一个 体外 成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

摘要

我们展示了一种用于直接研究肠神经系统中神经元和胶质细胞组分的细胞培养方案。该方法通过取自成年小鼠肌间神经丛的神经元/胶质细胞混合培养，在盖玻片上建立培养体系，从而能够利用电生理学、免疫组织化学等方法对单个神经元和胶质细胞的功能进行检测。 等等.

摘要

肠神经系统是一个贯穿整个胃肠道的庞大神经元和胶质细胞网络，功能上调控胃肠道的运动。本文描述了一种从肌间神经丛中分离并培养混合神经元和胶质细胞群体的方法。原代培养物可维持超过7天，期间神经元与胶质细胞之间可形成连接。从小鼠回肠或结肠中剥离带有附着肌间神经丛的纵行肌条，将其从下方的环形肌层上分离，并进行酶消化处理。在无菌条件下，通过离心后将分离出的神经元和胶质细胞群体保留在沉淀中，并接种于盖玻片上。24至48小时内出现神经突起的生长，可通过泛神经元标记物鉴定神经元。培养两天后，通过膜片钳实验可观察到分离的神经元产生动作电位。此外，肠胶质细胞可通过GFAP染色进行鉴定。在5至7天内，神经元和胶质细胞可形成紧密相邻的网络结构。可利用免疫组织化学、电生理学、钙成像和单细胞PCR等方法对肠神经元进行个体化和直接研究。此外，该方法也可应用于基因修饰动物。该技术操作简便且成本低廉。总体而言，本方案以易于操控的方式暴露肠神经系统各组分，有助于我们更深入地了解肠神经系统在正常和疾病状态下的功能。

引言

肠神经系统（ENS）是一个庞大的神经和神经胶质细胞网络，贯穿整个胃肠道（GI）的全长。ENS 在功能上调控消化的所有方面，包括蠕动、液体吸收/分泌以及对刺激的感觉， 等等 （详见综述） ¹它包含超过5亿个神经元，数量多于脊髓中的神经元，并含有大脑中存在的所有神经递质类别。此外，肠神经系统（ENS）的独特之处在于，它可以在无需中枢神经系统输入的情况下进行反射性功能活动。 ²了解肠神经系统（ENS）不仅对于理解其正常的生理功能至关重要，而且对于认识其在多种神经病变中的作用也具有重要意义，这些病变可能为先天性的（如先天性巨结肠）、获得性的（如恰加斯病）、继发于疾病状态的（如糖尿病性胃轻瘫）、药物诱导的（如阿片类药物所致肠功能障碍）或由损伤引起的（如术后麻痹性肠梗阻）。 ¹此外，肠神经元可成为病毒感染（如水痘-带状疱疹病毒）的储存库³由于肠道与大脑具有相似性，且肠道内血清素水平较高，因此用于治疗中枢神经系统疾病的药物常常对肠神经系统产生意想不到的副作用 ²值得注意的是，许多神经病变，如阿尔茨海默病和帕金森病，在中枢神经元出现病变之前很久，其肠神经元已表现出类似的细胞改变，这使得肠神经系统（ENS）成为研究这些疾病发病机制的可及模型。 ⁴因此，深入理解肠神经系统对于认识疾病状态以及预防和预测药物副作用至关重要。

传统上，肠神经系统（ENS....

方案

所有动物护理和实验程序均符合弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会的规定，并经其批准。

1. 在24孔板中制备无菌的多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片

1. 第1步的所有操作均需在无菌条件下进行，即在通风橱内使用无菌试剂操作。玻璃盖玻片和双蒸水（ddH₂O）₂O）应预先灭菌。培养板的制备可在神经元分离前两周内完成。
2. 在超净工作台内，使用无菌镊子将经高压灭菌的玻璃盖玻片放入24孔板的12个孔中。
3. 提前配制多聚-D-赖氨酸储备液。将5 mg多聚-D-赖氨酸加入50 ml无菌ddH2O中，涡旋混匀，分装为每份3 ml，于-20 °C保存。使用前解冻。
4. 最终浓度为每25 cm²使用1 ml聚-D-赖氨酸储备液²：将80 μl聚-D-赖氨酸原液滴加到每个玻璃盖玻片（2 cm）上²静置溶液10分钟。
5. 用真空泵去除聚-D-赖氨酸，并用无菌ddH₂O将盖玻片冲洗3次₂O.
6. 在通风橱中让平板干燥至少2小时。
7. 平板可在进行层粘连蛋白包被前于 4 °C 或 -20 °C 保存。
8. 提前准备层粘连蛋白（laminin）储备液。将层粘连蛋白置于冰上解冻，并在使用过程中始终保持在冰上。将其稀释至浓度为50 μg/ml；注意不同批次的浓度差异；每批浓度均....

结果

在分离LMMP来源的细胞后，神经元及其他细胞类型尚不明显。可见存活的圆形细胞，其表型不明确，同时存在未完全消化的组织碎片和结缔组织产生的组织碎屑。这些碎片无需担心，大部分将在两天后的首次换液时被清除。在此之前切勿尝试清洁玻片，否则会同时去除健康且有活力的细胞。

培养一天后，神经元将开始出现 neurite 外延生长。此时神经元的特异性鉴定可能仍不明确。只要细胞已足够贴壁，能够转移至实验腔室，则培养一天后即可用于电生理学研究。然而，细胞在培养两天后贴壁更牢固，更适合进行功能研究（如电生理学、钙成像），最佳时间为培养后的第 2 至 5 天左右。

培养约一周后，神经元的形态特征变得明显（图1）。约十天后可观察到理想的免疫细胞化学特征，此时神经元具有较长的突起，并以近乎“神经节样”的方式生长，其间散布着胶质细胞（图2）。该染色结果提示，利用此方法可能有助于研究这些细胞之间的突触相互作用。

培养一天后，神经元可通过.......

讨论

使用的动物

本方案已针对Swiss Webster小鼠进行了优化。然而，该方法也可轻松适用于其他小型哺乳动物（如大鼠）以及其他品系的小鼠。我们已成功使用C57小鼠和μ-阿片受体基因敲除小鼠进行了初步分离。但是，由于胃肠道形态存在差异，其他小鼠品系可能会出现操作困难。此外，不同小鼠品系（如C57Bl/6与Balb/c）在LMMP制备中的神经回路已知存在差异¹³，这可能影响最终分离所得神经元的组成比例。另外，在使用本方法时应考虑年龄因素，因为肌间神经丛中存在与年龄相关的神经元丢失现象，主要影响胆碱能神经元及其相应的胶质细胞，这种变化最早可在12月龄时观察到¹⁴。最后，当将本方案应用于其他动物物种时，需特别注意确保肌间神经丛随纵行肌层被完整剥离，而非残留于环形肌层上。

使用的组织

使用本方案可从回肠和结肠中分别培养神经元和胶质细胞。由于回肠可获取的组织量较多，且其纵行肌层较易与较厚的环形肌层分离，因此回肠组织的分离操作更为简便。在进行膜片钳记录或.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Fisherbrand 细胞培养盖玻片（12 mm 直径）	Fisher Scientific	12-545-82
Poly-D-lysine	Sigma	P6407- 5 mg
24孔细胞培养板	CELLTREAT	229124	可使用任意品牌
Laminin	BD Biosciences	354 232
ddH2O			可在实验室配制
15 ml 无菌离心管	Greiner Bio-one	188261	可使用任意品牌
50 ml 无菌离心管	Greiner Bio-one	227261	可使用任意品牌
NaCl	Fisher BioReagents	BP358-212	MW 58.44
KCl	Fisher BioReagents	BP366-500	MW 74.55
NaH2PO4 .2H2O	Fisher Chemicals	S369-3	MW 137.99
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506-500G	MW 120.4
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014-5KG	MW 84.01
葡萄糖	Fisher Chemicals	D16-1	MW 180.16
CaCl22H2O	Sigma Aldrich	C5080-500G	MW 147.02
F12 培养基	Gibco	11330
胎牛血清	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	可使用任意品牌
抗生素/抗真菌素 100倍液	Gibco	15240-062
Neurobasal A 培养基	Gibco	10888
200 mM L-谷氨酰胺	Gibco	25030164
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）	Neuromics	PR27022
尖头解剖剪刀	Fisher Scientific	8940	可使用任意品牌
解剖组织镊	Fisher Scientific	13-812-41	可使用任意品牌
棉签	Fisher Scientific	23-400-101	可使用任意品牌
250 ml 刻度玻璃烧杯	Fisher Scientific	FB-100-250	可使用任意品牌
2 L 玻璃锥形瓶	Fisher Scientific	FB-500-2000	可使用任意品牌
塑料棒（儿童画笔）	Crayola	05 3516	可使用任意品牌
Carbogen	Airgas	UN 3156	5% CO2
10 ml 鲁尔锁注射器	Becton Dickinson	309604	可使用任意品牌
21 G × 1 1/2 英寸皮下注射针头	Becton Dickinson	305167	可使用任意品牌
胶原酶 II 型	Worthington	LS004174
牛血清白蛋白	American Bioanalytical	AB00440
2 ml 微量离心管（Eppendorf 管）	Fisher Scientific	13-864-252	可使用任意品牌
Nitrex 网筛 500 µM	Elko Filtering Co	100560	可使用任意品牌
移液器套装	Fisher Scientific	21-377-328	可使用任意品牌
磨刀石	Fisher Scientific	NC9681212	可使用任意品牌
设备
LabGard ES 425 生物安全柜（细胞培养罩）	Nuaire	NU-425-400	可使用任意品牌
10 L 摇动水浴锅	Edvotek	5027	可使用任意品牌
微量离心机 5417R	Eppendorf	5417R	可使用带尺寸适配器的单一大型离心机
Allegra 6 系列离心机	Beckman Coulter	366816	可使用任意品牌
HuluMixer 样品混合器	Invitrogen	15920D
AutoFlow 水套式 CO2 培养箱	Nuiare	NU-4750	可使用任意品牌
分析天平	Mettler Toledo	XS104	可使用任意品牌