CFUs）。

本实验采用pUC18这一常见的实验室质粒，以及通过传统方法制备的约含10⁸ CFUs和通过快速方案制备的约含10⁷ CFUs的感受态细菌。无论采用何种方法制备电转感受态细胞，单独电穿孔（无DNA）均使其可存活的CFUs减少10至100倍。如表1所示，在三次重复实验中（括号内为标准差），使用传统且耗时较长的方法制备电转感受态细胞时，E. coli（DH5α）和V. cholerae（O395）的转化子产量分别为每微克DNA 10⁶–10⁷ CFUs。使用快速方法时，在三次重复实验中（括号内为标准差），E. coli和V. cholerae的转化子产量分别下降约10倍，为每微克DNA 10⁵–10⁶ CFUs。因此，我们通过将转化后的CFUs数除以“模拟转化”（不含质粒）的相同批次感受态细胞中回收的CFUs数，计算出转化细菌的百分比。无论感受态细胞的制备方法或转化菌种如何，转化细菌的百分比均在一个数量级范围内（2.5–9.4%）（表1中括号内的数值）。这些结果表明，快速方法的转化效率与传统耗时方法相当，且Vibrio cholerae和Escherichia coli的代表性菌株对快速方法均具有良好的适用性。

我们发现，对于携带β-内酰胺酶盒的质粒（如pUC18），在LB肉汤中30分钟的恢复时间对转化效率没有影响。无论是在电穿孔后直接将细胞涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，还是在37 °C的LB肉汤中恢复30–45分钟后再涂布，所获得的转化子数量均相同。我们的研究结果表明，氨苄青霉素抗性不需要在非选择性条件下进行扩增培养，提示β-内酰胺酶在转化后表达速度足够快。然而需要注意的是，我们将电击后的细菌在LB肉汤中进行了系列稀释，这可能有助于细胞从电击损伤中恢复，并启动基因表达。

图 1. 快速制备电转化感受态细菌方法的图示。 接种后 4–6 小时（取决于接种物密度），可从单个 LB 琼脂平板收集到足够数量的细菌，用于进行四至六次转化实验。为确保每次电转化所用感受态细胞数量相等，将从 LB 琼脂平板收集的细菌首先合并、共同洗涤，然后根据菌体沉淀的大小，分装为 40 μl 的等份体积（较大的沉淀用可被 40 μl 整除的较大体积稀释）。

每微克 DNA 的氨苄青霉素抗性转化子数（回收的氨苄青霉素抗性转化子 [%]）
菌株	传统方法	快速方法
E. coli (DH5α)	2.3 x 106 (± 7.3 x 105) [9.4%]	3 x 106 (± 7.1 x 105) [2.5%]
V. cholerae (O395)	4 x 107 (± 1.7 x 107) [5%]	6.7 x 105 (± 2.1 x 105) [3.3%]

表1. 采用传统方法与快速方法制备的电转感受态细菌每微克DNA（pUC18）的转化效率。

所有转化实验均使用500 ng pUC18 DNA（通过1%琼脂糖凝胶电泳观察，约80%为超螺旋DNA），电穿孔后的细胞在涂布于含抗生素的LB-琼脂平板以测定CFU之前，用LB肉汤进行10倍系列稀释。每次转化实验均设置未进行电穿孔的细菌对照组以及未加质粒进行电穿孔的细菌对照组，这些对照组同样进行系列稀释后涂布于不含抗生素的LB琼脂平板，以确定电脉冲前后存活细菌的总数。电穿孔对照组的结果作为成功转化的存活细菌百分比的基线值。

讨论

转化效率受多种因素影响，无论采用何种方法制备感受态细胞均是如此。本方法同样受到类似变量的影响；一旦从琼脂平板上收集细胞，必须格外注意始终保持其处于恒定的低温环境（不超过 4 °C）。收集时细菌菌苔必须处于活跃生长期，细胞应处于对数生长中期。DNA 质量（即 盐类污染会影响转化效率。具体而言，采用此方法时，琼脂不应破碎，因为电转杯中的琼脂碎片会导致电脉冲产生电弧。

使用该技术时遇到的大多数问题通常与两个因素有关：一是在合适的时间窗口内从琼脂平板上收集处于活跃生长期的细菌。收集过早会导致菌体数量不足，且由于细菌在LB琼脂平板上形成的“菌膜”难以完整刮起，使操作变得困难。收集过晚则会显著降低细菌的感受态。该时间窗口自然会因接种到LB琼脂平板上的菌液浓度不同而有所变化。第二个关键步骤是从细菌从琼脂平板上刮下并重悬于CaCl₂或ddH₂O的那一刻起，直至转化后涂布到LB琼脂平板为止，始终保持细菌处于低温环境（4 °C）。含有细菌的微量离心管、电转杯和缓冲液均应预先冷却，并始终置于冰上，直到细菌被涂布。然而，若无菌ddH₂O或CaCl₂中含有沉淀物或受到污染，也可能引发额外问题。因此，我们建议新鲜配制该试剂。

通过设置对照可以方便地对转化过程进行故障排查，即在对任何方法制备的感受态细菌进行转化时都应包含对照。阴性对照为一组未经转化的感受态细菌，将其涂布于含有选择性标记物的LB琼脂平板上，可快速判断平板中的抗生素是否有效。阳性对照则使用已知质量良好且含量充足的质粒进行转化，该质粒携带与实验样品相同的选择性标记物，有助于判断细菌是否具备感受态，同时也能评估实验所用DNA在数量或质量上是否足以完成转化。

该技术具有多重优势：可在计划进行转化的当天完成操作。我们发现，冷冻的细菌甘油菌种可直接涂布于LB琼脂平板上，而不会影响电转化效率；我们在“紧急情况”下（例如前一日忘记接种过夜培养物）已成功采用此方法。尽管我们无法测试所有已知菌株，但凡可通过电穿孔法转化的 E. coli 或 V. cholerae 菌株，我们均能成功应用本方案。该方法快速、高效，所获得的转化效率与传统方法制备的感受态细菌相当。本技术省去了对高速离心机及其转子、摇床培养箱、无菌离心桶（容器）以及大量高压灭菌缓冲液的需求。尽管特定试剂与设备列表较为全面，但大多数开展电穿孔实验的实验室通常已具备其中大部分甚至全部材料。或许最重要的是，该技术可便捷地用于快速制备具有特定突变背景的实验室专属菌株的感受态细胞。据我们所知，该技术目前尚无明确局限性，已在我们的实验室中完全取代了传统制备电感受态细菌的方法。

本文所示实验结果采用传统方法制备的新鲜电转感受态细胞获得，这些细胞在-80 °C保存不超过1周。然而，冷冻保存的感受态细胞在长期储存过程中会逐渐丧失感受态或活力。我们简化的实验方案可在计划进行转化的当天制备新鲜的电转感受态细胞，无需担忧细胞库存放时间过长可能导致转化子产量下降的问题。我们未尝试将采用快速方法制备的感受态细胞冷冻保存以供后续使用，因为这在实际操作中并无必要。

虽然此处未展示，但使用本快速方法制备的电转感受态细胞对连接混合物的转化效率已足够。所报道的非O1型菌株的转化实验 V. cholerae 在Unterweger近期发表的一篇文章中 等¹⁷ 采用此处所述方法制备的电转感受态细菌进行转化实验（接合转化除外）。该技术使研究人员能够快速、高效地对具有突变背景的菌株进行转化，而无需大量培养细胞。这种快速制备电转感受态细菌的方法可适用于其他已证实可进行电穿孔的原核生物，因其制备原理和电穿孔参数设置与传统方案相同。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基因脉冲模块	Bio-Rad	165-2668
基因脉冲电穿孔室	Bio-Rad	165-2669
电穿孔杯（0.2 cm 间隙）	Bio-Rad	165-2082
13 x 100 mm 无边 Pyrex 培养管	Corning	70820-13
13 mm 培养管封口盖	Cole Parmer	EW-04500-00
6 x 250 mm 玻璃棒	Lab Source	11381D
一次性培养皿	Fisher Scientific	08-757-12
滚筒式摇床电机组件	New Brunswick Scientific	M1053-4004
适用于 13 x 100 mm 培养管的滚筒	New Brunswick Scientific	M1053-0306
氯化钙	Sigma Chemicals	C5670
乙醇，无水/变性	Sigma Chemicals	227649
接种环	Decon Labs	MP182-5
制冷微量离心机 5451 R	Eppendorf	22621425
本生灯	Fisher Scientific	03-917Q
LB 肉汤 MILLER	EMD	1.10285.0500
细菌学琼脂	Fisher Scientific	S25127