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利用共聚焦光片显微镜对整只小鼠大脑进行微米级分辨率光学断层成像

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DOI：

10.3791/50696

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2013年10月8日

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1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), 2Integrated Research Centre, University Campus Bio-medico of Rome, 3DAEMI, University of Cassino, 4National Institute of Optics (CNR-INO), 5Allen Institute for Brain Science, 6Department of Physics, University of Florence, 7ICON Foundation, Sesto Fiorentino, Italy

本文内容

摘要

本文中，我们详细描述了以高分辨率重建荧光标记小鼠大脑精细脑解剖结构的完整实验流程。所述方案包括样本制备与透明化处理、成像用样本的装载、数据后处理以及多尺度可视化。

摘要

在单细胞分辨率下解析哺乳动物大脑的结构是神经科学领域的关键问题之一。然而，对全脑范围内的神经元胞体及其投射进行系统性成像与数据管理，目前在成像技术和数据处理方面仍面临巨大挑战。实际上，需要在合理的时间内以高分辨率和高对比度对宏观体积样本进行重建，由此产生的数据量可达太字节（TeraByte）级别。我们近期展示了一种光学成像方法（共聚焦光片显微术，CLSM），能够实现对表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的完整小鼠大脑进行微米级分辨率的三维重建。CLSM结合了光片照明与共聚焦检测技术，可在宏观尺度的透明化样本中实现高对比度、高速度的深层成像。本文详细描述了获取完整且便于人工解读的荧光蛋白标记小鼠全脑图像的完整实验流程，包括组织透明化与封片操作，以及通过采集大量平行相邻图像堆栈对全脑进行光学断层扫描的具体步骤。我们展示了如何使用开源的定制软件工具，实现多个图像堆栈的拼接以及多分辨率数据的浏览导航。最后，我们展示了若干脑图谱实例：来自L7-GFP转基因小鼠的小脑图像，其中所有浦肯野细胞均被特异性标记；以及来自thy1-GFP-M小鼠的全脑图像，其特征为稀疏且随机的神经元标记模式。

引言

与我们对大脑功能分子和细胞机制的理解相比，对精细神经解剖学的认识仍处于初级阶段1。事实上，目前仍缺乏关于神经元胞体位置或全脑长程投射的系统性图谱。目前已有许多技术致力于以显微分辨率重建小鼠大脑。基于对树脂包埋样品进行连续切片的光学方法，如刀锋扫描显微镜技术（Knife-Edge Scanning Microscopy, KESM）2、微光学切片层析成像（Micro-Optical Sectioning Tomography, MOST）3以及荧光-MOST（fluorescence-MOST, fMOST）4，能够实现对完整小鼠大脑的亚微米级三维分辨率成像。然而，单个样本的制备与成像所需总时间长达数周，限制了这些方法的实际应用。另一种基于连续切片（但无需树脂包埋）的技术——连续双光子断层成像（Serial Two-Photon Tomography, STP）5，也可实现高三维分辨率成像。然而，该技术在全脑小鼠成像中仅实现了极稀疏采样，每50 μm采集一个切片5，据我们所知，STP尚未实现对小鼠大脑的全采样重建。

一种前沿的光学方法——光片显微镜6，能够以高速对完整样本进行三维重建。在这种光学构型中，样本被一束薄薄的光片照射，荧光发射则沿垂直于照明平面的轴向被采集。通过这种方式，仅激发处于焦平面上的荧光分子，从而可在宽场配置下实现光学切片，保证高帧率成像。当与基于用水折射率匹配液体替代水的透明化方案相结合时7，光片显微镜已被应用于宏观样本，例如完整的小鼠脑组织8。然而，即使经过透明化处理的样本，仍会受到样本自身引起的光散射影响，导致光片退化，从而激发离焦平面的荧光分子，使所获取的图像整体出现模糊。

为了选择性地仅收集聚焦的光子，我们最近将光片照明与共聚焦检测方案相结合9。在共聚焦光片显微镜（CLSM）中，离焦和散射的光子在检测前被线性空间滤波器（狭缝）所抑制（图1）。为了在光片显微结构中实现共聚焦操作，照明通过扫描线的方式产生，而检测光路中的去扫描系统在狭缝位置形成激发扫描线的静态图像。第三个扫描系统在相机传感器上重建二维图像。与传统的光片显微镜相比，CLSM在透明化的小鼠脑组织中实现了100%的对比度提升，同时保持了10 Hz的帧率。利用CLSM，可以以XY方向2 μm、Z方向9 μm的分辨率重建完整的小鼠脑组织，并具有足够的对比度以分辨单个荧光标记的神经元。

本文介绍了一种利用共聚焦光片显微镜（CLSM）重建小鼠大脑的实验流程。经醛类固定的鼠脑样本使用不含过氧化物的四氢呋喃进行梯度脱水，随后在不含过氧化物的二苄基醚中进行透明化处理（图2），该步骤遵循Becker et al.10 所建立的方案。透明化后的样本被小心地安装在倾斜的载板上，并置于定制的共聚焦光片显微镜的成像腔内。样本可直接插入载板的尖端进行固定（图3a）；也可将其粘附于透明化的琼脂糖凝胶圆盘上（图3b），或放置于由透明化琼脂糖凝胶制成的烧杯形腔体中（图3c）。随后对整个脑组织进行光学断层扫描，通过采集多个平行且相邻的图像堆栈以覆盖全脑体积（图4）。预先进行的断层采样可生成样本位置与形态的粗略图谱，确保成像仅在样本所占据的体积内进行。所得的断层图像堆栈随后由定制软件拼接，并以多分辨率层级结构保存11。最终，小鼠大脑可通过原型化的、类似谷歌地图的多分辨率可视化软件进行浏览。上述两种软件工具均已作为插件集成于开源平台Vaa3D12中。

最后，我们展示了小鼠大脑的代表性图像，以证明所述实验流程在研究精细的小鼠神经解剖结构方面的应用能力。

方案

1. 组织制备与保存

  1. 通过标准的心脏灌注法13固定小鼠脑组织：先使用20 ml 0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，随后使用100 ml含4%多聚甲醛的0.01 M PBS溶液。务必将两种溶液的pH值精确调节至7.6：pH值略低可能会淬灭EGFP的荧光信号。
  2. 将取出的脑组织在含4%多聚甲醛的溶液中于4 °C条件下后固定过夜。
  3. 用0.01 M PBS溶液漂洗两次，每次30分钟，然后在4 °C条件下保存于0.01 M PBS中。

2. 脱水与透明

注意：脱水和透明化步骤的方案 closely follows Becker et al.10 所描述的方法。

  1. 为了去除脱水溶剂（四氢呋喃，THF）中的过氧化物（过氧化物会强烈淬灭XFP荧光），使用色谱柱以碱性活化氧化铝（Brockman I级活性，约250 g/L THF）过滤THF。避免色谱柱开裂，否则会降低过氧化物的去除效率。
  2. 即使THF在过滤前已含有稳定剂，仍需在最终溶液中添加稳定剂（丁基化羟基甲苯，250 mg/L）。事实上，氧化铝会吸附稳定剂；不含稳定剂的THF可能生成大量过氧化物，具有爆炸性和危险性。
  3. 将完整小鼠脑组织置于纯水中逐步梯度脱水：50%、70%、80%、90%、96%、100%、每步1小时，最后100% THF过夜。将装有样品的瓶子置于旋转摇床上。为避免光照，用铝箔包裹瓶子。
  4. 使用玻璃漏斗，以氧化铝（碱性活化，Brockman I级活性，约250 g/L DBE）过滤透明溶剂（二苄基醚，DBE）。
  5. 用100% DBE对样品进行透明处理。分别在3小时和6小时后更换溶液。

3. 样品固定

  1. 当大脑在肉眼观察下呈现透明状态时（通常在第二次更换DBE后约1小时），采用以下方法之一将其固定在倾斜的成像板上：
    1. 直接固定法 —— 将样品轻轻插入成像板的尖端之一（图3a）。
    2. 琼脂糖圆盘法 —— 将由6%琼脂糖凝胶制成的圆盘插入尖端。用丙烯酸胶将样品轻轻固定在琼脂糖圆盘上（图3b），静置约1分钟使其固化。
    3. 琼脂糖烧杯法 —— 将由3%琼脂糖凝胶制成的烧杯状结构插入尖端。将样品轻轻放置于该烧杯底部（图3c）。

注意 1：当需要对样本整体进行成像时，应优先选择将样本置于琼脂糖烧杯中固定；然而，包围样本的琼脂糖凝胶会增加光散射，可能对图像质量产生不利影响。如果允许在成像时排除样本的一小部分，则更适合将样本固定在琼脂糖圆盘上或直接固定在探头尖端。前一种方法适用于保持脑组织水平方向（排除脑腹侧或背侧部分的成像），后一种方法适用于保持脑组织垂直方向（排除嗅球或脊髓部分的成像）。

注意 2：琼脂糖凝胶应使用水制备，然后用 THF 脱水（50% 和 100% 各 4 小时），再在 DBE 100% 中透明处理 4 小时或直至其完全透明可见。

  1. 采用前述方法之一固定样本后，使用镊子将成像板放入样本室中，并向样本室中加入透明化溶液。

4. 断层扫描制备

  1. 移除狭缝以收集尽可能多的荧光信号。
  2. 使用低激光功率照射样品，以防止光漂白。
  3. 通过软件驱动的微定位系统在三个方向上移动样品。针对每个方向，确定样品被照射且位于相机视野范围内的最小和最大坐标（图4a）。
  4. 将上述坐标作为“预断层扫描”子程序的参数输入。同时设定断层扫描中相邻层之间的距离，以及预断层扫描在 z 方向的采样步长。
  5. 启动预断层扫描，该过程将按照步骤（4.4）中指定的 z 采样间隔采集每层的图像。

注意：所采集的图像由软件用于生成样本形状和位置的粗略图（图4b），从而可将断层扫描采集范围限制在样本实际占据的体积内，减少成像时间，进而降低光漂白效应。

5. 断层扫描采集

  1. 使用微定位系统将样品移出光片范围。
  2. 增加激光功率，并停止所有扫描系统的运动，以便仅照亮视场中心的一条固定直线。
  3. 安装狭缝并利用透明溶液的自发荧光信号进行对准。此时应在视场中心清晰看到狭缝形成的亮线。
  4. 重新启动扫描系统，降低激光功率，并使用微定位系统将样品移回光片内。注意，使用狭缝时所需的激光功率将高于未使用狭缝时，因为空间滤光器会阻挡相当一部分光。
  5. 通过控制软件调节扫描与去扫描系统的振幅和偏移，直至图像清晰明亮。
  6. 设置合适的z轴步进距离后，运行断层成像采集软件。样品体积将被采集为多个平行且部分重叠的图像堆栈（图5a），图像将保存在分层的文件夹结构中。

6. 缝合与可视化

  1. 使用自动化软件，用合成的黑色图像（即与采集图像类型和尺寸相同但强度为零的图像）补全所获取的体积数据（即，填补缺失部分）（图4c）。此步骤是必需的，以确保拼接软件能够处理一个完整的立方体体积数据。
  2. 启动已安装 TeraStitcher 和 TeraManager 插件的 Vaa3D 软件（可从 http://www.vaa3d.org/ 免费下载）。
  3. 加载 TeraStitcher 插件。选择包含成像体积数据的目录，指定各轴的相对方向（相对于参考右手坐标系）以及体素尺寸。
  4. 运行拼接的第一部分。软件将计算各图像堆栈对之间的相对位移，并共同确定所有堆栈的整体最优排列位置（图5b）。
  5. 选择以单分辨率或多分辨率格式保存拼接后的体积数据。后者可支持通过 TeraManager 插件进行多分辨率可视化。在这两种情况下，若高分辨率图像超过数吉字节（GB），还应选择多堆栈保存模式，并指定各个子堆栈的尺寸，以便高效访问存储的数据。
  6. 运行拼接的第二部分。软件将合并已对齐的堆栈，并以单堆栈或多堆栈模式保存（图5c 和 5d）。完成后关闭 TeraStitcher 插件。
  7. 加载 TeraManager 插件。选择包含多堆栈多分辨率体积数据的文件夹，并指定体素尺寸和坐标轴方向。体积数据将以最低分辨率加载。
  8. 如需放大至更高分辨率，可在 Vaa3D 中使用右键点击方式选择一个标记点，然后通过鼠标滚轮放大。或者，您也可直接右键选择要放大的感兴趣区域（ROI），或指定感兴趣体积的坐标。
  9. 如需返回较低分辨率，只需使用鼠标滚轮即可。

结果

所述方案可用于重建整只小鼠大脑或其切除部分，且无需进行物理切片，即可实现微米级分辨率的成像。作为代表性结果，图6展示了出生后第10天的L7-GFP小鼠的完整小脑。在此动物模型中，所有浦肯野神经元均被EGFP标记。当放大观察时，可清晰看到小脑皮层典型的层状结构（图7）。进一步放大后，每个浦肯野细胞的胞体均可被明确区分（图8）。因此，该方案可用于多种神经发育研究中神经元空间分布特征的筛查。

作为第二个代表性结果，我们展示了成年thy1-GFP-M小鼠未切片脑组织的图像。在这种转基因动物中，EGFP在随机稀疏的神经元亚群中表达。图9显示了脑组织的右半部分。随着我们逐步放大（图10和图11），神经元的突起结构变得可分辨。该结果表明，本研究所描述的方案能够实现对完整成年小鼠脑组织的微米级分辨率成像，为在神经退行性疾病小鼠模型中以细胞分辨率研究全脑解剖结构提供了可能。

光学装置示意图；488 nm 激光激发的光路顶视图和侧视图。
图1. 共聚焦光片显微镜（CLSM）的光学方案。 (a) 装置的顶视图，显示激发光路。来自488 nm半导体泵浦固体（DPSS）激光器的激光经第一组望远镜扩束准直后，进入声光可调滤波器（AOTF），由其调节光束强度。随后，第二组望远镜进一步扩展光束。一个振镜在垂直方向（沿y轴）扫描光束，再由样品室内的透镜将其聚焦。(b) 装置的侧视图，显示检测光路。检测物镜收集的光经振镜垂直去扫描，并由透镜聚焦，在像平面上形成激发线扫描运动的固定像。在该固定像位置处放置一条线性空间滤波器（狭缝）。狭缝之后，置于4f透镜系统内部的振镜将二维图像重建于电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）芯片上。荧光带通滤光片在探测前滤除所有激发杂散光。激发光、检测光及经带通滤波后的检测光分别以蓝色、浅蓝色和绿色光线表示。图中标注了显微镜中所有实际使用透镜的焦距。 点击此处查看高清大图。

血管透明化试剂示意图；实验设置中 PBS、THF、DBE 溶剂的比较
图 2. 样本透明化。 经甲醛固定后保存在 4 °C 条件下 0.1 M PBS 中的小鼠脑组织 (a)，使用梯度浓度的四氢呋喃（THF，b）进行脱水，随后在 100% 二苄基醚（DBE，c）中实现透明化。脱水步骤同时会导致一定程度的组织收缩。

大脑固定过程示意图，包含步骤：a) 定位，b) 稳定，c) 封闭环境。
图3. 用于共聚焦激光扫描显微镜成像的样本安装。 透明化后的大脑可直接倒置安装在载片上 (a)，粘附于一片透明的琼脂糖圆盘上 (b)，或置入一个透明的琼脂糖烧杯中 (c)。

三维重建过程示意图；包含用于分析的矢量轴和体素分割。
图4. 断层扫描采集。 扫描前的常规操作会选取一个包含大脑的平行六面体区域(a)，以确定所需成像的相邻平行堆栈的数量和长度，从而覆盖整个样本(b)。断层扫描完成后，生成黑色图像以补全虚拟采集体积，使其形成一个完整的平行六面体(c)。

立方体内部结构的三维空间排列示意图，突出显示缩放差异。
图5. 体积拼接。 采集的图像堆栈之间部分重叠 (a)，可通过TeraStitcher插件实现精确对齐 (b)。该插件随后将对齐后的堆栈合并为单堆栈 (c) 或多堆栈 (d) 的多分辨率表示形式。

分段蠕虫解剖结构的显微图像；肌肉结构与功能的生物学研究。
图6. P10 L7-GFP 小鼠的完整小脑，其中所有浦肯野神经元均用 EGFP 标记。 比例尺，1 mm。

脑组织结构的荧光显微镜图像，展示细胞排列。
图7. 图6所示小脑部分区域的放大图像，显示小脑皮层典型的层状结构。 比例尺，500 μm。

显示细胞结构和生长模式分析的根细胞荧光显微图像。
图 8. 图 6 中所示小脑部分的进一步放大。 可清晰分辨浦肯野细胞的胞体。比例尺，200 μm。

显示脑组织中蛋白质分布及光谱分析潜力的荧光显微镜图像。
图9. 来自成年thy1-GFP-M小鼠的右半脑，其特征为稀疏的非特异性神经元EGFP标记。 比例尺，1 mm。

神经元网络荧光、显微图像、脑组织中神经通路的可视化。
图10. 图9所示半脑局部区域的放大图像，显示部分海马体和皮层结构。 比例尺，200 μm。

神经网络荧光显微镜；神经成像，可视化突触连接。
图11. 图9所示半脑局部区域的进一步放大。 皮层中的多条神经突可被清晰分辨。比例尺，50 μm。

讨论

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合化学透明化技术，是研究经荧光探针（包括蛋白质或合成染料）标记的完整小鼠脑神经解剖结构的有力工具。由于来自焦平面以外区域的发射光被物理空间滤光片阻断，因此即使在较厚的样本中也能实现高对比度成像，同时保持光片显微镜架构特有的高帧率。

使用所述方法时需要解决的主要问题是提高对比度。事实上，可获得的信号会受到化学和光学因素的共同影响而减弱。从化学角度来看，基于有机溶剂的透明化处理可能会淬灭荧光蛋白及其他荧光染料的发射信号7。如Becker et al.10所述，通过过滤溶剂以去除过氧化物，可在溶剂透明化组织中保持较高的荧光水平。已发表的基于水的透明化方法14不会降低荧光效率，但在处理完整的小鼠脑组织时，至少在使用线性光学技术的情况下，透明度较差。

另一方面，目前尚无针对高折射率（n ≈ 1.56）透明溶液校正且具有长工作距离的商用物镜。因此，样品所处介质的折射率与物镜设计折射率之间的失配会导致严重的球面像差。这类像差不仅会降低显微镜的分辨率，还会导致图像强度和对比度下降，因为光线被扩散到更大的区域。针对这一问题可能的解决方案包括使用自适应光学系统15和/或静态非球面校正器。

图像对比度和强度的任何提升都会直接影响成像速度，因为可以选用更短的单幅图像积分时间。目前，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的成像速度约为106 μm3/秒，相机曝光时间为100毫秒9。以该速度成像完整的小鼠大脑需要1至3天，具体时间取决于样品大小。尽管在如此长时间的成像过程中未观察到图像质量显著下降——这主要归因于光片照明固有的低光漂白特性6，但单个小鼠大脑成像所需的时间过长，实际上可能限制CLSM的应用。若系统效率提高10倍，并结合使用高速相机进行检测，则可将成像时间缩短至数小时，从而使本描述方案的常规应用成为可能。

尽管存在上述所有限制，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像结合组织化学透明化技术，可在不到一周的时间内以微米级分辨率重建完整的小鼠大脑。其他用于全脑成像的光学方法虽可提供比CLSM更高的分辨率，但代价是更长的制备和/或成像时间2-4，或稀疏的z轴采样5。

本文所述方法可与多种荧光标记策略联合使用：表达荧光蛋白的转基因动物，针对特定神经元亚群进行标记；病毒转染；实质内染料注射；等等。实际上，所有在动物处死后之前进行的染色策略均适用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）。事实上，迄今为止尚未实现对整只小鼠大脑进行死后荧光标记；然而，如果在未来不久此类染色方法得以实现，则可利用CLSM重建的样本数量将大幅增加，甚至可能包括人类脑组织。

总之，共聚焦光片显微镜结合组织透明化技术与多分辨率数据管理，可使研究人员以微米级分辨率重建和分析宏观样本，且所需技术手段在大多数实验室中均可实现。共聚焦光片显微镜（CLSM）的潜在应用当然不仅限于神经科学，还涵盖光片显微镜已被应用的所有研究领域，例如胚胎发生16,17和小型动物解剖学18。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

获得欧洲联盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号228334和241526的资助，推动了本研究的开展。本研究项目还获得了人类前沿科学计划研究基金（RGP0027/2009）、意大利教育、大学与研究部在“Nanomax”旗舰项目框架内的支持，以及意大利卫生部在“干细胞项目征集”框架内的支持。本研究是在由“佛罗伦萨储蓄银行基金会”支持的ICON基金会研究活动框架内完成的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液片剂Sigma-AldrichP4417_100TAB
多聚甲醛Agar ScientificR1018
无过氧化物四氢呋喃Sigma-Aldrich186562
活化氧化铝，碱性，Brockmann I型Sigma-Aldrich199443
二苄基醚Sigma-Aldrich108014
丁基化羟基甲苯Sigma-AldrichW218405
琼脂糖 III-A型，高电渗流动Sigma-AldrichA9793
丙烯酸胶BostikD2498
Vaa3D 软件开源可从 http://www.vaa3d.org/ 免费下载

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